Regulation of cargo transfer between ESCRT-0 and ESCRT-I complexes by flotillin-1 during endosomal sorting of ubiquitinated cargo

Ubiquitin-dependent sorting of membrane proteins in endosomes directs them to lysosomal degradation. In the case of receptors such as the epidermal growth factor receptor (EGFR), lysosomal degradation is important for the regulation of downstream signalling. Ubiquitinated proteins are recognised in endosomes by the endosomal sorting complexes required for transport (ESCRT) complexes, which sequentially interact with the ubiquitinated cargo. Although the role of each ESCRT complex in sorting is well established, it is not clear how the cargo is passed on from one ESCRT to the next. We here show that flotillin-1 is required for EGFR degradation, and that it interacts with the subunits of ESCRT-0 and -I complexes (hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase substrate (Hrs) and Tsg101). Flotillin-1 is required for cargo recognition and sorting by ESCRT-0/Hrs and for its interaction with Tsg101. In addition, flotillin-1 is also required for the sorting of human immunodeficiency virus 1 Gag polyprotein, which mimics ESCRT-0 complex during viral assembly. We propose that flotillin-1 functions in cargo transfer between ESCRT-0 and -I complexes

Der molekulare Mechanismus der Galektin-3-Rekrutierung in Multivesikuläre Körperchen zur polarisierten exosomalen Sekretion

Das Deckgewebe aller inneren und äußeren Körperoberflächen wird aus epithelialen Zellen gebildet, denen eine charakteristische Gliederung in einen apikalen und einen basolateralen Zelllpol gemein ist. Für den gerichteten Stofftransport und für die Integrität des Epithelgewebes ist der polare Proteintransport essenziell. Ein wesentliches Element stellen dabei Sortierrezeptoren dar, zu denen das β-Galaktosid-bindende Protein Galektin-3 gehört. Dieses Lektin sortiert und verbindet Glykoproteine in einem endosomalen Kompartiment zu hochmolekularen Clustern und dirigiert diese dadurch an den apikalen Zellpol. Neben der Lokalisation im Endosom verfügt Galektin-3 im extrazellulären Raum über eine Schlüsselrolle in bedeutenden Prozessen wie der Immunmodulation oder der Signaltransduktion. Galektin-3 hat als Modulator folglich entscheidende Einflüsse auf die Tumorprogression, insbesondere die Angiogenese, sowie die Zelladhäsion, -Motilität und -Invasion. Galektin-3 trägt in sich keine Signal-Sequenz, die für eine Einsortierung in den klassischen, sekretorischen Weg für extrazelluläre Proteine sorgen könnte und wird unabhängig von dem Endoplasmatischen Retikulum/Golgi-Apparat exportiert. Man spricht in diesem Zusammenhang auch von einer unkonventionellen Proteinsekretion. Sowohl der zugrundeliegende, biochemische Sekretionsmechanismus, der für die Sekretion von Galektin-3 verantwortlich ist, als auch die entsprechenden Sortiersignale sind bislang noch gänzlich unbekannt. In dieser Arbeit konnte Galektin-3 exklusiv im Lumen apikal sekretierter Exosomen nachgewiesen werden. Mithilfe ultrastruktureller Analysen, die einerseits auf der ultrahochauflösenden Lichtmikroskopie und andererseits auf der Elektronenmikroskopie aufbauten, konnte der Prozess der Galektin-3-Sortierung in bisher unerreichter Auflösung visualisiert werden. Dieser Prozess erfolgte an spezialisierten endosomalen Kompartimenten, den Multivesikulären Körperchen, und bestand aus der Rekrutierung, Sortierung und der Verpackung von Galektin-3 in intraluminale Vesikel. Außerdem wurden Computer-gestützte Simulationen der drei distinkten Abknospungsstadien erstellt, um die ultrastrukturellen Daten abzusichern und um die erreichte Lokalisations-Präzision zu bewerten. Für den Sortier- und Abschnürungsprozess wird ein spezieller Superkomplex benötigt, der passenderweise ESCRT-Komplex heißt (für Endosomal Sorting Complex required for Transport). Durch den Knockdown der Schlüsselkomponente Tsg101, die Verwendung eines spezifischen Inhibitors, sowie die Expression einer dominant-negativ wirkenden Mutante der AAA-ATPase Vps4a, konnte die exosomale Sekretion von Galektin-3 unterbunden werden. Dies führte in der Folge zu einer intrazellulären Akkumulation auf der begrenzenden Membran der Multivesikulären Körperchen. Durch eine in silico Gen-Analyse von 34 Wirbeltieren konnte ein hoch konserviertes Tetrapeptidmotiv PSAP im N-Terminus von Galektin-3 identifiziert werden, das zudem speziesübergreifend in bestimmten Abschnitten offensichtlich einer konvergenten Evolution unterlag. Zum ersten Mal konnte gezeigt werden, dass diese PSAP-Domäne Galektin-3 die direkte Bindung an Tsg101 ermöglicht. Durch diese direkte Interaktion werden die nachfolgende Sortierung und schließlich die exosomale Sekretion ausgelöst. Dementsprechend kann die direkte Interaktion durch die Mutation PSAP→ASAA unterbrochen werden, was zu einer erheblichen Verringerung der exosomalen Galektin-3-Sekretion führt. Bemerkenswerterweise konnte das PSAP-Sortiersignal auf das neutrale, exogen eingebrachte grün fluoreszierende Protein (GFP) übertragen werden, sodass GFP-PSAP im Gegensatz zum Wildtyp-GFP nunmehr exosomal sekretiert wurde. Der Prozess der Galektin-3-Sekretion steht damit in direkter Analogie zur viralen Freisetzung bestimmter behüllter Viren, wie z. B. dem Humanen Immundefizienz-, Ebola- und Marburg-Virus, die mithilfe der PSAP-Domäne den ESCRT-Komplex rekrutieren und direkt von der Plasmamembran abknospen können. Zusätzlich ergaben sich Hinweise auf eine mögliche funktionelle Rolle von Galektin-3 in der Sekretion von exosomalen Markerproteinen. Galektin-3 könnte somit eine neue Gruppe von endogenen Proteinen definieren, die nicht zum ESCRT-Superkomplex gehören und die durch die Markierung mit dem PSAP-Motiv exosomal sekretiert werden. Diese Arbeit konzipiert somit ein einzigartiges Modell, wie endogene Cargoproteine durch die PSAP-vermittelte direkte Interaktion mit Tsg101 für die exosomale Sekretion rekrutiert werden können. Dies eröffnet zudem neue Möglichkeiten für die polarisierte unkonventionelle Sekretion von zytoplasmatischen Proteinen, die in der Zukunft auch in der biomedizinischen Praxis Anwendung finden könnten

Multiple ITS Copies Reveal Extensive Hybridization within Rheum (Polygonaceae), a Genus That Has Undergone Rapid Radiation

During adaptive radiation events, characters can arise multiple times due to parallel evolution, but transfer of traits through hybridization provides an alternative explanation for the same character appearing in apparently non-sister lineages. The signature of hybridization can be detected in incongruence between phylogenies derived from different markers, or from the presence of two divergent versions of a nuclear marker such as ITS within one individual.In this study, we cloned and sequenced ITS regions for 30 species of the genus Rheum, and compared them with a cpDNA phylogeny. Seven species contained two divergent copies of ITS that resolved in different clades from one another in each case, indicating hybridization events too recent for concerted evolution to have homogenised the ITS sequences. Hybridization was also indicated in at least two further species via incongruence in their position between ITS and cpDNA phylogenies. None of the ITS sequences present in these nine species matched those detected in any other species, which provides tentative evidence against recent introgression as an explanation. Rheum globulosum, previously indicated by cpDNA to represent an independent origin of decumbent habit, is indicated by ITS to be part of clade of decumbent species, which acquired cpDNA of another clade via hybridization. However decumbent and glasshouse morphology are confirmed to have arisen three and two times, respectively.These findings suggested that hybridization among QTP species of Rheum has been extensive, and that a role of hybridization in diversification of Rheum requires investigation

Molekulare Studien zur Evolution der Myrmekophytie in der Gattung Macaranga (Euphorbiaceae)

Deutsche Forschungsgesellschaft DFG Fi606/4-1, DFG We1830/2-1, 4-1 and 4-

qualitative expert interviews with affected patients

In Deutschland überleben jährlich 85.000 Patienten eine schwere Sepsis oder einen septischen Schock. Physische und psychische Spätfolgen schränken die gesundheitsbezogene Lebensqualität der Betroffenen oftmals über Monate und Jahre ein. SMOOTH (Sepsis survivors Monitoring and cOordination in OutpatienT Health care) ist eine randomisiert kontrollierte Interventionsstudie, die den Effekt einer strukturierten Langzeitbegleitung für Patienten nach schwerer Sepsis evaluiert. Die Intervention umfasste Schulung und Monitoring der Patienten durch eine Case Managerin (CM) sowie eine Schulung des Hausarztes und Rückmeldung der Monitoringergebnisse an den Hausarzt durch einen Liaisonarzt. Um Wirkungsmechanismen der Intervention erfassen zu können, wurden qualitative Interviews mit Interventionspatienten durchgeführt. Die Wahrnehmung der poststationären Versorgung durch die CM (Schulung, Monitoring) sowie der hausärztlichen Versorgung wurde exploriert. Die gewonnenen Erkenntnisse sollen dazu beitragen, die Sepsisnachsorge künftig zu verbessern. Es wurden 19 qualitative leitfadengestützte semistrukturierte Interviews mit Postsepsispatienten durchgeführt, digital aufgezeichnet, transkribiert und mittels qualitativer Inhaltsanalyse nach Mayring ausgewertet. Die Begleitung durch die CM wurde überwiegend positiv bewertet. Die Patientenschulung (und das schriftliche Schulungsmaterial) sowie regelmäßiges Monitoring vermittelten einigen Betroffenen ein Gefühl von Sicherheit und ermöglichten eine hilfreiche Reflexion des eigenen Gesundheitszustandes. Teilweise konnten unterstützende koordinative Aufgaben durch die CM übernommen werden. Einige Patienten gaben an, von der Intervention nicht profitiert zu haben: Ein Teil erinnerte die Schulung nicht, eine Gruppe von Patienten lehnte tiefergehende Informationen zu ihrer Erkrankung ab, einige Patienten vermissten eine weitere, handlungsrelevante Unterstützung durch die CM. Die Betreuung durch den Hausarzt wurde überwiegend positiv erlebt, Auswirkungen der Hausarztschulung und der Rückmeldung der Monitoringergebnisse wurden von den Patienten meist nicht wahrgenommen. Ein Teil der betroffenen Sepsispatienten konnte vom Nachsorgekonzept SMOOTH profitieren. Dennoch ist zu bedenken, daß eine sepsisspezifische Schulung zu einer Aktivierung von negativen Erinnerungen der Betroffenen führen kann. III Um einer Ablehnung von Informationen entgegenzuwirken, sollte künftig eruiert werden, welche Gruppe von Erkrankten von welchen Bestandteilen der Nachsorge einen Nutzen hat. Weiterhin ist es wünschenswert, die Vernetzung zwischen CM, Liaisonarzt und Hausarzt zu stärken. Eine engere Zusammenarbeit der Akteure könnte den Patienten in einem sepsisspezifischen Nachsorgekonzept weiter unterstützen.In Germany 85 000 patients survive severe sepsis or even septic shock. However physical and psychological late sequelae diminish the quality of life for months and sometimes years. SMOOTH (Sepsis survivors Monitoring and cOordination in OutpatienT Health care) is a randomized controlled intervention study which evaluates the effect of a structured long term accompaniment after the survival of grave sepsis. Part of the supervised intervention was tutoring of the patients by an assigned case manager (CM) as well as training the attending physicians. The physicians were then notified about the results of the monitoring by a liaison doctor. Qualitative interviews were conducted to record effects of the intervention. The perception of the post – hospitalization care applied to the patient (training and monitoring) by the CM as well as the medical care of the attending physician were explored. The obtained findings should help to improve the clinical aftercare of sepsis patients in the near future. Nineteen semi - structured, digitally recorded interviews were implemented and Mayring’s qualitative content analysis used to analyze the results. The support of the CM was found to be helpful and valued by the patients. The patient training (including written education materials) as well as regular monitoring conveyed a sense of security and allowed the patient critical realistic reflection of their health condition. In some cases coordinated tasks were handled by the CM. A few patients did not profit from the interventions, some indicated not to recall the trainings, others refused to cooperate and share information about their health. Some patients would have liked to obtain more valuable information by the CM. The supervision and individual support by the attending physician was positively evaluated by the patients. Potential impacts of the physicians training course or the feedback of the post clinical monitoring were not noticed by the patients. Some patients profited from the SMOOTH clinical after care concept. However ist has to be considered that the sepsis specific training course might lead to the renewal of negative recollections of the passed traumatic incident. To prevent rejection of help and refusal of information it needs to be further evaluated for which patients and which components of SMOOTH can make a difference in the future of sepsis survivors. Furthermore, communication between CM, attending physician and liaison doctor needs to be improved. A closer collaboration between these actors could advance this sepsis specific - after care program

Psychotherapiemotivation und Inanspruchnahme des psychiatrisch-psychologischen Hilfesystems bei jungen, psychisch erkrankten Arbeitslosen

Psychische Störungen kommen bei jungen, arbeitslosen Erwachsenen häufig vor. Die Inanspruchnahme des psychiatrisch-psychologischen Hilfesystems hingegen ist gering. Motivationale Aspekte könnten relevant für die Aufnahme einer Behandlung sein. Dies wurde in der zugrunde liegenden Studie quer- und längsschnittlich in einer Stichprobe von arbeitslosen psychisch Erkrankten (16-24J.) untersucht. Es zeigten sich Zusammenhänge der Initiative und des Wissens mit bisherigen Vorbehandlungen. Ebenso erwiesen sie sich als Prädiktoren für die spätere Inanspruchnahme des psychiatrisch-psychologischen Hilfesystems. Insbesondere die Initiative sollte weiterführend untersucht werden, auch wie diese eventuell langfristig positiv beeinflusst werden könnte

Galectins in Intra- and Extracellular Vesicles

Carbohydrate-binding galectins are expressed in various tissues of multicellular organisms. They are involved in autophagy, cell migration, immune response, inflammation, intracellular transport, and signaling. In recent years, novel roles of galectin-interaction with membrane components have been characterized, which lead to the formation of vesicles with diverse functions. These vesicles are part of intracellular transport pathways, belong to the cellular degradation machinery, or can be released for cell-to-cell communication. Several characteristics of galectins in the lumen or at the membrane of newly formed vesicular structures are discussed in this review and illustrate the need to fully elucidate their contributions at the molecular and structural level

Der molekulare Mechanismus der Galektin-3-Rekrutierung in Multivesikuläre Körperchen zur polarisierten exosomalen Sekretion

Das Deckgewebe aller inneren und äußeren Körperoberflächen wird aus epithelialen Zellen gebildet, denen eine charakteristische Gliederung in einen apikalen und einen basolateralen Zelllpol gemein ist. Für den gerichteten Stofftransport und für die Integrität des Epithelgewebes ist der polare Proteintransport essenziell. Ein wesentliches Element stellen dabei Sortierrezeptoren dar, zu denen das β-Galaktosid-bindende Protein Galektin-3 gehört. Dieses Lektin sortiert und verbindet Glykoproteine in einem endosomalen Kompartiment zu hochmolekularen Clustern und dirigiert diese dadurch an den apikalen Zellpol. Neben der Lokalisation im Endosom verfügt Galektin-3 im extrazellulären Raum über eine Schlüsselrolle in bedeutenden Prozessen wie der Immunmodulation oder der Signaltransduktion. Galektin-3 hat als Modulator folglich entscheidende Einflüsse auf die Tumorprogression, insbesondere die Angiogenese, sowie die Zelladhäsion, -Motilität und -Invasion. Galektin-3 trägt in sich keine Signal-Sequenz, die für eine Einsortierung in den klassischen, sekretorischen Weg für extrazelluläre Proteine sorgen könnte und wird unabhängig von dem Endoplasmatischen Retikulum/Golgi-Apparat exportiert. Man spricht in diesem Zusammenhang auch von einer unkonventionellen Proteinsekretion. Sowohl der zugrundeliegende, biochemische Sekretionsmechanismus, der für die Sekretion von Galektin-3 verantwortlich ist, als auch die entsprechenden Sortiersignale sind bislang noch gänzlich unbekannt. In dieser Arbeit konnte Galektin-3 exklusiv im Lumen apikal sekretierter Exosomen nachgewiesen werden. Mithilfe ultrastruktureller Analysen, die einerseits auf der ultrahochauflösenden Lichtmikroskopie und andererseits auf der Elektronenmikroskopie aufbauten, konnte der Prozess der Galektin-3-Sortierung in bisher unerreichter Auflösung visualisiert werden. Dieser Prozess erfolgte an spezialisierten endosomalen Kompartimenten, den Multivesikulären Körperchen, und bestand aus der Rekrutierung, Sortierung und der Verpackung von Galektin-3 in intraluminale Vesikel. Außerdem wurden Computer-gestützte Simulationen der drei distinkten Abknospungsstadien erstellt, um die ultrastrukturellen Daten abzusichern und um die erreichte Lokalisations-Präzision zu bewerten. Für den Sortier- und Abschnürungsprozess wird ein spezieller Superkomplex benötigt, der passenderweise ESCRT-Komplex heißt (für Endosomal Sorting Complex required for Transport). Durch den Knockdown der Schlüsselkomponente Tsg101, die Verwendung eines spezifischen Inhibitors, sowie die Expression einer dominant-negativ wirkenden Mutante der AAA-ATPase Vps4a, konnte die exosomale Sekretion von Galektin-3 unterbunden werden. Dies führte in der Folge zu einer intrazellulären Akkumulation auf der begrenzenden Membran der Multivesikulären Körperchen. Durch eine in silico Gen-Analyse von 34 Wirbeltieren konnte ein hoch konserviertes Tetrapeptidmotiv PSAP im N-Terminus von Galektin-3 identifiziert werden, das zudem speziesübergreifend in bestimmten Abschnitten offensichtlich einer konvergenten Evolution unterlag. Zum ersten Mal konnte gezeigt werden, dass diese PSAP-Domäne Galektin-3 die direkte Bindung an Tsg101 ermöglicht. Durch diese direkte Interaktion werden die nachfolgende Sortierung und schließlich die exosomale Sekretion ausgelöst. Dementsprechend kann die direkte Interaktion durch die Mutation PSAP→ASAA unterbrochen werden, was zu einer erheblichen Verringerung der exosomalen Galektin-3-Sekretion führt. Bemerkenswerterweise konnte das PSAP-Sortiersignal auf das neutrale, exogen eingebrachte grün fluoreszierende Protein (GFP) übertragen werden, sodass GFP-PSAP im Gegensatz zum Wildtyp-GFP nunmehr exosomal sekretiert wurde. Der Prozess der Galektin-3-Sekretion steht damit in direkter Analogie zur viralen Freisetzung bestimmter behüllter Viren, wie z. B. dem Humanen Immundefizienz-, Ebola- und Marburg-Virus, die mithilfe der PSAP-Domäne den ESCRT-Komplex rekrutieren und direkt von der Plasmamembran abknospen können. Zusätzlich ergaben sich Hinweise auf eine mögliche funktionelle Rolle von Galektin-3 in der Sekretion von exosomalen Markerproteinen. Galektin-3 könnte somit eine neue Gruppe von endogenen Proteinen definieren, die nicht zum ESCRT-Superkomplex gehören und die durch die Markierung mit dem PSAP-Motiv exosomal sekretiert werden. Diese Arbeit konzipiert somit ein einzigartiges Modell, wie endogene Cargoproteine durch die PSAP-vermittelte direkte Interaktion mit Tsg101 für die exosomale Sekretion rekrutiert werden können. Dies eröffnet zudem neue Möglichkeiten für die polarisierte unkonventionelle Sekretion von zytoplasmatischen Proteinen, die in der Zukunft auch in der biomedizinischen Praxis Anwendung finden könnten