Replication Fork Polarity Gradients Revealed by Megabase-Sized U-Shaped Replication Timing Domains in Human Cell Lines

In higher eukaryotes, replication program specification in different cell types remains to be fully understood. We show for seven human cell lines that about half of the genome is divided in domains that display a characteristic U-shaped replication timing profile with early initiation zones at borders and late replication at centers. Significant overlap is observed between U-domains of different cell lines and also with germline replication domains exhibiting a N-shaped nucleotide compositional skew. From the demonstration that the average fork polarity is directly reflected by both the compositional skew and the derivative of the replication timing profile, we argue that the fact that this derivative displays a N-shape in U-domains sustains the existence of large-scale gradients of replication fork polarity in somatic and germline cells. Analysis of chromatin interaction (Hi-C) and chromatin marker data reveals that U-domains correspond to high-order chromatin structural units. We discuss possible models for replication origin activation within U/N-domains. The compartmentalization of the genome into replication U/N-domains provides new insights on the organization of the replication program in the human genome

Evidence for Sequential and Increasing Activation of Replication Origins along Replication Timing Gradients in the Human Genome

Genome-wide replication timing studies have suggested that mammalian chromosomes consist of megabase-scale domains of coordinated origin firing separated by large originless transition regions. Here, we report a quantitative genome-wide analysis of DNA replication kinetics in several human cell types that contradicts this view. DNA combing in HeLa cells sorted into four temporal compartments of S phase shows that replication origins are spaced at 40 kb intervals and fire as small clusters whose synchrony increases during S phase and that replication fork velocity (mean 0.7 kb/min, maximum 2.0 kb/min) remains constant and narrowly distributed through S phase. However, multi-scale analysis of a genome-wide replication timing profile shows a broad distribution of replication timing gradients with practically no regions larger than 100 kb replicating at less than 2 kb/min. Therefore, HeLa cells lack large regions of unidirectional fork progression. Temporal transition regions are replicated by sequential activation of origins at a rate that increases during S phase and replication timing gradients are set by the delay and the spacing between successive origin firings rather than by the velocity of single forks. Activation of internal origins in a specific temporal transition region is directly demonstrated by DNA combing of the IGH locus in HeLa cells. Analysis of published origin maps in HeLa cells and published replication timing and DNA combing data in several other cell types corroborate these findings, with the interesting exception of embryonic stem cells where regions of unidirectional fork progression seem more abundant. These results can be explained if origins fire independently of each other but under the control of long-range chromatin structure, or if replication forks progressing from early origins stimulate initiation in nearby unreplicated DNA. These findings shed a new light on the replication timing program of mammalian genomes and provide a general model for their replication kinetics

IDENTIFICATION ET CARACTÉRISATION DES CIBLES DE DSP1<br />CHEZ DROSOPHILA MELANOGASTER.

The Polycomb (PcG) and Trithorax (TrxG) proteins maintain the memory of preestablishedtranscription patterns by remodeling chromatin structure. In Drosophila, PcG andTrxG complexes maintain expression of their target genes via fixation to DNA sequencestermed cellular memory modules (CMMs). What are the target genes of the PcG and TrxGproteins? What are the mechanisms of recruitment of these proteins on CMMs? We tried torespond to these points. DSP1 (Dorsal Switch Protein 1) is a Drosophila HMGB (Highmobility group)-like protein, which acts as a TrxG or PcG protein depending on the locusconsidered. In the present study, we attempted to characterize DSP1 targets genes andfunctions in cellular memory. Using chromatin immunoprecipitation experiments (ChIP), weidentify several DSP1 target genes. Here we show that DSP1 binds to a sequence presentwithin the regulatory region of the Abdominal-B gene, termed Fab-7. We report, using atransgenic line for Fab-7 regulatory element, that DSP1 binding is essential for CMMactivity. We show for the first time that binding of DSP1 to Fab-7 CMM is important for therecruitment of PcG proteins. Moreover, we report that DSP1 acts as a TrxG protein inexpression maintenance of the homoeotic gene Sex combs reduced. In this case, DSP1 isessential during larval development. Lastly, we show that DSP1 is also involved in theregulation of the knirps gap gene and discuss of its function in initiation of knirps expression.Chez les organismes pluricellulaires, la prolifération, la différenciation ou encore lamort des cellules reposent en partie sur l'activation et la répression de gènes spécifiques. Lesprofils d'expressions géniques ainsi mis en place sont maintenus d'une génération cellulaire àl'autre par des mécanismes épigénétiques stables qui altèrent la structure de la chromatine auniveau des gènes cibles. Les protéines des groupes Polycomb (PcG) et Trithorax (TrxG)établissent une mémoire cellulaire au cours des mitoses en maintenant l'état transcriptionnelde nombreux gènes par une réorganisation de la structure chromatinienne. Les protéines PcGmaintiennent la répression des gènes cibles en créant des domaines chromatiniens compactsoù l'ADN est peu accessible. Les protéines TrxG assurent le maintien de l'activation des gènesen bloquant la propagation des complexes PcG et en déplaçant les nucléosomes. Chez ladrosophile, ces protéines agissent au sein de complexes multimèriques qui se lient à lachromatine au niveau de modules communs appelés modules de mémoire cellulaire (CMM).Les PcG et TrxG régulent l'expression de nombreux gènes dont les plus étudiés sont les gèneshoméotiques. Aujourd'hui, si les différents acteurs de la mémoire cellulaire commencent àêtre bien connus, plusieurs questions restent posées. Quels sont les moyens de recruterspécifiquement les PcG et TrxG sur leurs cibles ? Quels sont les mécanismes moléculaires quipermettent le maintien de cette mémoire ? Quels sont les gènes cibles ? Est-ce que lesmécanismes d'action que nous étudions au niveau des gènes homéotiques sont communs àl'ensemble des gènes régulés par les PcG et TrxG ?Notre équipe travaille sur une protéine à boîte HMG de drosophile : DSP1 (DorsalSwitch Protein 1). L'étude d'un mutant nul dsp11 a montré que la protéine intervient dans larégulation des gènes homéotiques. Par ailleurs, des études d'interactions génétiques et desexpériences de digestion à la DNase I montrent que DSP1 est un facteur de remodelage de lachromatine qui agit suivant le locus considéré en synergie avec les protéines des groupes PcGou TrxG. DSP1 fait donc partie des protéines qui participent à la mémoire cellulaire.Le travail de thèse que nous présentons ici a pour objectif la recherche des gènes ciblesde DSP1 et du rôle de cette protéine dans la régulation de l'expression de ces gènes. Nousavons identifié des cibles préférentielles de DSP1 sur l'ensemble du génome par la techniqued'immunoprécipitation de la chromatine pontée (ChIP). Nous avons étudié le rôle de DSP1sur l'une de ces cibles, le CMM Fab-7 dont l'activité régule le gène homéotiqueUltrabithorax. Au cours de cette étude nous montrons par des expériences de transgenèse queDSP1 est indispensable au fonctionnement du CMM. Le recrutement des protéines PcG etTrxG sur les CMM reste mal connu. La fixation de DSP1 sur le CMM Fab-7 est essentielle aurecrutement des PcG. Ainsi nous montrons pour la première fois que DSP1 est un recruteurprécoce de ces protéines suivant le locus considéré au cours de l'embryogenèse. Au contraire,nous montrons que DSP1 intervient tardivement dans l'activation du gène homéotique Sexcombs reduced. Dans ce cas, la protéine n'est essentielle qu'au cours de la vie larvaire. Enfin,nous montrons que DSP1 régule l'expression du gène de segmentation knirps et est impliquéedans l'établissement de son profil d'expression plutôt que dans son maintien.161Les protéines des groupes Polycomb (PcG) et Trithorax (TrxG) établissent unemémoire cellulaire en maintenant l'état transcriptionnel de nombreux gènes par unremodelage de la chromatine. Chez la drosophile, ces protéines agissent au sein de complexesmultimériques qui se lient à des unités fonctionnelles appelées Modules de MémoireCellulaire (CMM). Quels sont les gènes cibles des protéines PcG/TrxG ? Quels sont lesmoyens de recruter spécifiquement ces protéines ? Sont deux questions auxquelles nous avonsvoulu répondre. Notre équipe travaille sur une protéine à boîtes HMG de drosophile : DSP1.L'objectif du travail que nous présentons ici est de rechercher des gènes cibles de DSP1 et sonrôle dans la régulation de l'expression de ces gènes. Plusieurs cibles ont été identifiées par latechnique d'immunoprécipitation de la chromatine pontée (ChIP). Nous avons étudié le rôlede DSP1 sur le CMM Fab-7 qui régule le gène Ultrabithorax. Nous montrons par desexpériences de transgenèse que la fixation de DSP1 est indispensable à l'activité du CMM.Par ailleurs, nous montrons pour la première fois que DSP1 est un recruteur précoce desprotéines PcG. Nous montrons également que DSP1 intervient en tant que protéine du groupeTrxG dans l'activation du gène Sex combs reduced. Dans ce cas, DSP1 est essentielle au coursde la vie larvaire. Enfin, nous montrons que DSP1 régule l'expression du gène knirps etparticipe à l'établissement de son profil d'expression plutôt qu'à son maintien

Détermination et caractérisation des cibles de DSP1 chez Drosophila melanogaster

Les protéines des groupes Polycomb (PcG) et Trithorax (TrxG) établissent une mémoire cellulaire en maintenant l'état transcriptionnel de nombreux gènes par un remodelage de la chromatine. Chez la drosophile, ces protéines agissent au sein de complexes multimèriques qui se lient à des unités fonctionnelles appelées Modules de Mémoire Cellulaire (CMM). Quels sont les gènes cibles des protéines PcG/TrxG ? Quels sont les moyens de recruter spécifiquement ces protéines ? Sont deux questions auxquelles nous avons voulu répondre. Notre équipe travaille sur une protéine à boîtes HMG de drosophile : DSP1. L'objectif du travail que nous présentons ici est de rechercher des gènes cibles de DSP1 et son rôle dans la régulation de l'expression de ces gènes. Plusieurs cibles ont été identifiées par la technique d'immunoprécipitation de la chromatine pontée (ChIP). Nous avons étudié le rôle de DSP1 sur le CMM Fab-7 qui régule le gène Ultrabithorax. Nous montrons par des expériences de transgenèse que la fixation de DSP1 est indispensable à l'activité du CMM. Par ailleurs, nous montrons pour la première fois que DSP1 est un recruteur précoce des protéines PcG. Nous montrons également que DSP1 intervient en tant que protéine du groupe TrxG dans l'activation du gène Sex combs reduced. Dans ce cas, DSP1 est essentielle au cours de la vie larvaire. Enfin, nous montrons que DSP1 régule l'expression du gène knirps et participe à l'établissement de son profil d'expression plutôt qu'à son maintien.ORLEANS-BU Sciences (452342104) / SudocSudocFranceF

Multiscale analysis of genome-wide replication timing profiles using a wavelet-based signal-processing algorithm

International audienceIn this protocol, we describe the use of the LastWave open-source signal-processing command language (http://perso.ens-lyon.fr/benjamin.audit/LastWave/) for analyzing cellular DNA replication timing profiles. LastWave makes use of a multiscale, wavelet-based signal-processing algorithm that is based on a rigorous theoretical analysis linking timing profiles to fundamental features of the cell's DNA replication program, such as the average replication fork polarity and the difference between replication origin density and termination site density. We describe the flow of signal-processing operations to obtain interactive visual analyses of DNA replication timing profiles. We focus on procedures for exploring the space-scale map of apparent replication speeds to detect peaks in the replication timing profiles that represent preferential replication initiation zones, and for delimiting U-shaped domains in the replication timing profile. In comparison with the generally adopted approach that involves genome segmentation into regions of constant timing separated by timing transition regions, the present protocol enables the recognition of more complex patterns of the spatio-temporal replication program and has a broader range of applications. Completing the full procedure should not take more than 1 h, although learning the basics of the program can take a few hours and achieving full proficiency in the use of the software may take days

Impact of replication timing on non-CpG and CpG substitution rates in mammalian genomes

Neutral nucleotide substitutions occur at varying rates along genomes, and it remains a major issue to unravel the mechanisms that cause these variations and to analyze their evolutionary consequences. Here, we study the role of replication in the neutral substitution pattern. We obtained a high-resolution replication timing profile of the whole human genome by massively parallel sequencing of nascent BrdU-labeled replicating DNA. These data were compared to the neutral substitution rates along the human genome, obtained by aligning human and chimpanzee genomes using macaque and orangutan as outgroups. All substitution rates increase monotonously with replication timing even after controlling for local or regional nucleotide composition, crossover rate, distance to telomeres, and chromatin compaction. The increase in non-CpG substitution rates might result from several mechanisms including the increase in mutation-prone activities or the decrease in efficiency of DNA repair during the S phase. In contrast, the rate of C → T transitions in CpG dinucleotides increases in later-replicating regions due to increasing DNA methylation level that reflects a negative correlation between timing and gene expression. Similar results are observed in the mouse, which indicates that replication timing is a main factor affecting nucleotide substitution dynamics at non-CpG sites and constitutes a major neutral process driving mammalian genome evolution

From Simple Bacterial and Archaeal Replicons to Replication N/U-Domains

International audienceno abstrac

Analysis of chromatin marks along U-domains.

<p>Over representation of open chromatin markers (Material and Methods) at replication timing U-domain borders relative to the corresponding genome-wide value. (A) Mean coverage by DNase I hypersensitive zones, as a function of the distance to the closest U-domain border in BG02 using DNase H1-hESC data (green, genome-wide mean value = 0.0073), K562 using DNase K562 data (red, genome-wide mean value = 0.0138), GM06990 using DNase GM06990 data (blue, genome-wide mean value = 0.0107). (B) Proportion of clones presenting a ratio of “open” over input chromatin greater than 1.5 versus the distance to the closest U-domain border in GM06990 for four U-domain size categories: L0.8 Mb, 0.8 MbL1.2 Mb, 1.2 MbL1.8 Mb and 1.8 MbL3 Mb from light to dark blue curves (genome-wide mean value = 0.20). (C) Mean coverage by 1 kb-enlarged CpG islands as a function of the distance to the closest U-domain border in BG02 for the four U-domain size categories defined in (B) from light to dark green curves (genome-wide mean value = 0.0254). (D) Mean coverage by Pol II peaks as a function of the distance to the closest U-domain border in BG02 (green: Pol II in H1 ESC, genome-wide mean value = 0.0026), K562 (red: Pol II in K562, genome-wide mean value = 0.0024), GM06990 (blue: Pol II in GM12878, genome-wide mean value = 0.0097).</p

Compostional skew and derivative of the replication timing profile correlate.

<p>Pearson correlation (R values) between the skew and , from different cell lines (Material and Methods). and were calculated in non-overlapping 100 kb windows genome wide (GW) and in the 663 skews N-domains (Ndom). Each 100 kb window was classed as intergenic , genic or genic by majority rule. All p-values are .</p