Methylglyoxal in Manuka-Honig (Leptospermum scoparium): Bildung, Wirkung, Konsequenzen

Honig hat seit jeher eine große Bedeutung für den Menschen. In den letzten Jahren erlangte neuseeländischer Manuka-Honig eine zunehmende Bekanntheit und Bedeutung, was auf die antibakteriellen Eigenschaften zurückzuführen ist. Insbesondere ein medizinischer Einsatz bei der Behandlung von Wunden erscheint vielversprechend. Die Ursache für die hohen antibakteriellen Eigenschaften von Manuka-Honig kann auf eine Besonderheit in der Zusammensetzung zurückgeführt werden. So wurden von Mavric et al. (2008) bis zu 100-fach höhere Gehalte an Methylglyoxal (MGO) gegenüber anderen Honigsorten ermittelt, welche für die inhibierende Wirkung auf eine Vielzahl an Bakterien verantwortlich sind. Ziel dieser wissenschaftlichen Arbeit war die weitere Aufklärung und Charakterisierung des Ursprungs und der Bildung des in Manuka-Honig enthaltenen MGO. Es stellte sich die Frage, warum MGO einen natürlichen Honigbestandteil darstellt, inwieweit die Bildung auf einer enzymatischen oder mikrobiellen Grundlage basiert und ob sie durch weitere Honigparameter, wie z.B. freie Aminosäuren oder phenolische Verbindungen, beeinflusst wird. Bei der Lagerung frischer Manuka-Honige kommt es zu einem markanten Anstieg der MGO-Konzentration bis zum Erreichen eines Plateaus, an dem der Honig in Bezug auf den MGO-Gehalt als „ausgereift“ betrachtet werden kann. Eine weitere MGO-Nachbildung ist nicht zu induzieren, vielmehr kommt es zu beginnenden Abbaureaktionen. Direkter Precursor ist die Verbindung Dihydroxyaceton (DHA), die bei der Honigreifung zu MGO umgesetzt wird, was den erstmaligen Nachweis von DHA durch Adams et al. (2009) bestätigt. Zur Bestimmung von DHA in Honig konnte eine RP-HPLC-Methode basierend auf einer Vorsäulen-Derivatisierung mit OPD und UV-Detektion erfolgreich etabliert werden. Das dabei entstehende DHA-OPD-Derivat wurde eindeutig als 2-Hydroxymethylchinoxalin identifiziert, ein möglicher Reaktionsmechanismus wurde aufgezeigt. DHA und MGO wurden in frischen und kommerziellen Manuka-Honigen in vergleichsweise hohen Mengen bis zu 2700 mg/kg DHA bzw. 700 mg/kg MGO quantifiziert. Es ergibt sich für „ausgereifte“ Honige eine gute lineare Korrelation, die mit einem mittleren DHA-MGO-Verhältnis von 2:1 beschrieben werden kann. In frischen Proben liegen die Relationen signifikant höher, wodurch eine Einteilung der Honige nach „Reifegrad“ möglich ist. Honige anderer botanischer Herkunft weisen kein DHA und nur geringe Mengen MGO auf. Die Umsetzung von DHA zu MGO in der Honigmatrix wurde durch Dotierung von DHA-freien Honigsorten und anschließender Lagerung untersucht. Hierbei war eine Varianz in der MGO-Bildung feststellbar. Durch Einbeziehen weiterer Parameter wie z.B. pH-Wert, Wasser- oder Proteingehalt wurde deutlich, dass die DHA-Konzentration im Honig zwar den wesentlichen Faktor für den resultierenden MGO-Gehalt darstellt, die Umsetzung jedoch durch Unterschiede in der Honigmatrix beeinflusst wird. Eine Korrelation zu einzelnen Parametern kann nicht herausgestellt werden. Ergänzend zu den spezifischen Komponenten MGO und DHA wurde eine Bestimmung von weiteren Inhaltsstoffen von Manuka-Honig vorgenommen, um eine umfassende chemische Charakterisierung dieser Sorte zu ermöglichen und etwaige Auffälligkeiten in der Zusammensetzung von Manuka-Honig aufzuzeigen. Darüber hinaus wurden die Konzentration an 5 Hydroxymethylfurfural (HMF) und die Diastasezahl (DZ) als rechtlich geregelte Qualitätsparameter einbezogen. Die Anwendbarkeit dieser Faktoren für Manuka-Honig sowie die Folgen einer thermischen Behandlung wurden hierbei geprüft und diskutiert. Die zur Verfügung stehenden Manuka-Honige wurden hinsichtlich der Gehalte an Wasser, Fructose, Glucose, Proteinen, freier Aminosäuren, phenolischer Verbindungen sowie der Parameter pH-Wert und Honigfarbe analysiert. Dabei kann diese Sorte im Allgemeinen als hell- bis dunkelbrauner Honig beschrieben werden, der sich durch vergleichsweise hohe Mengen an Proteinen und freien Aminosäuren sowie einen hohen Gesamtphenolgehalt auszeichnet. Zudem konnte ein signifikant höherer Wassergehalt im Vergleich zu mitgeführten Honigen anderer botanischer Herkunft ermittelt werden. Frische Manuka-Honige zeichnen sich analog zu anderen frischgewonnenen Honigen durch einen sehr geringen Gehalt an HMF aus, der während der Lagerung stark ansteigen kann. In handelsüblichen Manuka-Honigen ergeben sich daher große Unterschiede in den bestimm-baren Konzentrationen. Anhand von Dotierungs- und Lagerexperimenten mit Kunsthonigmatrix und ausgewählten Honigen konnte ein Einfluss der freien Aminosäuren und des DHA auf die Bildung von HMF aufgezeigt werden. In der Folge kann von einer honigspezifischen Beeinflussung in Abhängigkeit von der Zusammensetzung ausgegangen werden. Im Vergleich zu anderen Honigsorten zeichnet sich Manuka-Honig durch eine eher niedrige bis mittlere DZ aus. Da frische, nachweislich unbehandelte Proben ebenfalls geringe Werte aufweisen können, ist dies nicht auf eine unsachgemäße Behandlung oder Erhitzung zurückzuführen. Neben der natürlichen Variation kann ein zusätzlicher Einfluss von DHA diskutiert werden. Dotierungsversuche lassen ein stärkeres Absinken der DZ bei der Lagerung unter Anwesenheit von DHA erkennen, dessen Ursache vermutlich in einer Hemmung des Enzyms durch eine Modifizierung relevanter Seitenketten begründet liegt. Untersuchungen an dem Honigenzym Invertase bestätigten diese These. Eine Behandlung von Honig mit hohen Temperaturen (70 °C) führte nachweislich zu keiner MGO-Bildung, wohingegen sowohl sensorische Beeinträchtigungen, als auch ein drastischer Anstieg an HMF zu verzeichnen waren. Spekulationen über das Erreichen einer „optimierten“ Bioaktivität durch eine aus rechtlicher Sicht unzulässige Erhitzung sind folglich nicht haltbar. Honig wird neben der antibakteriellen Wirkung mit weiteren biofunktionellen Eigenschaften in Verbindung gebracht. Darunter fallen z.B. ein antioxidatives und entzündungshemmendes Potential. Für Manuka-Honig kann eine potentielle Biofunktionalität auch auf die außergewöhnliche Präsenz von MGO zurückgeführt werden, das in der Literatur jedoch mit einer zytotoxischen Wirkung in Verbindung gebracht wird. Es erfolgte daher eine Bewertung der antimikrobiellen, antioxidativen sowie potentiell zytotoxischen Eigenschaften von Manuka-Honig unter Anwendung hierfür etablierter in vitro Testverfahren. Mittels Mikrodilutionstest wurden gegen vier klinisch relevante Bakterien (Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyrogenes und Pseudomonas aeruginosa) für MGO minimale Hemmkonzentrationen (MHK) zwischen 0,44 und 3,55 mM bestimmt, wobei die Inhibierung im Vergleich zu typischen Antibiotika geringer ist. Eine Antibiotika-Resistenz der Bakterien hatte keinen Einfluss auf die inhibierende Wirkung von MGO. In Anwesenheit von Zucker- bzw. Honigmatrix resultierten vergleichbare MHK-Werte für MGO. Geringe Unterschiede sind auf eine bessere Stabilität des MGO in Honigmatrix zurückzuführen, während etwaige synergistische Effekte durch weitere Komponenten nicht zu vermuten sind. Untersuchungen an ausgewählten Manuka-Honigen bestätigten MGO als maßgeblichen für die inhibierende Wirkung verantwortlichen Faktor. Des Weiteren wurde eine Korrelation zwischen MGO-Gehalt im Honig und antibakterieller Aktivität aufgezeigt. Zur Bestimmung der Zytotoxizität von Honig und 1,2-Dicarbonylverbindungen konnte der Koloniebildungstest als geeignetes Verfahren unter Nutzung einer einstündigen Inkubation der Zellen mit Proben in Phosphatpuffer etabliert werden. Für die verwendeten HT-29-Zellen wurde eine 50%ige Inhibierung für einen MGO-Gehalt von 0,7 mM ermittelt. Trotz hoher MGO-Gehalte zeigen Manuka-Honige im Mittel keine signifikant stärkere zytotoxische Wirkung als andere mitgeführten Nektar- und Honigtau-Proben. Die Werte lassen eine hohe Varianz innerhalb der Manuka-Honige erkennen, die nicht ausschließlich mit deren MGO-Konzentration in Verbindung gebracht werden kann. Die Beurteilung der antioxidativen Kapazität von Manuka-Honigen erfolgte mittels TEAC-II-Test, bezogen auf Trolox als Referenz. Im Vergleich zu anderen Sorten konnten signifikant höhere Werte ermittelt werden. Dabei ist ein direkter Zusammenhang zum Gesamtphenolgehalt festzustellen. Für Manuka-Honig lässt sich ein zusätzlicher Beitrag von MGO oder daraus entstehenden Folgeprodukten diskutieren. Prinzipiell ist die antioxidative Kapazität von Honig jedoch als sehr gering einzustufen

Spermidine ameliorates colitis via induction of anti-inflammatory macrophages and prevention of intestinal dysbiosis

BACKGROUND AND AIMS: Exacerbated immune activation, intestinal dysbiosis, and a disrupted intestinal barrier are common features among inflammatory bowel disease (IBD) patients. The polyamine spermidine, which is naturally present in all living organisms, is an integral component of the human diet, and exerts beneficial effects in human diseases. Here, we investigated whether spermidine treatment ameliorates intestinal inflammation and offers therapeutic potential for IBD treatment. METHODS: We assessed the effect of oral spermidine administration on colitis severity in the T cell transfer colitis model in Rag2 -/- mice by analysis of endoscopy, histology, and molecular inflammation markers. The effects on the intestinal microbiome were determined by 16S sequencing of mouse feces. The impact on intestinal barrier integrity was evaluated in co-cultures of patient-derived macrophages with intestinal epithelial cells. RESULTS: Spermidine administration protected mice from intestinal inflammation in a dose-dependent manner. While T helper cell subsets remained unaffected, spermidine promoted anti-inflammatory macrophages and prevented the microbiome shift from Firmicutes and Bacteroides to Proteobacteria, maintaining a healthy gut microbiome. Consistent with spermidine as a potent activator of the anti-inflammatory molecule protein tyrosine phosphatase non-receptor type 2 (PTPN2), its colitis-protective effect was dependent on PTPN2 in intestinal epithelial cells and in myeloid cells. The loss of PTPN2 in epithelial and myeloid cells, but not in T cells, abrogated the barrier-protective, anti-inflammatory effect of spermidine and prevented the anti-inflammatory polarization of macrophages. CONCLUSION: Spermidine reduces intestinal inflammation by promoting anti-inflammatory macrophages, maintaining a healthy microbiome, and preserving epithelial barrier integrity in a PTPN2-dependent manner

Glycoprotein (GP)96 is essential for maintaining intestinal epithelial architecture by supporting its self-renewal capacity

BACKGROUND & AIMS Glycoprotein (GP)96 is an endoplasmic reticulum (ER)-resident master chaperone for cell surface receptors including the Wnt co-receptors LRP5/6. Intestinal epithelial cells (IEC)-specific deletion of Gp96 is embryonically lethal. However, the role of GP96 in adult intestinal tissue and especially within the intestinal stem cell (ISC) niche has not been studied so far. Here, we investigated how GP96-loss interferes with intestinal homeostasis by compromising viability, proliferation and differentiation of IEC. METHODS Tamoxifen was used to induce Cre-mediated deletion of Gp96 in GP96-Villin$^{creERT2}$ mice and intestinal organoids. With H&E- and immunofluorescence staining we assessed alterations in intestinal morphology and the presence and localization of IEC-types. Real-time PCR and Western blot analysis were performed to explore the molecular mechanisms underlying the severe phenotype of Gp96 KO mice and organoids. RESULTS IEC-specific deletion of Gp96 in adult mice resulted in a rapid degeneration of the stem cell niche, followed by a complete eradication of the epithelial layer and death within few days. These effects were due to severe defects in ISC renewal and premature ISC differentiation, which resulted from defective Wnt and Notch signaling. Furthermore, depletion of GP96 led to massive induction of ER stress. While effects on ISC renewal and adequate differentiation were partly reversed upon activation of Wnt/Notch signaling, viability could not be restored, indicating that reduced viability was mediated by other mechanisms. CONCLUSIONS Our work demonstrates that GP96 plays a fundamental role in regulating ISC fate and epithelial regeneration and is therefore indispensable for maintaining intestinal epithelial homeostasis

Oral administration of dextran sodium sulphate induces a caecum-localized colitis in rabbits

Trichuris suis ova (TSO) have shown promising results in the treatment of inflammatory bowel disease (IBD) but the mechanisms which underlies this therapeutic effect cannot be studied in mice and rats as T. suis fails to colonize the rodent intestine, whilst hatching in humans and rabbits. As a suitable rabbit IBD model is currently not available, we developed a rabbit colitis model by administration of dextran sodium sulphate (DSS). White Himalayan rabbits (n = 12) received 0.1% DSS in the daily water supply for five days. Clinical symptoms were monitored daily, and rabbits were sacrificed at different time points. A genomewide expression analysis was performed with RNA isolated from caecal lamina propria mononuclear cells (LPMC) and intestinal epithelial cells (IEC). The disease activity index of DSS rabbits increased up to 2.1 ± 0.4 (n = 6) at day 10 (controls <0.5). DSS induced a caecum-localized pathology with crypt architectural distortion, stunted villous surface and inflammatory infiltrate in the lamina propria. The histopathology score reached a peak of 14.2 ± 4.9 (n = 4) at day 10 (controls 7.7 ± 0.9, n = 5). Expression profiling revealed an enrichment of IBD-related genes in both LPMC and IEC. Innate inflammatory response, Th17 signalling and chemotaxis were among the pathways affected significantly. We describe a reproducible and reliable rabbit model of DSS colitis. Localization of the inflammation in the caecum and its similarities to IBD make this model particularly suitable to study TSO therapy in vivo

Inhibition of integrin αvβ6 sparks T-cell antitumor response and enhances immune checkpoint blockade therapy in colorectal cancer

BACKGROUND Integrin αvβ6 is a heterodimeric cell surface protein whose cellular expression is determined by the availability of the integrin β6 subunit (ITGB6). It is expressed at very low levels in most organs during tissue homeostasis but shows highly upregulated expression during the process of tumorigenesis in many cancers of epithelial origin. Notably, enhanced expression of integrin αvβ6 is associated with aggressive disease and poor prognosis in numerous carcinoma entities. Integrin αvβ6 is one of the major physiological activators of transforming growth factor-β (TGF-β), which has been shown to inhibit the antitumor T-cell response and cause resistance to immunotherapy in mouse models of colorectal and mammary cancer. In this study, we investigated the effect of ITGB6 expression and antibody-mediated integrin αvβ6 inhibition on the tumor immune response in colorectal cancer. METHODS Using orthotopic and heterotopic tumor cell injection, we assessed the effect of ITGB6 on tumor growth and tumor immune response in wild type mice, mice with defective TGF-β signaling, and mice treated with anti-integrin αvβ6 antibodies. To examine the effect of ITGB6 in human colorectal cancer, we analyzed RNAseq data from the colon adenocarcinoma dataset of The Cancer Genome Atlas (TCGA-COAD). RESULTS We demonstrate that expression of ITGB6 is an immune evasion strategy in colorectal cancer, causing inhibition of the antitumor immune response and resistance to immune checkpoint blockade therapy by activating latent TGF-β. Antibody-mediated inhibition of integrin αvβ6 sparked a potent cytotoxic T-cell response and overcame resistance to programmed cell death protein 1 (PD-1) blockade therapy in ITGB6 expressing tumors, provoking a drastic increase in anti-PD-1 treatment efficacy. Further, we show that the majority of tumors in patients with colorectal cancer express sufficient ITGB6 to provoke inhibition of the cytotoxic T-cell response, indicating that most patients could benefit from integrin αvβ6 blockade therapy. CONCLUSIONS These findings propose inhibition of integrin αvβ6 as a promising new therapy for colorectal cancer, which blocks tumor-promoting TGF-β activation, prevents tumor exclusion of cytotoxic T-cells and enhances the efficacy of immune checkpoint blockade therapy

Mutant HRAS as novel target for MEK and mTOR inhibitors

HRAS is a frequently mutated oncogene in cancer. However, mutant HRAS as drug target has not been investigated so far. Here, we show that mutant HRAS hyperactivates the RAS and the mTOR pathway in various cancer cell lines including lung, bladder and esophageal cancer. HRAS mutation sensitized toward growth inhibition by the MEK inhibitors AZD6244, MEK162 and PD0325901. Further, we found that MEK inhibitors induce apoptosis in mutant HRAS cell lines but not in cell lines lacking RAS mutations. In addition, knockdown of HRAS by siRNA blocked cell growth in mutant HRAS cell lines. Inhibition of the PI3K pathway alone or in combination with MEK inhibitors did not alter signaling nor had an impact on viability. However, inhibition of mTOR or combined inhibition of MEK and mTOR reduced cell growth in a synergistic manner. Finally, Ba/F3 cells transformed with mutant HRAS isoforms Q61L, Q61R and G12V demonstrated equal sensitivity towards MEK and mTOR inhibition. Our results show that HRAS mutations in cancer activate the RAS and mTOR pathways which might serve as a therapeutic option for patients with HRAS mutant tumors

Portuguese honeys as antimicrobial agents against Candida species

Background and aim Honey has been recognized worldwide for its antioxidant, anti-tumor, anti-inflammatory and antimicrobial properties. Among them, the antifungal properties associated to honey make it an attractive alternative treatment for Candida-associated infections, particularly for topical application to the mucous membranes and skin. In this sense, the main purpose of this work was to evaluate physicochemical properties of five Portuguese honeys and Manuka honey (an Australian honey with well recognized medical proprieties, used as control) and to evaluate the antifungal activity in Candida species planktonic and biofilm assays. Experimental procedure Pollen analysis, pH determination, color, concentration of protein and methylglyoxal, conductivity, total phenolics and flavonoids, hydrogen peroxide concentration, and characterization by differential scanning calorimetry in honey samples were determined. Additionally, the effect of honeys on planktonic growth of Candida was initially evaluated by determination of the minimum inhibitory concentrations. Then, the same effect of those honeys was evaluated in biofilms, by Colony Forming Units enumeration. Results and conclusion It has been shown that Portuguese heather (Erica cinereal) honey presented the most similar physicochemical properties to manuka honey (specially phenolic and flavonoids contents). The five Portuguese honeys under study, presented in general a potent activity against planktonic multi-resistant yeast pathogens (several clinical isolates and reference strains of Candida species) and S. aureus and P. aeruginosa bacteria cultures. Additionally, it was also concluded that Portuguese heather honey (50% and 75% (w/v)) can also act as a good Candida species biofilm reducer, namely for C. tropicalis.This study was supported by the Portuguese Foundation for Science and Technology (FCT), Portugal, under the scope of the strategic funding of UIDBB/04469/2020020 unit and BioTecNorte operation (NORTE-01-0145-FEDER-000004) funded by the European Regional Development Fund, Portugal, under the scope of Norte 2020 - Programa Operacional Regional do Norte.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Titanium dioxide nanoparticles exacerbate DSS-induced colitis: role of the NLRP3 inflammasome

OBJECTIVE: Western lifestyle and diet are major environmental factors playing a role in the development of IBD. Titanium dioxide (TiO2) nanoparticles are widely used as food additives or in pharmaceutical formulations and are consumed by millions of people on a daily basis. We investigated the effects of TiO2 in the development of colitis and the role of the nucleotide-binding oligomerisation domain receptor, pyrin domain containing (NLRP)3 inflammasome. DESIGN: Wild-type and NLRP3-deficient mice with dextran sodium sulfate-induced colitis were orally administered with TiO2 nanoparticles. The proinflammatory effects of TiO2 particles in cultured human intestinal epithelial cells (IECs) and macrophages were also studied, as well as the ability of TiO2 crystals to traverse IEC monolayers and accumulate in the blood of patients with IBD using inductively coupled plasma mass spectrometry. RESULTS: Oral administration of TiO2 nanoparticles worsened acute colitis through a mechanism involving the NLRP3 inflammasome. Importantly, crystals were found to accumulate in spleen of TiO2-administered mice. In vitro, TiO2 particles were taken up by IECs and macrophages and triggered NLRP3-ASC-caspase-1 assembly, caspase-1 cleavage and the release of NLRP3-associated interleukin (IL)-1β and IL-18. TiO2 also induced reactive oxygen species generation and increased epithelial permeability in IEC monolayers. Increased levels of titanium were found in blood of patients with UC having active disease. CONCLUSION: These findings indicate that individuals with a defective intestinal barrier function and pre-existing inflammatory condition, such as IBD, might be negatively impacted by the use of TiO2 nanoparticles

The EBI2-oxysterol axis promotes the development of intestinal lymphoid structures and colitis.

The gene encoding for Epstein-Barr virus-induced G-protein-coupled receptor 2 (EBI2) is a risk gene for inflammatory bowel disease (IBD). Together with its oxysterol ligand 7α,25-dihydroxycholesterol, EBI2 mediates migration and differentiation of immune cells. However, the role of EBI2 in the colonic immune system remains insufficiently studied. We found increased mRNA expression of EBI2 and oxysterol-synthesizing enzymes (CH25H, CYP7B1) in the inflamed colon of patients with ulcerative colitis and mice with acute or chronic dextran sulfate sodium (DSS) colitis. Accordingly, we detected elevated levels of 25-hydroxylated oxysterols, including 7α,25-dihydroxycholesterol in mice with acute colonic inflammation. Knockout of EBI2 or CH25H did not affect severity of DSS colitis; however, inflammation was decreased in male EBI2 &lt;sup&gt;-/-&lt;/sup&gt; mice in the IL-10 colitis model. The colonic immune system comprises mucosal lymphoid structures, which accumulate upon chronic inflammation in IL-10-deficient mice and in chronic DSS colitis. However, EBI2 &lt;sup&gt;-/-&lt;/sup&gt; mice formed significantly less colonic lymphoid structures at baseline and showed defects in inflammation-induced accumulation of lymphoid structures. In summary, we report induction of the EBI2-7α,25-dihydroxycholesterol axis in colitis and a role of EBI2 for the accumulation of lymphoid tissue during homeostasis and inflammation. These data implicate the EBI2-7α,25-dihydroxycholesterol axis in IBD pathogenesis

Protein tyrosine phosphatase non-receptor type 2 controls colorectal cancer development

Protein tyrosine phosphatase non-receptor type 2 (PTPN2) recently emerged as a promising cancer immunotherapy target. We set to investigate the functional role of PTPN2 in the pathogenesis of human colorectal carcinoma (CRC) as its role in immune-silent solid tumors is poorly understood. We demonstrate that in human CRC, increased PTPN2 expression and activity correlated with disease progression and decreased immune responses in tumor tissues. Particularly, stage II and III tumors displayed enhanced PTPN2 protein expression in tumor-infiltrating T-cells and increased PTPN2 levels negatively correlated with PD1, CTLA4, STAT1 and granzyme A. In vivo, T-cell and dendritic cell-specific PTPN2 deletion reduced tumor burden in several CRC models by promoting CD44+ effector/memory T-cells, as well as CD8+ T-cell infiltration and cytotoxicity into the tumor. In direct relevance to CRC treatment, T-cell-specific PTPN2 deletion potentiated anti-PD-1 efficacy and induced anti-tumor memory formation upon tumor re-challenge in vivo. Our data suggest a role for PTPN2 in suppressing anti-tumor immunity and promoting tumor development in CRC patients. Our in vivo results uncover PTPN2 as a key player in controlling immunogenicity of CRC, with the strong potential to be exploited to promote cancer immunotherapy