Study of small synthetic molecules with potential pharmacological activity: the case of quinazolines

EGFR can be targeted by three classes of drugs. The first two classes contain molecules which target the extracellular binding domain and are usually either analogues of the epidermal growth factor or monoclonal antibodies raised against the receptor. The other class of drugs contains low molecular weight inhibitors of the tyrosine kinase (TK) activity of EGFR, which target the intracellular ATP binding domain of the receptor. Over the last years several quinazoline derivates have been labeled with short-lived positron emitters, such as 11C, 18F and 124I but, up to now, no labeling has been attempted with 99mTc. The widespread availability of SPECT in comparison with PET technology, the easy production of 99mTc from 99Mo-99mTc generators and the almost ideal properties of 99mTc for SPECT imaging, justify the interest in 99mTc biocomplexes specific for EGFR as an alternative to PET radioligands. In the frames of this Thesis, six new 4-anilinoquinazoline derivatives were studied in vitro. These can be divided into two groups, depending on their substitution at 3- and 4- position of the aniline ring. These groups consist of derivatives bearing 3-Br (first group) or 3-Cl and 4-F (second group). Besides, five complexes of the above quinqzoline derivatives with cold rhenium were studied in vitro. These complexes could be divided into two groups, according to their metal-core. Complexes with the tricarbonyl core fac-(M(CO)3)+ belong to the first group, while the second group contains «4+1» mixed ligand complexes of the general formula MIII(NS3)(CN-R). Both, the quinazoline derivatives and their rhenium complexes were studied in terms of: (1) their ability to inhibit EGFR phosphorylation, (2) type of binding to EGFR (reversible or irreversible), (3) their effect on cell growth, and, (4) their effect on the cell cycle. According to our results, all of the quinazoline derivatives and their rhenium complexes tested retain the quinazoline activity. As it seems, they can cross the cell membrane and act as potent inhibitors of the TK activity of EGFR, while they also inhibit cell growth. Their corresponding IC50 values are well comparable with those of other quinazoline derivatives known from the literature. The incorporation of the rhenium-chelating moiety into the parental quinazoline derivatives did not decrease significantly the activity of the pharmacologically active group, leading to complexes that gave very good in vitro experimental results. In addition, it was shown that complexes with either reversible or irreversible inhibitory activity could be synthesized Among the quinazoline derivatives studied, A1 and A3 (Figure) were found to be the most potent inhibitors of the EGFR phosphorylation (IC50: 17±3.7 nM and 72±3 nM, respectively). Moreover, A3 was shown to bind to EGFR in an irreversible way, to be a potent inhibitor of cell growth (IC50: 2.9±0.3 μM) and to increase the number of cells in the radiation-sensitive G0-G1 phase of the cell cycle. Both A1 and A3 bear Br (3-Br) in their aniline ring (Figure). Among the rhenium complexes studied, Re-A1 (Figure) that contains a bidentate ligand and a fac-(M(CO)3)+ core, and Re-A3 that is based on a «4+1»mixed ligand system, are the most potent inhibitors of EGFR phosphorylation and cell growth. More specifically, Re-A1 that binds to EGFR in a partially reversible way and Re-A3 that binds to EGFR irreversibly, led to similar results in terms of their inhibitory effect on the EGFR phosphorylation (IC50:114±23 nM and 108±13 nM, respectively) and on cell growth (IC50: 2±0.98 μM and 2.9±1.6 μM, respectively). Based on these promising in vitro results, in vivo biodistribution studies have been scheduled, in which 99mTc-labeled complexes will be administered to normal and tumor-bearing mice, in order to evaluate the latter as potential tumor-imaging agents.Τα μόρια με τα οποία γίνεται η στόχευση του EGFR χωρίζονται κυρίως σε τρεις μεγάλες κατηγορίες. Η πρώτη κατηγορία περιλαμβάνει μονοκλωνικά αντισώματα που στοχεύουν την εξωκυτταρική περιοχή του υποδοχέα και ανταγωνίζονται την πρόσδεση του μορίου-προσδέτη σε αυτόν εμποδίζοντας με αυτόν τον τρόπο τον σχηματισμό όμο-ή έτερο-διμερούς και κατά συνέπεια την ενεργοποίηση του υποδοχέα. Η δεύτερη κατηγορία περιλαμβάνει μόρια μικρού μοριακού βάρους-αναστολείς της ενδοκυτταρικής δραστικότητας τυροσινικής κινάσης του EGFR όπως είναι οι 4-ανιλινοκιναζολίνες που διαπερνούν την κυτταρική μεμβράνη και ανταγωνίζονται τις θέσεις δέσμευσης του ΑTP αναστέλοντας με αυτόν τον τρόπο τη φωσφορυλίωση του EGFR και κατά συνέπεια τα σηματοδοτικά μονοπάτια στα οποία εμπλέκεται. Η τρίτη κατηγορία περιλαμβάνει πεπτιδικά ανάλογα του μορίου-προσδέτη (επιδερμικού αυξητικού παράγοντα, Epidermal growth factor, EGF) τα οποία δεσμέυονται στην εξωκυτταρική περιοχή του υποδοχέα στην θέση δέσμευσης του αυξητικού παράγοντα. Τα τελευταία χρόνια έχουν επισημανθεί αρκετά παράγωγα κιναζολινών με βραχύβια ισότοπα εκπομπής ποζιτρονίων, όπως 11C, 18F και 124Ι, αλλά μέχρι τώρα δεν είχε γίνει καμία προσπάθεια επισήμανσής τους με 99mTc. Η ευρέως διαδεδομένη διαθεσιμότητα της γ κάμερας (SPECT), οι ιδανικές ιδιότητες του 99mTc για απεικόνιση με SPECT, το χαμηλό κόστος, η ευκολία παραγωγής και διαθεσιμότητας του 99mTc μέσω γεννήτριας 99Mo-99mTc, δικαιολογούν το ενδιαφέρον σχεδιασμού συμπλόκων του 99mTc που δεσμεύονται ειδικά στην περιοχή με δραστικότητα τυροσινικής κινάσης του EGFR. Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκαν in vitro έξι νέα παράγωγα της τάξης των 4-ανιλινοκιναζολινών, που μπορούν να καταταχθούν σε δύο κατηγορίες, ανάλογα με τις υποκαταστάσεις στις θέσεις 3 και 4 της ανιλίνης. Στην πρώτη κατηγορία ανήκουν κιναζολινικά παράγωγα που έχουν 3-Br και στη δεύτερη ανήκουν κιναζολινικά παράγωγα που έχουν 3-Cl και 4-F. Επίσης, μελετήθηκαν in vitro πέντε κιναζολινικά σύμπλοκα με ψυχρό ρήνιο. Τα σύμπλοκα των παραπάνω κιναζολινικών παραγώγων μπορούν να χωρισθούν σε δύο κατηγορίες, ανάλογα με τον πυρήνα του μετάλλου (core) που περιέχουν. Στην πρώτη κατηγορία ανήκουν σύμπλοκα που ο πυρήνας του μετάλλου είναι του τύπου fac-(M(CO)3)+ και στη δεύτερη κατηγορία ανήκουν σύμπλοκα που ο πυρήνας του μετάλλου (ΜΙΙΙ) σταθεροποιείται με σύστημα μικτών υποκαταστατών του τύπου (M(ΝS3)(CNR)) (M=Re, 99mTc). Συγκεκριμένα, τα κιναζολινικά παράγωγα και τα αντίστοιχα σύμπλοκά τους μελετήθηκαν (1) ως προς την ικανότητά τους να αναστέλουν τη φωσφορυλίωση του EGFR, (2) ως προς τον τρόπο που δεσμεύουν τον υποδοχέα (αντιστρεπτά ή μη), (3) ως προς τη δράση τους στην κυτταρική επιβίωση και (4) ως προς τη δράση τους στον κυτταρικό κύκλο. Συνοπτικά, σύμφωνα με τα αποτελέσματα, όλα τα κιναζολινικά παράγωγα και τα σύμπλοκά τους με μη ραδιενεργό ρήνιο διατηρούν τη δράση των κιναζολινών. Φαίνεται ότι όλα διαπερνούν την κυτταρική μεμβράνη και είναι ισχυροί αναστολείς της δραστικότητας τυροσινικής κινάσης του EGFR καθώς και της κυτταρικής επιβίωσης. Οι τιμές IC50 τόσο για την αναστολή της κυτταρικής επιβίωσης, όσο και για την αναστολή της φωσφορυλίωσης του EGFR είναι συγκρίσιμες με αυτές των παραγώγων που μελετώνται στην βιβλιογραφία. Η ενσωμάτωση των πυρήνων του ρηνίου στα παράγωγα των κιναζολινών δεν μειώνει σημαντικά τη δραστικότητα της φαρμακοφόρου ομάδας, δίνοντας σύμπλοκα με καλά πειραματικά αποτελέσματα..