Avaliação da citotoxicidade de derivados de sais de isotiourônio e tiazinodionas para estudo de leucemia in vitro

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2013.O câncer é caracterizado pelo crescimento desordenado de células anormais em tecidos e órgãos, podendo vir a espalhar-se por outras regiões do organismo. As células neoplásicas adquiriram a propriedade de proliferação além dos limites normais e de resistência à apoptose. O entendimento dos mecanismos moleculares de morte das células tumorais se faz necessário para o avanço em direção ao desenvolvimento de compostos antineoplásicos com maior citotoxicidade e maior seletividade para as células tumorais. A utilização de modelos celulares de leucemia na busca de novas terapias antitumorais torna-se interessante, uma vez que as linhagens celulares possibilitam a obtenção de resultados mais rápidos na prospecção de novos agentes antitumorais. Estudos anteriores demonstram que os sais de isotiourônio (SIs) apresentam atividade antibacteriana, antifúngica e antinflamatória, porém pouco ainda se sabe sobre uma possível atividade antitumoral. As tiazinodionas (TDs) são análogos das tiazolidinedionas, conhecidas pela atividade antihiperglicêmica já bem caracterizada e mais recentemente tem sido descrita a atividade antitumoral em diversos tipos de câncer como cólon, mama, pulmão. Diante deste cenário, o objetivo desse trabalho foi pesquisar novos potenciais agentes antileucêmicos a partir de sais de isotiourônio e tiazinodionas e investigar o mecanismo de morte celular induzida por estes compostos. Observou-se que os sais de isotiourônio MF 04, MF05, MF06, MF07 e MF08 apresentaram concentração citotóxica para 50% das células (CC50) na faixa de 3 a 12 µM com índice de seletividade = 2 para as células de leucemia. Além disso, esses compostos parecem induzir à morte celular através da indução do estresse metabólico com produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) e perda do potencial de membrana mitocondrial. O composto MF08 que apresentou a menor CC50 e maior índice de seletividade em células de leucemia, além de causar alterações morfológicas que sugerem morte celular por mitose catastrófica. Por esse motivo, novos compostos derivados desse SI foram sintetizados, mas os mesmos apresentaram atividade inferior à molécula de origem. As tiazinodionas 1a e 1g apresentaram CC50 de 35 e 28 µM respectivamente e índice de seletividade em torno de 3. O mecanismo de morte envolvido na ação das tiazinodionas está relacionado a produção de EROs, perda de potencial de membrana mitocondrial e alteração nos níveis de cálcio intracelular sugerindo um estresse de retículo endoplasmático e ativação das caspases-12 e -3 culminando em apoptose. Considerando os compostos testados, ambas as classes mostram-se promissoras para estudos pré-clínicos.Abstract : Cancer is characterized by abnormal growth of normal cells in tissues and organs that can spread to other regions. Neoplastic cells acquired the property of proliferation beyond normal limits and apoptosis resistance. It is important to better understand the molecular mechanisms of tumoral cell death in order to promote the development of new antineoplastic compounds with higher toxicity and selectivity. Leukemia cell models in new antitumoral research are interesting due to their easy handling and feasibility. Previous studies showed that isothiouronium salts presented antibacterial, antifungal and anti-inflammatory activities, but the antitumoral activity is still unclear. The thiazinediones are thiazolidinediones analogs wich have its antihyperglycemic activity well characterized and recent studies presented their antitumoral activity in several types of cancer as colon, breast and lung. In this scenario, the aim of this work was to investigate new potential antileukemic agents by isothiouronium salts and thiazolidinediones derivatives and explore the cell death mechanism induced by them.. It was observed that isothiouronium salts MF 04, MF05, MF06, MF07 and MF08presented a range of 3 to 12µM of the cytotoxic concentration to reach 50% of cell death (CC50) and a selectivity index of = 2 to leukemia cells. Furthermore, these compounds seem to induce cell death by metabolic stress with reactive oxygen species production (ROS) and loss of mitochondrial membrane potential. Compound MF08 presented the lowest CC50 and higher selectivity index in leukemia cells and morphologic alterations suggest that it may induce mitotic catastrophe cell death pathway. Therefore novel compounds derived from MF08 where synthetized but it was observed inferior activity compared to original molecule. Thiazinediones 1a and 1g presented CC50 of 35 and 28µM respectively and selectivity index nearby 3. The mechanism of action of thiazinediones is related to ROS production, loss of mitochondrial membrane potential and calcium imbalance suggesting a endoplasmic reticulum stress and caspases -12 and 3 activation culminating in apoptosis cell death. Considering the tested compounds, both groups seem to be promising to further pre-clinical trials

Estudo pré-clínico da atividade antitumoral do sal de isotiourônio MF08 em modelo de melanoma murino

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2017.O câncer representa um problema de saúde mundial. Apesar dos constantes esforços e significativos avanços na pesquisa e desenvolvimento de novos agentes quimioterápicos, a recidiva da doença devido à heterogeneidade do tumor e a resistência aos quimioterápicos permanece sendo um grande desafio na busca pela cura. Nesse contexto, os sais de isotiourônio vêm chamando atenção por diversas atividades biológicas, entre elas promissora atividade antitumoral. Em estudo anterior desenvolvido por nosso grupo de pesquisa foram testadas 28 moléculas com potencial atividade antitumoral, entre as quais se destacou o sal de isotiourônio brometo de (Z)-2-(isotioureidometil)-2-pentenoato de metila (SI-MF08) por apresentar significativa citotoxicidade em linhagem tumoral in vitro e um mecanismo de ação de morte celular que parece ativar diferentes sinalizações que levam à morte da célula tumoral. Esta ação multialvos pode vir a ser uma vantagem na busca por um futuro fármaco, possibilitando contornar a resistência ao tratamento desenvolvida por células tumorais. Assim, o objetivo deste trabalho foi caracterizar a citotoxicidade do SI-MF08 in vitro e realizar estudos pré-clínicos para avaliar a potencial atividade antitumoral. O primeiro capítulo deste trabalho mostra os estudos em linhagem celular de leucemia e mecanismo de ação envolvido na citotoxicidade do composto. Foi possível compreender que a molécula atua ativando a via extrínseca da apoptose via receptor de membrana Fas e ativação de caspases -8 e -3, além de causar bloqueio mitótico em fase G2/M do ciclo celular e geração de espécies reativas de oxigênio que leva ao estresse de retículo endoplasmático e perda do potencial de membrana mitocondrial. O estresse oxidativo gerado causa danos irreversíveis nas mitocôndrias levando à ativação de formação de vesículas ácidas para eliminação dessas organelas no intuito de reestabelecer a homeostasia da célula. O segundo capítulo do trabalho teve como objetivo avaliar a atividade citotóxica do composto em linhagem celular de melanoma para posterior aplicação em modelo de melanoma in vivo. Observou-se que o SI-MF08 também apresentou citotoxicidade para a linhagem celular de melanoma e o mecanismo de morte envolvido no processo foi semelhante ao encontrado nos resultados do primeiro modelo. O terceiro capítulo do trabalho refere-se aos estudos de citotoxicidade do composto em camundongos na busca pela dose máxima que não apresenta efeitos significativos. Dessa forma, observou-se no estudo de dose única que a dose limite para ser administrada é de 15 mg/kg do composto. Em seguida, no estudo de doses repetidas de 10 dias observou-se que a dose de 12 mg/kg de SI-MF08 representa a dose máxima de trabalho. O quarto capítulo deste trabalho teve como objetivo avaliar a atividade antitumoral do SI-MF08 em camundongos portadores de melanoma. Os animais administrados com a dose de 7,5 mg/kg do composto não apresentaram os efeitos deletérios da doença como perda de peso e anemia, contudo a dose não foi capaz de melhorar a sobrevida desses animais ou reduzir significativamente o crescimento tumoral. Entretanto a dose de 12 mg/kg não só inibiu os efeitos deletérios da doença como também aumentou a taxa de sobrevida desses animais e reduziu significativamente o crescimento tumoral, de acordo com padrões de institutos internacionais de pesquisa em câncer.Abstract : Cancer is a global health problem. Despite the efforts and significant advances in the research and development for new chemotherapeutic agents, recurrence of the disease due to tumor heterogeneity and chemotherapy resistance remains a major challenge in the search for the cure. In this context, isothiouronium salts have been attracting attention due to its several biological activities, among those is the promisor antitumor activity. In a previous work performed by our research group, 28 molecules with potential antitumor activity were tested. Among those, the isothiouronium salt methyl (Z)-2-(isothioureidomethyl)-2-pentenoate hydrobromide (IS-MF08) displayed significant cytotoxicity in tumoral cell line and a mechanism that seems to triggers different signals that lead to tumoral cell death. This multi-targeting mechanism may be an advantage in the search for a future drug, making possible to circumvent the resistance to treatment developed by tumor cells. Thus, the objective of this work was to characterize the cytotoxicity of IS-MF08 in vitro and to perform preclinical studies to evaluate the potential antitumor activity. It made possible to understand that the molecule activates the extrinsic pathway of apoptosis via Fas membrane receptor and further activation of caspases -8 and -3, causing mitotic block in the G2 / M phase of the cell cycle and generation of reactive oxygen species that leads to endoplasmic reticulum stress and loss of mitochondrial membrane potential. The oxidative stress generated causes irreversible damage in the mitochondria, leading to the activation of acid vesicles formation in order to eliminate these organelles and reestablish the homeostasis of the cell. The second chapter of the study aimed to evaluate the cytotoxic activity of the compound in melanoma cell line to later application in in vivo melanoma model. IS-MF08 also showed to be cytotoxic to melanoma cell line and the mechanism of death involved in the process was similar to that founded in the results of the first model. The third chapter of the work refers to the cytotoxicity studies of the compound in mice in the search for the maximum dose that has no significant effects. Thus, it has been observed in the single dose study that the dose limit of the compound to be administered is 15 mg/kg. Following, in a 10-day repeated dose study, it was observed that 12 mg/kg of IS-MF08 represents the maximum working dose. The fourth chapter of this work aimed to evaluate the antitumor activity of IS-MF08 in melanoma bearing mice. Animals that were administered with the dose of 7.5 mg/kg of the compound did not exhibit the deleterious effects of the disease as weight loss and anemia, however the dose was not able to enhance the survival rate of these animals or even reduce tumor growth significantly. However, the dose of 12 mg/kg not only inhibited the deleterious effects of the disease but also increased the survival rate of these animals and significantly reduced tumor growth, according to the standards of international cancer research institutes

Serum from morbidly obese patients affects melanoma cell behavior in vitro

Here we examined whether serum from obese patients could create a growth-enhancing microenvironment that alters gene expression in BRAF- and NRAS-mutated melanoma cell lines. SK-Mel-28 (BRAF-mutated) and Sk-Mel-147 (NRAS-mutated) cells were treated with pooled serum from 10 severely obese patients (BMI > 40 kg/m2), pooled serum from 6 healthy lean individuals (BMI = 18.5-24.9 kg/m2), or recombinant TNF-α. We found that obese patient serum enhanced migration capacity and increased NRAS expression levels in both BRAF- and NRAS-mutated melanoma cells. Although TNF-α is the major obesity-related cytokine and TNF-α levels were found to be increased in the serum of obese individuals, this cytokine made only a modest contribution to the migration capacity of melanoma cells. These results indicate that other components present in the serum of severely obese patients may be responsible for enhancing the migration capacity of melanoma cells. As TNF-α alone did not seem to significantly affect tumor cell behavior, anti-tumor strategies aimed at blocking TNF-α should be considered with caution in future studies, particularly when in vitro models are used as screening platforms for antitumor activity

Growing knowledge: an overview of Seed Plant diversity in Brazil

Abstract An updated inventory of Brazilian seed plants is presented and offers important insights into the country's biodiversity. This work started in 2010, with the publication of the Plants and Fungi Catalogue, and has been updated since by more than 430 specialists working online. Brazil is home to 32,086 native Angiosperms and 23 native Gymnosperms, showing an increase of 3% in its species richness in relation to 2010. The Amazon Rainforest is the richest Brazilian biome for Gymnosperms, while the Atlantic Rainforest is the richest one for Angiosperms. There was a considerable increment in the number of species and endemism rates for biomes, except for the Amazon that showed a decrease of 2.5% of recorded endemics. However, well over half of Brazillian seed plant species (57.4%) is endemic to this territory. The proportion of life-forms varies among different biomes: trees are more expressive in the Amazon and Atlantic Rainforest biomes while herbs predominate in the Pampa, and lianas are more expressive in the Amazon, Atlantic Rainforest, and Pantanal. This compilation serves not only to quantify Brazilian biodiversity, but also to highlight areas where there information is lacking and to provide a framework for the challenge faced in conserving Brazil's unique and diverse flora