Analyse structurale et fonctionnelle de la réplication et de la transcription des Bunyavirales

The Bunyavirales order encompasses over 500 species of segmented negative stranded RNA viruses (sNSV). Widespread throughout the world and considered as emerging viruses, the infection of humans by bunyaviruses can lead to serious diseases. In the Hantaviridae family, hemorrhagic fevers have been reported after Hantaan virus (HTNV) infection, while in the Peribunyaviridae family, La Crosse virus (LACV) infections have resulted in cases of encephalitis in children. In addition, the order Bunyavirales is related to other sNSVs such as influenza virus (Orthomyxoviridae), an infectious agent responsible for seasonal epidemics.The genomes of HTNV and LACV consist of three segments that encode four structural proteins: the glycoproteins (Gn and Gc), encoded on the M segment, the nucleoprotein (NP), encoded on the S segment and the polymerase, also known as L protein, encoded on the L segment. During infection, NPs protect the viral genome from damage and against innate immune response of the infected cell by multimerizing around the viral genome. These protein-RNA complexes form helical assemblies called nucleocapsids (NC). Both the 5' and 3' ends of each segment of the viral genome (vRNA) are respectively bound to an L protein. Interactions between L, NP and vRNA form a circularized complex called ribonucleoprotein (RNP). The RNPs present in the virus are the functional units that perform the replication and the transcription of each of the three viral segments.The replication of the vRNA first consists in the production of the complementary genome (cRNA) using vRNA as template, followed by the generation of new vRNA based on the cRNA template. The L protein, and in particular its RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) region, plays an essential role in this reaction. During infection, the L protein also initiates the production of messenger RNAs that encode viral proteins. It first “steals” a 5' capped RNA segment from the infected cell via its cap-binding domain (CBD). This capped RNA is then cleaved by an endonuclease domain (ENDO) also present in the L protein, which ultimately initiates the synthesis of viral messenger RNA (mRNA) thanks to the RdRp catalytic domain: this is transcription.Currently, there is no treatment to counteract bunyavirus infections. It is therefore crucial to analyze the essential steps of their viral cycle described above in order to understand their mechanism of operation and potentially allow the development of new antiviral treatments.The overall objective of this thesis was to take advantage of cryo-electron microscopy to structurally and functionally characterize two major actors of replication and transcription in bunyaviruses, NPs and L proteins, using HTNV and LACV as models. I first determined the high-resolution structure of the recombinant HTNV nucleocapsid (HTNV-NC) to characterize the different interactions between the different NPs and understand the mechanism of encapsidation of the vRNA within the HTNV-NCs. Secondly, I determined the cryo-EM structures of both HTNV and LACV L proteins (respectively called HTNV-L and LACV-L) in complex with the 5' and 3' promoter regions. Finally, I performed the functional characterization of LACV-L via the implementation of in vitro activity assays. This enabled to stall LACV-L in several key stages of both replication and transcription, a pre-requisite that permitted the determination of seven high-resolution structures of LACV-L in action. The combination of these structural snapshots shows with unprecedented details the mechanisms underlying peribunyaviruses replication and transcription.L’ordre des Bunyavirales englobe plus de 450 espèces de virus à ARN négatif segmenté (sNSV). Répandus dans le monde entier et considérés comme émergents, l’infection de l'homme par certains Bunyavirus peut entrainer de graves maladies. Chez la famille des Hantaviridae, le virus Hantaan (HTNV) provoque des fièvres hémorragiques tandis que chez les Peribunyaviridae, le virus La Crosse (LACV) entraine des cas d’encéphalites chez les enfants. De plus, l’ordre des Bunyavirales est proche d’autres sNSV comme le virus influenza (Orthomyxoviridae), un agent infectieux responsable d’épidémies saisonnières.Les génomes d’HTNV et de LACV sont constitués de trois segments codant pour quatre protéines structurales : les glycoprotéines (Gn et Gc), encodées sur le segment M, la nucléoprotéine (NP), encodée sur le segment S et la polymérase, aussi appelée protéine L, encodée sur le segment L. Au cours d’une infection, les NPs protègent le génome viral des dégradations et de la réponse immunitaire innée de la cellule infectée en multimérisant autour du génome viral. Ces complexes protéine-ARN forment des assemblages hélicoïdaux appelés nucléocapsides (NC). Les extrémités 5′ et 3′ de chacun des segments du génome viral (ARNv) sont liées à une protéine L. Le complexe L-NP-ARN, appelé particule ribonucléoprotéique (RNP), représente l’unité fonctionnelle nécessaire à la réalisation de deux étapes essentielles à la suite de l’infection virale : la réplication et la transcription des trois segments qui composent l’ARNv.La réplication de l’ARNv débute par la production d’un génome viral complémentaire (ARNc) en prenant l’ARNv comme modèle, suivie de la genèse de nouveaux ARNv, en se basant sur les ARNc. La protéine L, et en particulier son domaine ARN-polymérase ARN-dépendante (RdRp), joue un rôle central dans cette réaction. Au cours de l’infection, la protéine L permet également d’initier la production d’ARN messagers codant pour les quatre protéines virales. Pour cela, elle « vole » à la cellule infectée un segment d'ARN coiffé en 5′ via son domaine de liaison de la coiffe (CBD). Cet ARN coiffé est ensuite clivé par un domaine endonucléase (ENDO) également présent au sein de la protéine L et permettant in fine d’initier la synthèse de l'ARN messager (ARNm) viral au niveau de son domaine RdRp : c’est la transcription.Actuellement, il n’existe aucun traitement pour combattre les infections dues à ces virus. Il est donc crucial d'analyser les étapes essentielles de leur cycle viral décrites ci-dessus afin de comprendre leur mécanisme de fonctionnement et de potentiellement permettre le développement de nouveaux traitements antiviraux.L’objectif global de cette thèse était donc de tirer profit des derniers développements en cryo-microscopie électronique (cryo-ME) afin de caractériser au niveau structural puis au niveau fonctionnel, deux acteurs majeurs de la réplication et de la transcription chez les Bunyavirus en utilisant comme modèle d’étude les NPs et les protéines L de HTNV et LACV. Au cours de cette thèse, j’ai tout d’abord déterminé la structure à haute résolution de la nucléocapside recombinante du HTNV (HTNV-NC) afin de caractériser les différentes interactions entre les NPs et de comprendre le mécanisme d’encapsidation de l’ARNv au sein des HTNV-NCs. Puis, j’ai déterminé les structures à résolution quasi-atomique de la protéine L du HTNV (HTNV-L) et du virus La Crosse (LACV-L) en complexe avec les régions promotrices 5’ et 3’ de l’ARNv. Enfin, j’ai caractérisé fonctionnellement LACV-L via la mise en place de tests d’activités réalisés in vitro. Ceci a permis de bloquer LACV-L à plusieurs étapes clés de la réplication et de la transcription, un prérequis qui m’a permis de déterminer sept structures à haute résolution de LACV-L en action. La combinaison de ces instantanés structuraux montre avec grande précision les mécanismes moléculaires sous-tendant la réplication et la transcription des Peribunyavirus

Analyse structurale et fonctionnelle de la réplication et de la transcription des Bunyavirales

The Bunyavirales order encompasses over 500 species of segmented negative stranded RNA viruses (sNSV). Widespread throughout the world and considered as emerging viruses, the infection of humans by bunyaviruses can lead to serious diseases. In the Hantaviridae family, hemorrhagic fevers have been reported after Hantaan virus (HTNV) infection, while in the Peribunyaviridae family, La Crosse virus (LACV) infections have resulted in cases of encephalitis in children. In addition, the order Bunyavirales is related to other sNSVs such as influenza virus (Orthomyxoviridae), an infectious agent responsible for seasonal epidemics.The genomes of HTNV and LACV consist of three segments that encode four structural proteins: the glycoproteins (Gn and Gc), encoded on the M segment, the nucleoprotein (NP), encoded on the S segment and the polymerase, also known as L protein, encoded on the L segment. During infection, NPs protect the viral genome from damage and against innate immune response of the infected cell by multimerizing around the viral genome. These protein-RNA complexes form helical assemblies called nucleocapsids (NC). Both the 5' and 3' ends of each segment of the viral genome (vRNA) are respectively bound to an L protein. Interactions between L, NP and vRNA form a circularized complex called ribonucleoprotein (RNP). The RNPs present in the virus are the functional units that perform the replication and the transcription of each of the three viral segments.The replication of the vRNA first consists in the production of the complementary genome (cRNA) using vRNA as template, followed by the generation of new vRNA based on the cRNA template. The L protein, and in particular its RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) region, plays an essential role in this reaction. During infection, the L protein also initiates the production of messenger RNAs that encode viral proteins. It first “steals” a 5' capped RNA segment from the infected cell via its cap-binding domain (CBD). This capped RNA is then cleaved by an endonuclease domain (ENDO) also present in the L protein, which ultimately initiates the synthesis of viral messenger RNA (mRNA) thanks to the RdRp catalytic domain: this is transcription.Currently, there is no treatment to counteract bunyavirus infections. It is therefore crucial to analyze the essential steps of their viral cycle described above in order to understand their mechanism of operation and potentially allow the development of new antiviral treatments.The overall objective of this thesis was to take advantage of cryo-electron microscopy to structurally and functionally characterize two major actors of replication and transcription in bunyaviruses, NPs and L proteins, using HTNV and LACV as models. I first determined the high-resolution structure of the recombinant HTNV nucleocapsid (HTNV-NC) to characterize the different interactions between the different NPs and understand the mechanism of encapsidation of the vRNA within the HTNV-NCs. Secondly, I determined the cryo-EM structures of both HTNV and LACV L proteins (respectively called HTNV-L and LACV-L) in complex with the 5' and 3' promoter regions. Finally, I performed the functional characterization of LACV-L via the implementation of in vitro activity assays. This enabled to stall LACV-L in several key stages of both replication and transcription, a pre-requisite that permitted the determination of seven high-resolution structures of LACV-L in action. The combination of these structural snapshots shows with unprecedented details the mechanisms underlying peribunyaviruses replication and transcription.L’ordre des Bunyavirales englobe plus de 450 espèces de virus à ARN négatif segmenté (sNSV). Répandus dans le monde entier et considérés comme émergents, l’infection de l'homme par certains Bunyavirus peut entrainer de graves maladies. Chez la famille des Hantaviridae, le virus Hantaan (HTNV) provoque des fièvres hémorragiques tandis que chez les Peribunyaviridae, le virus La Crosse (LACV) entraine des cas d’encéphalites chez les enfants. De plus, l’ordre des Bunyavirales est proche d’autres sNSV comme le virus influenza (Orthomyxoviridae), un agent infectieux responsable d’épidémies saisonnières.Les génomes d’HTNV et de LACV sont constitués de trois segments codant pour quatre protéines structurales : les glycoprotéines (Gn et Gc), encodées sur le segment M, la nucléoprotéine (NP), encodée sur le segment S et la polymérase, aussi appelée protéine L, encodée sur le segment L. Au cours d’une infection, les NPs protègent le génome viral des dégradations et de la réponse immunitaire innée de la cellule infectée en multimérisant autour du génome viral. Ces complexes protéine-ARN forment des assemblages hélicoïdaux appelés nucléocapsides (NC). Les extrémités 5′ et 3′ de chacun des segments du génome viral (ARNv) sont liées à une protéine L. Le complexe L-NP-ARN, appelé particule ribonucléoprotéique (RNP), représente l’unité fonctionnelle nécessaire à la réalisation de deux étapes essentielles à la suite de l’infection virale : la réplication et la transcription des trois segments qui composent l’ARNv.La réplication de l’ARNv débute par la production d’un génome viral complémentaire (ARNc) en prenant l’ARNv comme modèle, suivie de la genèse de nouveaux ARNv, en se basant sur les ARNc. La protéine L, et en particulier son domaine ARN-polymérase ARN-dépendante (RdRp), joue un rôle central dans cette réaction. Au cours de l’infection, la protéine L permet également d’initier la production d’ARN messagers codant pour les quatre protéines virales. Pour cela, elle « vole » à la cellule infectée un segment d'ARN coiffé en 5′ via son domaine de liaison de la coiffe (CBD). Cet ARN coiffé est ensuite clivé par un domaine endonucléase (ENDO) également présent au sein de la protéine L et permettant in fine d’initier la synthèse de l'ARN messager (ARNm) viral au niveau de son domaine RdRp : c’est la transcription.Actuellement, il n’existe aucun traitement pour combattre les infections dues à ces virus. Il est donc crucial d'analyser les étapes essentielles de leur cycle viral décrites ci-dessus afin de comprendre leur mécanisme de fonctionnement et de potentiellement permettre le développement de nouveaux traitements antiviraux.L’objectif global de cette thèse était donc de tirer profit des derniers développements en cryo-microscopie électronique (cryo-ME) afin de caractériser au niveau structural puis au niveau fonctionnel, deux acteurs majeurs de la réplication et de la transcription chez les Bunyavirus en utilisant comme modèle d’étude les NPs et les protéines L de HTNV et LACV. Au cours de cette thèse, j’ai tout d’abord déterminé la structure à haute résolution de la nucléocapside recombinante du HTNV (HTNV-NC) afin de caractériser les différentes interactions entre les NPs et de comprendre le mécanisme d’encapsidation de l’ARNv au sein des HTNV-NCs. Puis, j’ai déterminé les structures à résolution quasi-atomique de la protéine L du HTNV (HTNV-L) et du virus La Crosse (LACV-L) en complexe avec les régions promotrices 5’ et 3’ de l’ARNv. Enfin, j’ai caractérisé fonctionnellement LACV-L via la mise en place de tests d’activités réalisés in vitro. Ceci a permis de bloquer LACV-L à plusieurs étapes clés de la réplication et de la transcription, un prérequis qui m’a permis de déterminer sept structures à haute résolution de LACV-L en action. La combinaison de ces instantanés structuraux montre avec grande précision les mécanismes moléculaires sous-tendant la réplication et la transcription des Peribunyavirus

Analyse structurale et fonctionnelle de la réplication et de la transcription des Bunyavirales

The Bunyavirales order encompasses over 500 species of segmented negative stranded RNA viruses (sNSV). Widespread throughout the world and considered as emerging viruses, the infection of humans by bunyaviruses can lead to serious diseases. In the Hantaviridae family, hemorrhagic fevers have been reported after Hantaan virus (HTNV) infection, while in the Peribunyaviridae family, La Crosse virus (LACV) infections have resulted in cases of encephalitis in children. In addition, the order Bunyavirales is related to other sNSVs such as influenza virus (Orthomyxoviridae), an infectious agent responsible for seasonal epidemics.The genomes of HTNV and LACV consist of three segments that encode four structural proteins: the glycoproteins (Gn and Gc), encoded on the M segment, the nucleoprotein (NP), encoded on the S segment and the polymerase, also known as L protein, encoded on the L segment. During infection, NPs protect the viral genome from damage and against innate immune response of the infected cell by multimerizing around the viral genome. These protein-RNA complexes form helical assemblies called nucleocapsids (NC). Both the 5' and 3' ends of each segment of the viral genome (vRNA) are respectively bound to an L protein. Interactions between L, NP and vRNA form a circularized complex called ribonucleoprotein (RNP). The RNPs present in the virus are the functional units that perform the replication and the transcription of each of the three viral segments.The replication of the vRNA first consists in the production of the complementary genome (cRNA) using vRNA as template, followed by the generation of new vRNA based on the cRNA template. The L protein, and in particular its RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) region, plays an essential role in this reaction. During infection, the L protein also initiates the production of messenger RNAs that encode viral proteins. It first “steals” a 5' capped RNA segment from the infected cell via its cap-binding domain (CBD). This capped RNA is then cleaved by an endonuclease domain (ENDO) also present in the L protein, which ultimately initiates the synthesis of viral messenger RNA (mRNA) thanks to the RdRp catalytic domain: this is transcription.Currently, there is no treatment to counteract bunyavirus infections. It is therefore crucial to analyze the essential steps of their viral cycle described above in order to understand their mechanism of operation and potentially allow the development of new antiviral treatments.The overall objective of this thesis was to take advantage of cryo-electron microscopy to structurally and functionally characterize two major actors of replication and transcription in bunyaviruses, NPs and L proteins, using HTNV and LACV as models. I first determined the high-resolution structure of the recombinant HTNV nucleocapsid (HTNV-NC) to characterize the different interactions between the different NPs and understand the mechanism of encapsidation of the vRNA within the HTNV-NCs. Secondly, I determined the cryo-EM structures of both HTNV and LACV L proteins (respectively called HTNV-L and LACV-L) in complex with the 5' and 3' promoter regions. Finally, I performed the functional characterization of LACV-L via the implementation of in vitro activity assays. This enabled to stall LACV-L in several key stages of both replication and transcription, a pre-requisite that permitted the determination of seven high-resolution structures of LACV-L in action. The combination of these structural snapshots shows with unprecedented details the mechanisms underlying peribunyaviruses replication and transcription.L’ordre des Bunyavirales englobe plus de 450 espèces de virus à ARN négatif segmenté (sNSV). Répandus dans le monde entier et considérés comme émergents, l’infection de l'homme par certains Bunyavirus peut entrainer de graves maladies. Chez la famille des Hantaviridae, le virus Hantaan (HTNV) provoque des fièvres hémorragiques tandis que chez les Peribunyaviridae, le virus La Crosse (LACV) entraine des cas d’encéphalites chez les enfants. De plus, l’ordre des Bunyavirales est proche d’autres sNSV comme le virus influenza (Orthomyxoviridae), un agent infectieux responsable d’épidémies saisonnières.Les génomes d’HTNV et de LACV sont constitués de trois segments codant pour quatre protéines structurales : les glycoprotéines (Gn et Gc), encodées sur le segment M, la nucléoprotéine (NP), encodée sur le segment S et la polymérase, aussi appelée protéine L, encodée sur le segment L. Au cours d’une infection, les NPs protègent le génome viral des dégradations et de la réponse immunitaire innée de la cellule infectée en multimérisant autour du génome viral. Ces complexes protéine-ARN forment des assemblages hélicoïdaux appelés nucléocapsides (NC). Les extrémités 5′ et 3′ de chacun des segments du génome viral (ARNv) sont liées à une protéine L. Le complexe L-NP-ARN, appelé particule ribonucléoprotéique (RNP), représente l’unité fonctionnelle nécessaire à la réalisation de deux étapes essentielles à la suite de l’infection virale : la réplication et la transcription des trois segments qui composent l’ARNv.La réplication de l’ARNv débute par la production d’un génome viral complémentaire (ARNc) en prenant l’ARNv comme modèle, suivie de la genèse de nouveaux ARNv, en se basant sur les ARNc. La protéine L, et en particulier son domaine ARN-polymérase ARN-dépendante (RdRp), joue un rôle central dans cette réaction. Au cours de l’infection, la protéine L permet également d’initier la production d’ARN messagers codant pour les quatre protéines virales. Pour cela, elle « vole » à la cellule infectée un segment d'ARN coiffé en 5′ via son domaine de liaison de la coiffe (CBD). Cet ARN coiffé est ensuite clivé par un domaine endonucléase (ENDO) également présent au sein de la protéine L et permettant in fine d’initier la synthèse de l'ARN messager (ARNm) viral au niveau de son domaine RdRp : c’est la transcription.Actuellement, il n’existe aucun traitement pour combattre les infections dues à ces virus. Il est donc crucial d'analyser les étapes essentielles de leur cycle viral décrites ci-dessus afin de comprendre leur mécanisme de fonctionnement et de potentiellement permettre le développement de nouveaux traitements antiviraux.L’objectif global de cette thèse était donc de tirer profit des derniers développements en cryo-microscopie électronique (cryo-ME) afin de caractériser au niveau structural puis au niveau fonctionnel, deux acteurs majeurs de la réplication et de la transcription chez les Bunyavirus en utilisant comme modèle d’étude les NPs et les protéines L de HTNV et LACV. Au cours de cette thèse, j’ai tout d’abord déterminé la structure à haute résolution de la nucléocapside recombinante du HTNV (HTNV-NC) afin de caractériser les différentes interactions entre les NPs et de comprendre le mécanisme d’encapsidation de l’ARNv au sein des HTNV-NCs. Puis, j’ai déterminé les structures à résolution quasi-atomique de la protéine L du HTNV (HTNV-L) et du virus La Crosse (LACV-L) en complexe avec les régions promotrices 5’ et 3’ de l’ARNv. Enfin, j’ai caractérisé fonctionnellement LACV-L via la mise en place de tests d’activités réalisés in vitro. Ceci a permis de bloquer LACV-L à plusieurs étapes clés de la réplication et de la transcription, un prérequis qui m’a permis de déterminer sept structures à haute résolution de LACV-L en action. La combinaison de ces instantanés structuraux montre avec grande précision les mécanismes moléculaires sous-tendant la réplication et la transcription des Peribunyavirus

Analyse structurale et fonctionnelle de la réplication et de la transcription des Bunyavirales

The Bunyavirales order encompasses over 500 species of segmented negative stranded RNA viruses (sNSV). Widespread throughout the world and considered as emerging viruses, the infection of humans by bunyaviruses can lead to serious diseases. In the Hantaviridae family, hemorrhagic fevers have been reported after Hantaan virus (HTNV) infection, while in the Peribunyaviridae family, La Crosse virus (LACV) infections have resulted in cases of encephalitis in children. In addition, the order Bunyavirales is related to other sNSVs such as influenza virus (Orthomyxoviridae), an infectious agent responsible for seasonal epidemics.The genomes of HTNV and LACV consist of three segments that encode four structural proteins: the glycoproteins (Gn and Gc), encoded on the M segment, the nucleoprotein (NP), encoded on the S segment and the polymerase, also known as L protein, encoded on the L segment. During infection, NPs protect the viral genome from damage and against innate immune response of the infected cell by multimerizing around the viral genome. These protein-RNA complexes form helical assemblies called nucleocapsids (NC). Both the 5' and 3' ends of each segment of the viral genome (vRNA) are respectively bound to an L protein. Interactions between L, NP and vRNA form a circularized complex called ribonucleoprotein (RNP). The RNPs present in the virus are the functional units that perform the replication and the transcription of each of the three viral segments.The replication of the vRNA first consists in the production of the complementary genome (cRNA) using vRNA as template, followed by the generation of new vRNA based on the cRNA template. The L protein, and in particular its RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) region, plays an essential role in this reaction. During infection, the L protein also initiates the production of messenger RNAs that encode viral proteins. It first “steals” a 5' capped RNA segment from the infected cell via its cap-binding domain (CBD). This capped RNA is then cleaved by an endonuclease domain (ENDO) also present in the L protein, which ultimately initiates the synthesis of viral messenger RNA (mRNA) thanks to the RdRp catalytic domain: this is transcription.Currently, there is no treatment to counteract bunyavirus infections. It is therefore crucial to analyze the essential steps of their viral cycle described above in order to understand their mechanism of operation and potentially allow the development of new antiviral treatments.The overall objective of this thesis was to take advantage of cryo-electron microscopy to structurally and functionally characterize two major actors of replication and transcription in bunyaviruses, NPs and L proteins, using HTNV and LACV as models. I first determined the high-resolution structure of the recombinant HTNV nucleocapsid (HTNV-NC) to characterize the different interactions between the different NPs and understand the mechanism of encapsidation of the vRNA within the HTNV-NCs. Secondly, I determined the cryo-EM structures of both HTNV and LACV L proteins (respectively called HTNV-L and LACV-L) in complex with the 5' and 3' promoter regions. Finally, I performed the functional characterization of LACV-L via the implementation of in vitro activity assays. This enabled to stall LACV-L in several key stages of both replication and transcription, a pre-requisite that permitted the determination of seven high-resolution structures of LACV-L in action. The combination of these structural snapshots shows with unprecedented details the mechanisms underlying peribunyaviruses replication and transcription.L’ordre des Bunyavirales englobe plus de 450 espèces de virus à ARN négatif segmenté (sNSV). Répandus dans le monde entier et considérés comme émergents, l’infection de l'homme par certains Bunyavirus peut entrainer de graves maladies. Chez la famille des Hantaviridae, le virus Hantaan (HTNV) provoque des fièvres hémorragiques tandis que chez les Peribunyaviridae, le virus La Crosse (LACV) entraine des cas d’encéphalites chez les enfants. De plus, l’ordre des Bunyavirales est proche d’autres sNSV comme le virus influenza (Orthomyxoviridae), un agent infectieux responsable d’épidémies saisonnières.Les génomes d’HTNV et de LACV sont constitués de trois segments codant pour quatre protéines structurales : les glycoprotéines (Gn et Gc), encodées sur le segment M, la nucléoprotéine (NP), encodée sur le segment S et la polymérase, aussi appelée protéine L, encodée sur le segment L. Au cours d’une infection, les NPs protègent le génome viral des dégradations et de la réponse immunitaire innée de la cellule infectée en multimérisant autour du génome viral. Ces complexes protéine-ARN forment des assemblages hélicoïdaux appelés nucléocapsides (NC). Les extrémités 5′ et 3′ de chacun des segments du génome viral (ARNv) sont liées à une protéine L. Le complexe L-NP-ARN, appelé particule ribonucléoprotéique (RNP), représente l’unité fonctionnelle nécessaire à la réalisation de deux étapes essentielles à la suite de l’infection virale : la réplication et la transcription des trois segments qui composent l’ARNv.La réplication de l’ARNv débute par la production d’un génome viral complémentaire (ARNc) en prenant l’ARNv comme modèle, suivie de la genèse de nouveaux ARNv, en se basant sur les ARNc. La protéine L, et en particulier son domaine ARN-polymérase ARN-dépendante (RdRp), joue un rôle central dans cette réaction. Au cours de l’infection, la protéine L permet également d’initier la production d’ARN messagers codant pour les quatre protéines virales. Pour cela, elle « vole » à la cellule infectée un segment d'ARN coiffé en 5′ via son domaine de liaison de la coiffe (CBD). Cet ARN coiffé est ensuite clivé par un domaine endonucléase (ENDO) également présent au sein de la protéine L et permettant in fine d’initier la synthèse de l'ARN messager (ARNm) viral au niveau de son domaine RdRp : c’est la transcription.Actuellement, il n’existe aucun traitement pour combattre les infections dues à ces virus. Il est donc crucial d'analyser les étapes essentielles de leur cycle viral décrites ci-dessus afin de comprendre leur mécanisme de fonctionnement et de potentiellement permettre le développement de nouveaux traitements antiviraux.L’objectif global de cette thèse était donc de tirer profit des derniers développements en cryo-microscopie électronique (cryo-ME) afin de caractériser au niveau structural puis au niveau fonctionnel, deux acteurs majeurs de la réplication et de la transcription chez les Bunyavirus en utilisant comme modèle d’étude les NPs et les protéines L de HTNV et LACV. Au cours de cette thèse, j’ai tout d’abord déterminé la structure à haute résolution de la nucléocapside recombinante du HTNV (HTNV-NC) afin de caractériser les différentes interactions entre les NPs et de comprendre le mécanisme d’encapsidation de l’ARNv au sein des HTNV-NCs. Puis, j’ai déterminé les structures à résolution quasi-atomique de la protéine L du HTNV (HTNV-L) et du virus La Crosse (LACV-L) en complexe avec les régions promotrices 5’ et 3’ de l’ARNv. Enfin, j’ai caractérisé fonctionnellement LACV-L via la mise en place de tests d’activités réalisés in vitro. Ceci a permis de bloquer LACV-L à plusieurs étapes clés de la réplication et de la transcription, un prérequis qui m’a permis de déterminer sept structures à haute résolution de LACV-L en action. La combinaison de ces instantanés structuraux montre avec grande précision les mécanismes moléculaires sous-tendant la réplication et la transcription des Peribunyavirus

Structural characterization of the oligomerization of full-length Hantaan virus polymerase into symmetric dimers and hexamers

Abstract Hantaan virus is a dangerous human pathogen whose segmented negative-stranded RNA genome is replicated and transcribed by a virally-encoded multi-functional polymerase. Here we describe the complete cryo-electron microscopy structure of Hantaan virus polymerase in several oligomeric forms. Apo polymerase protomers can adopt two drastically different conformations, which assemble into two distinct symmetric homodimers, that can themselves gather to form hexamers. Polymerase dimerization induces the stabilization of most polymerase domains, including the C-terminal domain that contributes the most to dimer’s interface, along with a lariat region that participates to the polymerase steadying. Binding to viral RNA induces significant conformational changes resulting in symmetric oligomer disruption and polymerase activation, suggesting the possible involvement of apo multimers as protecting systems that would stabilize the otherwise flexible C-terminal domains. Overall, these results provide insights into the multimerization capability of Hantavirus polymerase and may help to define antiviral compounds to counteract these life-threatening viruses

Structures of active Hantaan virus polymerase uncover the mechanisms of Hantaviridae genome replication

International audienceHantaviruses are causing life-threatening zoonotic infections in humans. Their tripartite negative-stranded RNA genome is replicated by the multi-functional viral RNA-dependent RNA-polymerase. Here we describe the structure of the Hantaan virus polymerase core and establish conditions for in vitro replication activity. The apo structure adopts an inactive conformation that involves substantial folding rearrangement of polymerase motifs. Binding of the 5′ viral RNA promoter triggers Hantaan virus polymerase reorganization and activation. It induces the recruitment of the 3′ viral RNA towards the polymerase active site for prime-and-realign initiation. The elongation structure reveals the formation of a template/product duplex in the active site cavity concomitant with polymerase core widening and the opening of a 3′ viral RNA secondary binding site. Altogether, these elements reveal the molecular specificities of Hantaviridae polymerase structure and uncover the mechanisms underlying replication. They provide a solid framework for future development of antivirals against this group of emerging pathogens. 1234567890():,; 1234567890():,

Pre-initiation and elongation structures of full-length La Crosse virus polymerase reveal functionally important conformational changes

International audienceBunyavirales is an order of segmented negative-strand RNA viruses comprising several life-threatening pathogens against which no effective treatment is currently available. Replication and transcription of the RNA genome constitute essential processes performed by the virally encoded multi-domain RNA-dependent RNA polymerase. Here, we describe the complete high-resolution cryo-EM structure of La Crosse virus polymerase. It reveals the presence of key protruding C-terminal domains, notably the cap-binding domain, which undergoes large movements related to its role in transcription initiation, and a zinc-binding domain that displays a fold not previously observed. We capture the polymerase structure at pre-initiation and elongation states, uncovering the coordinated movement of the priming loop, mid-thumb ring linker and lid domain required for the establishment of a ten-base-pair template-product RNA duplex before strand separation into respective exit tunnels. These structural details and the observed dynamics of key functional elements will be instrumental for structure-based development of polymerase inhibitors

The host RNA polymerase II C-terminal domain is the anchor for replication of the influenza virus genome

Abstract The current model is that the influenza virus polymerase (FluPol) binds either to host RNA polymerase II (RNAP II) or to the acidic nuclear phosphoprotein 32 (ANP32), which drives its conformation and activity towards transcription or replication of the viral genome, respectively. Here, we provide evidence that the FluPol-RNAP II binding interface, beyond its well-acknowledged function in cap-snatching during transcription initiation, has also a pivotal role in replication of the viral genome. Using a combination of cell-based and in vitro approaches, we show that the RNAP II C-terminal-domain, jointly with ANP32, enhances FluPol replication activity. We observe successive conformational changes to switch from a transcriptase to a replicase conformation in the presence of the bound RNPAII C-terminal domain and propose a model in which the host RNAP II is the anchor for transcription and replication of the viral genome. Our data open new perspectives on the spatial coupling of viral transcription and replication and the coordinated balance between these two activities

Structural snapshots of La Crosse virus polymerase reveal the mechanisms underlying PeribunyaviridaePeribunyaviridae replication and transcription

International audienceSegmented negative-strand RNA bunyaviruses encode a multi-functional polymerase that performs genome replication and transcription. Here, we establish conditions for in vitro activity of La Crosse virus polymerase and visualize its conformational dynamics by cryo-electron microscopy, unveiling the precise molecular mechanics underlying its essential activities. We find that replication initiation is coupled to distal duplex promoter formation, endonuclease movement, prime-and-realign loop extension and closure of the polymerase core that direct the template towards the active site. Transcription initiation depends on C-terminal region closure and endonuclease movements that prompt primer cleavage prior to primer entry in the active site. Product realignment after priming, observed in replication and transcription, is triggered by the prime-and-realign loop. Switch to elongation results in polymerase reorganization and core region opening to facilitate template-product duplex formation in the active site cavity. The uncovered detailed mechanics should be helpful for the future design of antivirals counteracting bunyaviral life threatening pathogens

Structural insights into ATP hydrolysis by the MoxR ATPase RavA and the LdcI-RavA cage-like complex

International audienceThe hexameric MoxR AAA+ ATPase RavA and the decameric lysine decarboxylase LdcI form a 3.3 MDa cage, proposed to assist assembly of specific respiratory complexes in E. coli. Here, we show that inside the LdcI-RavA cage, RavA hexamers adopt an asymmetric spiral conformation in which the nucleotide-free seam is constrained to two opposite orientations. Cryo-EM reconstructions of free RavA reveal two co-existing structural states: an asymmetric spiral, and a flat C2-symmetric closed ring characterised by two nucleotide-free seams. The closed ring RavA state bears close structural similarity to the pseudo two-fold symmetric crystal structure of the AAA+ unfoldase ClpX, suggesting a common ATPase mechanism. Based on these structures, and in light of the current knowledge regarding AAA+ ATPases, we propose different scenarios for the ATP hydrolysis cycle of free RavA and the LdcI-RavA cage-like complex, and extend the comparison to other AAA+ ATPases of clade 7