Detection of target-site and metabolic resistance to pyrethroids in the bed bug Cimex lectularius in Berlin, Germany

Knockdown-resistance (kdr) against pyrethroids in bed bugs (Cimex lectularis) is associated with the presence of several point mutations in the voltage-sensitive sodium channel alpha-subunit gene and/or an increased metabolic detoxification by cytochrome P450 monooxygenases (CYPs). In the present study, pyrosequencing assays were developed to quantify the presence of the kdr substitutions (V419L or L925I substitution) in bed bugs in Berlin, Germany. In 14 of 17 bed bug field strains, pymsequencing revealed the presence of the substitution L925I with allele frequencies between 30% and 100%. One field strain additionally carried the substitution V419L with allele frequencies of 40% in males and 96% in females. In seven of the 17 field strains, mRNA levels of four CYP genes were examined using RT-qPCR. Relative to a susceptible laboratory reference strain, five field strains showed significantly higher mRNA levels of cyp397a1 with 7.1 to 56-fold increases. One of these strains additionally showed a 4.9-fold higher mRNA level of cyp398a1 compared to the reference strain, while cyp4cm1 and cyp6dn1 showed no significant differences. Our findings indicate that multiple resistance mechanisms are present in German C. lectularius populations simultaneously

Studies on pyrethroid resistance in the bed bug Cimex lectularius in Berlin, Germany

In den letzten 20 Jahren sind in den Industrieländern die Befallsraten der Bettwanze Cimex lectularius weltweit stark gestiegen. Als Ursachen für die Zunahme werden die vermehrte Reisetätigkeit der Menschen, der nationale und internationale Handel mit Gebrauchtwaren und der Wegfall von einigen Wirkstoffen diskutiert. Als entscheidende Ursache für die ge-genwärtige Verbreitungssituation wird die Entstehung von Resistenzen gegen die bei Bett- wanzenbekämpfungen hauptsächlich eingesetzten Pyrethroide genannt. Aus Deutschland la-gen bisher keine wissenschaftlichen Daten zum Auftreten von Pyrethroid-Resistenzen bei Bettwanzen und den zugrunde liegenden Mechanismen vor. Die bei Bettwanzen am häufigs-ten untersuchte Knockdown-Resistenz (kdr) wird vermutlich durch die Mutationen V419L und L925I im Gen der α-Untereinheit des spannungsabhängigen Natriumkanals, dem Wirkort von Pyrethroiden, ausgelöst. Neben dieser Wirkort-Resistenz wurde bei Bettwanzen eine metabolische Resistenz durch die Überexpressionen der vorhandenen Cytochrom P450-Enzyme des Fremdstoffmetabolismus detektiert. Im Rahmen dieser Arbeit konnten mittels eines Filterkontakt-Biotests mit dem Pyrethroid Deltamethrin bei fünf von 20 C. lectularius Feldstämmen aus Berlin Resistenzindizes (Ri) zwischen Ri = 4,3 und Ri = 20,6 detektiert werden. Die potentiellen kdr- Mutationen V419L und L925I wurden mittels Pyrosequenzierung nachgewiesen. Dabei wurde sowohl genomische DNA von je 100 männlichen und weiblichen Bettwanzen gepoolt sequenziert, als auch der Genotyp von je zehn Männchen und Weibchen einzeln untersucht. Die Mutation L925I wurde in 17 von 20 Feldstämmen und -populationen nachgewiesen. Die Allelfrequenzen von L925I lagen zwischen 30 % und 100 %. Zwei dieser Stämme wiesen zusätzlich die Mutation V419L mit Allelfrequenzen zwischen 40 % und 96 % auf. Bei der Genotypisierung wurden für den Austausch L925I in sechs Stämmen Bettwanzen mit homo-zygot nicht mutierten, homozygot mutierten und heterozygoten Genotypen nachgewiesen. Mittels quantitativer Echtzeit-PCR wurden die Transkriptlevel der vier CYP- Gene cyp397a1, cyp398a1, cyp4cm1 und cyp6dn1 mit denen von drei Referenzgenen und dem eines Referenz-stamms verglichen. Bei vier von acht untersuchten Stämmen mit je zehn männlichen und weiblichen Bettwanzen konnte ein dem wirkstoffsensiblen UBA-Stamm gegenüber erhöhtes mRNA-Expressionslevel von cyp397a1, bei einem Stamm von cyp397a1 und cyp398a1 fest-gestellt werden. Der Feldstamm mit dem höchsten Ri (Ri = 20,6) wurde unter praxisnahem Bedingungen (Wahlversuch) mit einem bei Bettwanzenbekämpfungen häufig verwendeten Insektizid auf Pyrethroid-Resistenz hin untersucht. Da bis zu 50 % der eingesetzten Bettwan-zen überlebt haben, wurde der Stamm als Pyrethroid- reistent eingestuft. Ein zuvor entwickeltes Wahlversuchssystem für die praxisnahe Wirksamkeitsprüfung von Insektiziden (simulated use–Tests) gegen C. lectularius wurde um ein neues Plexiglaskastensystem ergänzt. Dadurch konnten flexible und unflexible Oberflächen wie sie in mit Bettwanzen infestierten Wohnungen vorkommen (z.B. Holz) getestet werden. Im Wahlversuch wurden die Bettwanzen durch CO2 und Wärme zur Simulation eines Wirtes aus dem Versteck gelockt. Auf dem Weg zur Reizquelle mussten sie eine mit Insektizid behandel- te Oberfläche überqueren. Nur Tiere die diese Oberfläche überquert haben wurden in die Auswertung einbezogen. Die individuelle Kontaktdauer der Bettwanzen mit dem Insektizid wurde daher durch ihr natürliches Laufverhalten bestimmt. Die Ergebnisse dieser Wirksam-keitsprüfung weisen darauf hin, dass der Wahlversuch eine wichtige Bedeutung bei der Wirk-samkeitsbeurteilung von Insektiziden gegen Bettwanzen als Ergänzung zu dem Laborzwangs-test hat, da er eine Praxisanwendung unter kontrollierten und reproduzierbaren Bedingungen simuliert. Die Haltung von C. lectularius im Labor ist Voraussetzung für die Wirksamkeitsprüfung von Bekämpfungsmitteln. Die Aufnahme von Blut ist für Bettwanzen essentiell und muss daher auch im Labor möglich sein. Die im Rahmen dieser Arbeit verwendeten Bettwanzen wurden in vivo an Kaninchen gefüttert. Um eine Labortierhaltung zu vermeiden und auf die für die Kaninchen sehr belastende Prozedur der Blutfütterung im Sinne des Tierschutzes zu verzich- ten, wurde eine Anlage zur artifiziellen Bettwanzenfütterung mit verschiedenen Blutsorten erprobt. Entscheidend war die Fragestellung, ob mit der artifiziellen Fütterung und den ver-wendeten Blutsorten eine Aufzucht verschiedener Stämme mit großer Tierzahl möglich ist. Das Vorhaben, einen durch artifizielle Fütterung gehaltenen Bettwanzenstamm zu etablieren, konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht realisiert werden. Die Untersuchungen haben gezeigt, dass die Mortalitätsraten der einzelnen Entwicklungsstadien und die Reproduktionsraten von der Blutsorte und deren Qualität abhängig sind. Da nach derzeitigem Erkenntnisstand keine Daten zu der Bettwanzenverbreitung in Deutsch-land vorliegen, wurde eine deutschlandweite Befragung von Schädlingsbekämpfungsunter-nehmen (SBK) zur aktuellen Verbreitungssituation durchgeführt. Mit nur 21 auswertbaren Antworten konnte zwar kein repräsentativer Überblick gewonnen werden, in privaten Haus-halten und öffentlichen Einrichtungen war jedoch eine steigende Tendenz in der Anzahl der Bekämpfungen pro SBK und Jahr zu erkennen.Over the last twenty years there has been an increase in reports on bed bug (Cimex lectularius) infestations in hotels, public buildings and private houses worldwide. International travel and migration, the trade of second-hand articles, the unavailability of some insecticides and as the main reason the development of resistance against Pyrethroids, which are the insecticides primarily used for bed bug control, are considered to be responsible for the expansion of the bed bug. Pyrethroid-resistance in bed bugs has been described in many countries. However, for Germany no data about the occurrence and the mechanisms inducing pyrethroid-resistance are available so far. Knockdown- resistance (kdr) to pyrethroids has been shown to be associated with the presence of two point mutations (V419L or L925I) in the voltage gated sodium channel α‑subunit gene, the target site of pyrethroids. An increased metabolic detoxification by cytochrome P450s has been described as an additional mechanism causing pyrethroid resistance in bed bugs. In the present study, bed bug field strains and populations were collected from 20 infested apartments in Berlin, Germany. In five of these field strains the susceptibility to deltamethrin of C. lectularius was determined in a filter contact bioassay. Resistance ratios (Ri), calculated from LD50-values ranged between Ri = 4.3 and Ri = 20.6. Furthermore, pyrosequencing of genomic DNA fragments containing the possible polymorphisms of single (10 male and fe-male bed bugs each) and pooled (100 male and female bed bugs each) samples was performed in order to analyze the presence of the two mutations (V419L, L925I) and to evaluate the genotypes with which they appear. Pyrosequencing showed the presence of mutation L925I in 17 of the 20 studied field strains with allele frequencies between 30 % and 100 %. Two of these strains additionally had the mutation V419L with allele frequencies between 40 % and 96 %. Results from tests on single bed bugs in each field strain showed non-mutated, heterozygous as well as homozygous mu-tated bed bugs for the substitution L925I. Relative mRNA- expression levels of the four CYP-genes cyp397a1, cyp398a1, cyp4cm1 and cyp6dn1 were determined with quantitative real time PCR for eight bed bug strains. 10 male and 10 female bed bugs were investigated per strain. The relative mRNA-expression levels of these four CYP-genes were examined among an insecticide susceptible strain and eight field strains, also comparing them with the mRNA-expression of three reference-genes. In four of the eight samples a higher relative mRNA-expression level of cyp397a1 was detected. One strain showed higher mRNA-expression level of cyp397a1 and cyp398a1. The strain which showed the highest Ri was tested for pyrethroid-resistance under conditions of practice (choice trial system) with an insecticide primarily used for bed bug control. Pyrethroid-resistance was proven, as up to 50 % of the bed bugs survived. A previously developed choice trial system for simulated use-tests of contact insecticides was modified. Adding a plexiglass box allowed the testing of a variety of flexible and unflexible treated surfaces which are present in bed bug infested rooms, e.g. wood. Bed bugs were at-tracted by CO2 and heat to mimic a potential host. They either crossed the insecticide treated surface or stayed in their shelter. Only the insects which crossed the treated surface were in-cluded in the effectiveness test. In contrast to non-choice surface contact bioassays, were bed bugs were exposed under no choice conditions for a defined time, the time period bed bugs spent on the treated surfaces in the choice test corresponded to their natural seeking behavior. The results showed that the choice experiment simulates a typical bed bug treatment in prac-tice under controlled and reproducible conditions. Therefore it should be used as an important supplement to non- choice surface contact bioassays. As bed bugs are obligate blood feeding insects, their rearing in the laboratory requires the keeping of small mammals as blood donors. The bed bugs used in this study were fed on rab-bits. In order to reduce the number of animals kept as blood donors, a membrane blood- feeding system that could feed all lifestages and large numbers of bed bugs was tested with different types of animal blood. Within the scope of this work it was not possible to establish a bed bug strain which was exclusively reared on the artificial feeder. The results showed that the mortality of the different lifestages as well as the reproduction rate depended on the type and quality of animal blood used in the experiments. Within our present state of knowledge in Germany no data about the current bed bug preva-lence are available. In order to obtain information towards the spread of bed bugs, a Germany-wide survey of pest control companies was conducted. With only 21 evaluable answers it was not possible to show representative data, but the tendency of growing numbers of bed bug treatments in private households and public facilities became apparent