Evaluation of chloroform/methanol extraction to facilitate the study of membrane proteins of non-model plants

Membrane proteins are of great interest to plant physiologists because of their important function in many physiological processes. However, their study is hampered by their low abundance and poor solubility in aqueous buffers. Proteomics studies of non-model plants are generally restricted to gel-based methods. Unfortunately, all gel-based techniques for membrane proteomics lack resolving power. Therefore, a very stringent enrichment method is needed before protein separation. In this study, protein extraction in a mixture of chloroform and methanol in combination with gel electrophoresis is evaluated as a method to study membrane proteins in non-model plants. Benefits as well as disadvantages of the method are discussed. To demonstrate the pitfalls of working with non-model plants and to give a proof of principle, the method was first applied to whole leaves of the model plant Arabidopsis. Subsequently, a comparison with proteins extracted from leaves of the non-model plant, banana, was made. To estimate the tissue and organelle specificity of the method, it was also applied on banana meristems. Abundant membrane or lipid-associated proteins could be identified in both tissues, with the leaf extract yielding a higher number of membrane proteins

An evaluation of techniques for membrane proteomics in poorly sequenced plants: a case study on banana

Miljoenen mensen zijn afhankelijk van banaan als voornaamste voedselbron. De bananenteelt wordt echter bedreigd door verschillende omgevingsgebonden stressfactoren. De reactie van een plant op deze stressfactoren hangt af van verschillende elementen. Eén van deze elementen is de aanwezigheid en activiteit van bepaalde eiwitten. De studie van eiwitten in planten waarvan het genoom niet gekend is, gebeurt meestal met behulp van twee dimensionale gel elektroforese. Een groot nadeel van deze techniek is dat hij niet toelaat om membraaneiwitten te bestuderen. De belangrijkste redenen hiervoor zijn dat membraaneiwitten niet talrijk zijn en dat ze daarenboven niet goed oplosbaar zijn in een waterige omgeving. Aangezien deze eiwitten een belangrijke rol spelen in verschillende fysiologische reacties, was het belangrijk om technieken te evalueren en te optimaliseren om het bestuderen van membraaneiwitten in banaan toch mogelijk te maken.Aangezien slechts een heel beperkt deel van de genoomsequentie van banaan gekend is, waren technieken voor de scheiding van eiwitten een logische keuze. Peptiden die tot eenzelfde eiwit behoren, blijven tijdens de scheiding met elkaar verbonden, hetgeen eiwitidentificatie vergemakkelijkt. Bovendien is het kwantificeren van eiwitten meer vanzelfsprekend in vergelijking met het kwantificeren van peptiden. Momenteel zijn enkel gel-gebaseerde technieken voor eiwit-scheiding beschreven. Helaas zijn ze allen gelimiteerd in hun scheidingsvermogen. Hierdoor is een sterke verrijking in membraaneiwitten voor de scheiding noodzakelijk. Eerst werd gedacht aan een extractie in een mengsel van chloroform en methanol aangezien deze methode specifiek sterk hydrofobe eiwitten met korte hydrofiele gebieden zou isoleren. Naast membraaneiwitten, werden er echter ook een aantal abundante niet-membraaneiwitten teruggevonden in het chloroform/methanol extract.Daarom besloten we om bij de evaluatie van een tweede techniek, zijnde blue native elektroforese, te vertrekken van een totale membraanfractie. Deze techniek is ontwikkeld voor de studie van eiwitcomplexen. Tijdens de doctoraatsthesis werd hij geëvalueerd voor zijn capaciteit om membraaneiwitten te scheiden van de eiwitten die niet tot een complex behoren en als techniek om de interacties tussen eiwitten te bestuderen in banaan. In zijn meest algemene toepassing wordt blue native elektroforese gecombineerd met SDS-PAGE. Deze aanpak gaat echter gepaard met verlies van eiwitten bij de transfer van eiwitten van de eerste naar de tweede dimensie. Daarom werd ook getest of blue native elektroforese kan gecombineerd worden met de digestie van alle eiwitten die behoren tot één complex en een scheiding van de resulterende peptiden via chromatografie. Deze aanpak lijkt beloftevol maar vereist nog bijkomende optimalisatie. Zo werden nog steeds te veel abundante, niet-membraaneiwitten geïdentificeerd, hetgeen de identificatie van de minder abundante membraaneiwitten verhinderde.Hieruit werd besloten dat een succesvolle studie op membraaneiwitten moet starten met hetopzuiveren van een welbepaalde membraan. In dit onderzoek werd gekozen voor de plasma membraan omdat deze de scheiding vormt tussen een cel en zijn omgeving. Eiwitten die met deze membraan geasoccieerd zijn, kunnen dus een rol spelen bij het detecteren van stress in de omgeving en bij het tot stand brengen van een gepaste reactie. Aangezien de beschikbare gel-gebaseerde technieken voor membraan proteomics te beperkt bleken te zijn in hun scheidingsvermogen, werden ook gel-vrije, peptide-gebaseerde scheidingstechnieken geëvalueerd. Dit houdt in dat de eiwit-identificatie met de grootste zorg moest gebeuren. Deze identificatie was gebaseerd op het aflezen van een eiwit-sequentie van het massaspectrogram en op het visualiseren van de peptiden die aan eenzelfde eiwit zijn toegekend.Gebaseerd op al de bekomen resultaten kon uiteindelijk een efficiënte werkwijze voor het bestuderen van membraaneiwitten in planten waarvan maar zeer weinig genoom-informatie beschikbaar is, geformuleerd worden. Deze werkwijze kan nu een basis vormen voor het optimaliseren van het kwantitatieve luik van membraan proteomics.status: publishe

THE STUDY OF HYDROPHOBIC PROTEINS OF ARABIDOPSIS THALIANA AND BANANA, A MODEL AND NON MODEL CROP

status: publishe

Study of hydrophobic proteins and protein complexes involved in cryopreservation of banana (Musa spp.) meristems

Cryopreservation (or conservation at ultra-low temperatures (-196 °C)) of meristems is the best method to preserve the banana (Musa spp.) diversity safely. A prerequisite for successful application of this technique is the avoidance of irreversible cell membrane damage caused by the formation of intracellular ice crystals. Ice crystallization can only be prevented through a reduction of the cellular water content (= dehydration) to the strict minimum. Acclimation is often essential to survive such a low water content (1). Membrane proteins likely play an important role in the acquisition of dehydration tolerance. As such, a study of the change in the membrane proteome of banana meristems of a dehydration tolerant and sensitive variety will expand the current knowledge of the physiology underlying cryo- and dehydration tolerance. This information will be used to improve the efficiency of current cryopreservation protocols. One approach to study the meristem proteome is by its separation through two-dimensional electrophoresis (2DE) (2). However, highly hydrophobic membrane proteins largely escape from "classical" 2DE analysis because of their low abundance and their limited solubility in neutral detergent/urea lysis buffers (3). Low abundance can be solved by enriching fractionation steps. Physical, as well as chemical methods have been described. For banana meristems, fractionation was executed by differential centrifugation in order to obtain a microsomal fraction. However, further chemical enrichment of this fraction was needed. Seigneurin-Berny et al. (1999) developed a simple technique to extract highly hydrophobic proteins from chloroplast membranes (4). The method is based on the differential solubilization of membrane proteins in chloroform/methanol mixtures. We optimized this extraction method for banana meristems by determining the ideal proportion of chloroform/methanol to be used as well as by testing alternative precipitation methods and different acrylamide concentrations. Subsequently, the optimised method was applied to search for differential proteins of a dehydration tolerant and sensitive banana variety. An alternative technique to study hydrophobic proteins, which also gives information about the organization of protein complexes and/or protein-protein interactions, is Blue native PAGE (BN-PAGE). This technique, originally developed by Schägger and von Jagow (5) allows separation of protein complexes and hydrophobic proteins in the mass range of 10 kDa to 1 MDa. This technique comprises (i) the use of mild, neutral detergents for solubilisation and (ii) the application of Coomassie Brilliant Blue G 250 to give a negative charge to proteins and protein complexes. This will allow separation according to molecular mass. The technique was optimized and applied to study protein complexes present in the microsomal fraction of banana meristems. Preliminary results are presented.vokMyynti MTT, Tietopalvelut 31600 Jokioine

Diversiteit in het ministerie van het Brussels Hoofdstedelijk Gewest = Diversité dans le ministère de la Régionde Bruxelles-Capitale

status: publishe

Proteome analysis of non-model plants: a challenging but powerful approach

Biological research has focused in the past on model organisms and most of the functional genomics studies in the field of plant sciences are still performed on model species or species that are characterized to a great extent. However, numerous non-model plants are essential as food, feed, or energy resource. Some features and processes are unique to these plant species or families and cannot be approached via a model plant. The power of all proteomic and transcriptomic methods, that is, high-throughput identification of candidate gene products, tends to be lost in non-model species due to the lack of genomic information or due to the sequence divergence to a related model organism. Nevertheless, a proteomics approach has a great potential to study non-model species. This work reviews non-model plants from a proteomic angle and provides an outline of the problems encountered when initiating the proteome analysis of a non-model organism. The review tackles problems associated with (i) sample preparation, (ii) the analysis and interpretation of a complex data set, (iii) the protein identification via MS, and (iv) data management and integration. We will illustrate the power of 2DE for non-model plants in combination with multivariate data analysis and MS/MS identification and will evaluate possible alternatives

Sugar-Mediated Acclimation: The Importance of Sucrose Metabolism in Meristems

We have designed an <i>in vitro</i> experimental setup to study the role of sucrose in sugar-mediated acclimation of banana meristems using established highly proliferating meristem cultures. It is a first step toward the systems biology of a meristem and the understanding of how it can survive severe abiotic stress. Using the 2D-DIGE proteomic approach and a meristem-specific EST library, we describe the long-term acclimation response of banana meristems (after 2, 4, 8, and 14 days) and analyze the role of sucrose in this acclimation by setting up a control, a sorbitol, and a sucrose acclimation treatment over time. Sucrose synthase is the dominant enzyme for sucrose breakdown in meristem tissue, which is most likely related to its lower energy consumption. Metabolizing sucrose is of paramount importance to survive, but the uptake of sugar and its metabolism also drive respiration, which may result in limited oxygen levels. According to our data, a successful acclimation is correlated to an initial efficient uptake of sucrose and subsequently a reduced breakdown of sucrose and an induction of fermentation likely by a lack of oxygen