Der Autophagie-lysosomale Weg: Rolle bei der Aggregation, der Freisetzung und der Toxizität von alpha-Synuklein

Understanding the underlying molecular mechanisms of neurodegenerative diseases is vitally important because of the prevalence of these chronic conditions in our aging population. The two key features of neurodegenerative diseases are formation of protein aggregation and neuronal degeneration. Impaired protein degradation, mitochondrial dysfunction, and oxidative stress are the interrelated processes that are considered the underlying cause of the disease pathogenesis. Parkinson’s disease (PD), dementia with Lewy bodies (DLB), and multiple system atrophy (MSA) represent a group of neurodegenerative diseases that are called synucleinopathies. They are characterized by the deposition of misfolded and aggregated forms of alpha-synuclein (aSyn) that constitutes the major component of Lewy bodies (LBs) and Lewy neurites (LNs). aSyn can be degraded by the ubiquitin-proteasomal system (UPS) and the autophagy-lysosomal pathway (ALP) both compromised in PD and DLB. The major autophagy pathways are the chaperone-mediated autophagy (CMA) and macroautophagy. For CMA, a chaperone complex specifically recognizes and translocates target proteins into the lysosome for degradation. Macroautophagy is a unique bulk degradation mechanism involving the building of an autophagosome that fuses with the lysosomal compartment after maturation. Autophagy can be modulated at specific stages using different compounds resulting in an activation or inhibition of the cascade. The paradigm of intracellular aSyn pathology was recently extended by its extracellular effects, based on I) the discovered hierarchical spreading aSyn pathology throughout PD brains; II) the detection of different aSyn species in human plasma and cerebrospinal fluid of PD patients and controls; and III) an observed transfer of aSyn pathology from PD brain tissue to embryonic mesencephalic tissue transplants. The resulting concept of cell-to-cell propagation of aSyn pathology comprises its release, uptake, and subsequently seeding of intracellular aSyn aggregation in recipient cells. However, the impact of ALP on extracellular aSyn effects has not been linked to its intracellular aggregation. In the context of my PhD thesis the dynamic interplay between ALP-dependent aSyn degradation, aggregation, its release, and the microenvironmental effect of extracellular aSyn have been analyzed in order to elucidate the link between aSyn aggregation and toxicity. To address these hypotheses, a transgenic mouse model of synucleinopathies overexpressing human wildtype (WT) aSyn under the neuron-specific PDGFb promoter and our well established cell culture model comprising the overexpression of low-aggregating WT-Syn and a C-terminally tagged protein version that gives rise to large intracellular aggregates (high-aggregating SynT) were used. The substantiation of cellular toxicity could be shown in these modell systems of aSyn aggregation after inhibition of lysosomal degradation by the alkalizing compound bafilomycin A1 (BafA1). This was paralleled by a dichotomous effect on aSyn aggregation resulting in a reduction of large intracellular aSyn aggregates but an increase of smaller punctuate structures. These results suggest that distinct steps of the ALP are involved in aSyn aggregation. Interestingly, these effects on toxicity and aggregation of aSyn could not be mimicked by other inhibitors of the ALP. By further analyzing the effect of the ALP inhibitor BafA1 on aggregation and toxicity the major toxic effect of aSyn could clearly be attributed to its extracellular species and link the release of aSyn to a BafA1-sensitive pathway. Cells in the microenvironment of aSyn expressing cells and naive cells exposed to cell-derived aSyn displayed a toxicity induction. These findings could be confirmed in aSyn transgenic mice after inhibition of ALP resulting in enhanced levels of extracellular aSyn in the CSF and further inducing neuronal damage. The aSyn-mediated toxicity mainly affects cells not expressing aSyn in the microenvironment indicating that aSyn release is a cell-protective mechanism. A biochemical characterization of extracellular aSyn species after BafA1-induced lysosomal inhibition linked the aggravated microenvironmental toxicity to lower aggregated and rather smaller oligomerized aSyn species that are associated with particles. Thus, the ALP has several functions: It not only a) increased intracellular oligomeric aSyn species, but at the same time b) reduces intracellular larger aggregates, directly leading to c) increased release of smaller aSyn containing vesicular structures by distinct secretion pathways. Also, the major toxicity derived from the extracellular aSyn species was substantiated by the BafA1-sensitive ALP (and not by other ALP modulators modulating the cascade at different stages), linking secretion of toxic aSyn species to late ALP stages. These cellular mechanisms of the ALP evoke detrimental response of the cellular microenvironment both in vitro and in vivo including neurotoxicity, inflammatory responses, and uptake of aSyn. The novel role of ALP connecting degradation and secretion of aSyn directly underline the importance of extracellular toxic action of aSyn. Balancing the protein homeostasis by supporting intracellular degradation systems and modulating secretion pathways facilitates new therapeutic strategies to overcome protein aggregation in age-related chronic diseases.Ein Verständnis der molekularen Mechanismen, die neurodegenerativen Erkrankungen zugrunde liegen, ist aufgrund der Prävalenz dieser Erkrankungen in unserer alternden Gesellschaft von wesentlicher Bedeutung. Neurodegenerative Erkrankungen sind im wesentlichen durch zwei Hauptmerkmale gekennzeichnet: I) Durch die Bildung von proteinhaltigen Aggregaten und II) durch eine Degeneration der Neurone. Störungen oder ein Verlust der Proteindegradation, oxidativer Stress und mitochondriale Schädigungen werden als basale, sich gegenseitig bedingende Mechanismen angenommen, die zur Enstehung der Pathologie beitragen. Das idiopatische Parkinson Syndrom (IPS), die Lewy Körperchen Demenz (DLB) und die Multi-System Atrophie bilden eine als Synukleinopathien bezeichnete Gruppe neurodegenerativer Erkrankungen. Sie sind durch die exzessive Akkumulation des fehlgefalteten und aggregierten Proteins alpha-Synuklein (aSyn) charakterisiert, welches den Hauptbestandteil der Lewy Körperchen und Lewy Neuriten darstellt. Es ist bekannt, dass die Proteostase von aSyn entscheidend mit den zellulären Dysfunktionen bei dem IPS und der DLB in Zusammenhang steht. Außerdem kann aSyn über beide metabolische Abbauwege, die der Degradation von Proteinen zur Verfügung stehen, abgebaut werden. Das ist zum einen das Ubiquitin-proteasomale System (UPS) und zum anderen das Autophagie-lysosomale System (ALP- autophagy-lysosomal pathway). Beide Abbauwege sind in Synukleinopathien gestört. Prinzipiell unterscheidet man mehrere unterschiedliche Mechanismen der Autophagie, aSyn wird aber über die zwei Hauptwege abgebaut: Die Chaperon-vermittelte Autophagie (CMA- chaperone-mediated autophagy) und die Makroautophagie. Während bei der CMA mit Hilfe eines Chaperon-Komplexes zielgerichtet und spezifisch un- oder fehlgefaltete Proteine in das Lysosom transloziert werden, kommt es bei der Makroautophagie zur Bildung der Autophagosomen, die nach ihrer Reifung final mit dem Lysosom verschmelzen. Eine Modulation des Autophagie-lysosomalen Systems kann an verschiedenen Stellen mit Hilfe von Substanzen oder bestimmten Molekülen erfolgen, die zu einer Aktivierung oder einer Inhibition des Systems führen. Der Blickwinkel auf die intrazelluläre aSyn Pathologie hat sich in den letzten Jahren entscheidend um ihre extrazellulären Effekte erweitert. Dies geschah aufgrund I) der Beobachtung, dass sich die aSyn Pathologie hierarchisch im Verlauf der Erkrankung entlang vorgegebener Nervenstrukturen auszubreiten scheint, II) des Nachweises von verschiedenen extrazellulären aSyn Spezies in der Zerebrospinalflüssigkeit und in Plasma von Patienten und gesunden Probanden und III) der Entdeckung, dass die aSyn Pathologie in Gehirnen von IPS Patienten von erkranktem Gewebe auf embryonal-mesenzephales, transplantiertes Gewebe übergegangen ist. Das resultierende Konzept der aSyn Pathologie, von Zelle zu Zelle zu propagieren, beinhaltet die Freisetzung, die Aufnahme und die Initiierung der Aggregatbildung in der Empfängerzelle. Dennoch konnte bisher kein Zusammenhang zwischen der Bedeutung der Autophagie für die extrazellulären Effekte von aSyn und dessen intrazellulärer Aggregation hergestellt werden. Im Rahmen der vorliegenden Promotion habe ich die Beteiligung des ALP an den dynamischen Wechselwirkungen von aSyn Degradation, intrazellulärer Aggregation, Freisetzung und den Auswirkungen von extrazellulärem aSyn untersucht, mit dem Ziel, einen Zusammenhang zwischen Aggregation und Toxizität herzustellen. Dafür wurde zum einen ein transgenes Tiermodell genutzt, welches humanes Wildtyp (WT) aSyn unter dem exklusiv neuronalen PDGFb-Promotor exprimiert. Diese transgenen Tiere weisen aSyn Aggregate unter anderem in kortikalen Arealen und im Hippokampus auf, sowie einen Verlust dopaminerger Neurone, der mit motorischen Defiziten assoziiert ist. Zum anderen verwendete ich für die Bearbeitung der Hypothesen unsere etablierten Zellkulturmodelle für die aSyn Aggregation. Dieses umfasst die Überexpression von schwach-aggregierendem WT aSyn und einer C-terminal modifizierten Variante des aSyn (SynT), deren Überexpression zur Bildung von intrazellulären Aggregaten führt. Mit Hilfe dieser Modellsysteme für die Aggregation von aSyn konnte ich zunächst zeigen, dass eine Inhibition der lysosomalen Degradation durch die alkalisierende Substanz BafilomycinA1 (BafA1) eine substantielle Erhöhung der Toxizität zur Folge hatte. Zugleich konnte ein dichotomer Effekt auf die Aggregation von aSyn beobachtet werden, der in einer Reduktion großer intrazellulärer Aggregate und eine Zunahme kleiner und punktueller Strukturen resultierte. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass bestimmte Phasen der Autophagie in die Aggregation von aSyn involviert sind. Interessanterweise konnte dieser Effekt auf die Aggregation und Toxizität von aSyn nicht für andere Inhibitoren der Autophagie gezeigt werden, die an anderen Stufen der Kaskade angreifen. Durch weiterführende Untersuchungen der Effekte des Autophagie Inhibitors BafA1 auf die Aggregation und Toxizität von aSyn konnte eindeutig der hauptsächliche toxische Effekt von aSyn auf die Präsenz extrazellulärer aSyn Spezies zurückgeführt werden und eine Assoziation zwischen der Freisetzung von aSyn und einem BafA1-sensitiven Mechanismus hergestellt werden. Vornehmlich Zellen, die in der direkten Umgebung der aSyn exprimierenden Zellen lagen und naive Zellen, welche zellulärem aSyn ausgesetzt waren, wiesen eine induzierte Toxizität auf. Diese Ergebnisse konnten in BafA1 behandelten aSyn transgenen Mäusen bestätigt werden, bei denen es zu einem Anstieg des extrazellulären aSyn in der Zerebrospinalflüssigkeit kam und zu einer erhöhten neuronalen Schädigung. Die aSyn-vermittelte Toxizität betraf hauptsächlich Zellen in der direkten Umgebung, die jedoch selbst kein aSyn exprimierten, was darauf schließen lässt, dass es sich bei der Freisetzung von aSyn um einen protektiven Mechanismus der Zelle handelt. Eine biochemische Charakterisierung der extrazellulären Spezies nach der BafA1-induzierten lysosomalen Inhibition bringt die verstärkte Toxizität in der direkten Umgebung mit geringer aggregierenden, eher kleinen oligomerisierten Spezies von aSyn in Verbindung, die zudem mit vesikulären Partikeln assoziiert sind. Die Autophagie scheint daher verschiedene Funktionen zu haben: Sie I) erhöht intrazellulär oligomerisierte aSyn Spezies, II) reduziert zur selben Zeit große intrazelluläre Aggregate und III) führt zu einer verstärkten Freisetzung von hauptsächlich oligomerisiertem aSyn, das in Assoziation mit kleinen Vesikeln über spezifische Mechanismen sezerniert wird. Außerdem wurde der hauptsächliche toxische Effekt von extrazellulärem aSyn durch BafA1-sensitive Stufen der Autophagie substantiell verstärkt und diese Effekte konnten für andere ALP Modulatoren nicht gezeigt werden, was bedeutet, dass die Freisetzung von toxischen aSyn Spezies mit späten Phasen der Autophagie verknüpft ist. Diese zellulären Mechanismen der Autophagie rufen eine schädigende Reaktion in der zellulären Umgebung in vivo und in vitro hervor, wie zum Beispiel Neurotoxizität, Inflammation, Astrogliose und die Aufnahme von aSyn. Die neue Rolle der Autophagie für die Verbindung der Degradation und Sekretion von aSyn unterstreicht deutlich die enorme Bedeutung der extrazellulären toxischen Wirkung von aSyn. Eine Balance der Protein-Homöostase durch eine Unterstützung intrazellulärer Degradationswege oder eine Modulation von Sekretionsmechanismen könnte neue therapeutische Strategien ermöglichen, um die Proteinaggregation bei Alters-assoziierten chronischen Erkrankungen zu bewältigen