Evaluation intégrée in vitro et in vivo des effets oestrogéniques de substances environnementales chez le poisson zèbre

L objectif de ce travail est de contribuer à la mise en place d une approche intégrée combinant des outils in vitro et in vivo pour l évaluation des effets oestrogéniques de substances chimiques chez une espèce modèle, le poisson zèbre. Dans ce but, de nouvelles lignées cellulaires de poisson avec gène rapporteur luciférase ont été établies et comparées avec des modèles in vitro existant pour appréhender de possibles différences inter-espèces (récepteurs de truite, humain et poisson zèbre) et/ou inter modèles cellulaires. Dans un premier temps, la comparaison des effets de divers xéno-oestrogènes sur les récepteurs des oestrogènes humains (hER) ou de truite arc-en-ciel (rtER) a mis en évidence la sélectivité de certaines familles de composés pour le rtER, comme les myco-oestrogènes et les dérivés de la benzophénone (BPs) démontrant ainsi l intérêt de l utilisation de modèles spécifiques du poisson pour l évaluation des effets sur les espèces aquatiques. Dans un second temps, trois nouveaux modèles cellulaires spécifiques du poisson zèbre exprimant les trois isoformes du récepteur des oestrogènes du poisson zèbre (zfER) ont été développés dans la lignée hépatique ZFL (zebrafish liver). Ces trois nouvelles lignées cellulaires (ZELH-zfERa, ZELH-zfERb1 et ZELH-zfERb2) ont été caractérisées vis-à-vis de divers ligands de référence, et ont permis de mettre en évidence des affinités variables selon les récepteurs. Dans une dernière partie, ces nouvelles lignées ont été utilisées, en combinaison avec des mesures d effet in vivo pour l évaluation des effets oestrogéniques de 10 BPs, utilisés comme filtres anti-UV dans de nombreux produits et ont récemment été détectés dans l environnement aquatique. Une bonne adéquation est notée entre les effets in vitro des BP sur le zfERb2 et leur capacité à induire in vivo l expression de l aromatase cérébrale (Aro b) au stade larvaire (0 à 5 jours post fertilisation) mesurée à l aide d une lignée de poisson zèbre transgénique exprimant la GFP sous contrôle du promoteur du gène cyp19a1b. Il existe par ailleurs certaines discordances dans les effets oestrogéniques entre les différents niveaux d organisation biologiques. Par exemple, la benzophénone 2 (BP2) est fortement oestrogénique in vitro et in vivo chez le mâle adulte (induction de vitellogénine), mais est sans effet au stade larvaire. En revanche, la BP3 est faiblement oestrogénique in vivo (Vtg) et in vitro uniquement sur le modèle ZELH-zfERb2. En conclusion, cette étude souligne l intérêt de l utilisation combinée d outils de criblage in vitro (e.g. modèles ZELH-zfER) et in vivo (e.g. arob-GFP) permettant une évaluation à différents niveaux d organisation biologique.The aim of the present work is to contribute to the implementation of an integrated in vitro and in vivo approach to evaluate estrogenecity of chemicals in a model fish species, the zebrafish. To achieve this goal, new fish cells lines with luciferase reporter gene were developed and compared with existing in vitro models to evaluate potential inter-species (rainbow trout, human and zebrafish receptors) and/or inter-models differences. First, the comparison of xeno-estrogens effects on human estrogen receptor (hER) or rainbow trout estrogen receptor (rtER) showed the selectivity of some families of compounds for the rtER, including myco-oestrogens and derivatives of benzophenone (BPs), further demonstrating the interest of using specific fish models to assess estrogenic effect of compounds on aquatic species. Then, three specific zebrafish reporter gene models expressing each one of the three subtypes of zebrafish estrogen receptor (zfER) were developed from the liver cell line ZFL (zebrafish liver). These three new cell lines (ZELH-zfERa, ZELH zfERb1-and-ZELH zfERb2) have been characterized toward reference ligands and evidenced selective affinity according to the receptor. Finally, these new cell lines were used together with in vivo assays for the evaluation of estrogenic effects of 10 BPs. The BPs are used as UV filters in sunscreens and were detected in many environmental matrices. In vivo, we measured the expression of vitellogenin (Vtg) in adult male fish exposed during 7 days and the expression of brain aromatase (Aro b) in the larval stage (0-5 days post fertilization), by using transgenic zebrafish expressing GFP under the control of the Aro b promoter (cyp19a1b). This integrated approach has shown an adequacy between BPs in vitro effects on zfERb2 and in vivo effect on aro b. Nevertheless, some discrepancies between the estrogenic effects across levels of biological organization are observed, for example, the benzophenone 2 (BP2) is strongly estrogenic in vitro and in vivo on adult fish but has no effect at the larval stage. Conversely, BP3 had weak estrogenicity in vivo (Vtg) and in vitro only on ZELH-zfERb2. In conclusion, this study highlights the interest of using an integrated in vitro and in vivo approach to assess the estrogenicity of chemicals.PARIS-Museum Hist.Naturelle (751052304) / SudocSudocFranceF

Minéralisation de nanoparticules de TiO2 pour la détermination du titane dans les tissus de rat

International audienceIn order to draw appropriate conclusions about the possible adverse biological effects of titanium dioxide nanoparticles (TiO 2-NPs), the so-called "dose-effect" relationship must be explored. This requires proper quantification of titanium in complex matrices such as animal organs for future toxicological studies. This study presents the method development for mineralizing TiO 2-NPs for analysis of biological tissues. We compared the recovery and quantification limits of the four most commonly used mineralization methods for metal oxides. Microwave-assisted dissolution in an HNO 3-HF mixture followed by H 2 O 2 treatment produced the best results for a TiO 2-NPs suspension, with 96 ± 8% recovery and a limit of quantification as low as 0.9 μg/L. This method was then used for the determination of titanium levels in tissue samples taken from rats. However, our tests revealed that even this method is not sensitive enough for quantifying titanium levels in single olfactory bulbs or hippocampus in control animals.Afin de tirer des conclusions appropriées sur les effets biologiques néfastes possibles des nanoparticules de dioxyde de titane (TiO 2-NP), la relation dite «dose-effet» doit être explorée. Cela nécessite une quantification appropriée du titane dans des matrices complexes telles que des organes animaux pour de futures études toxicologiques. Cette étude présente le développement de la méthode de minéralisation des TiO 2-NP pour l'analyse des tissus biologiques. Nous avons comparé les limites de récupération et de quantification des quatre méthodes de minéralisation les plus couramment utilisées pour les oxydes métalliques. La dissolution assistée par micro-ondes dans un mélange HNO 3-HF suivie d'un traitement H 2 O 2 a donné les meilleurs résultats pour une suspension de TiO 2-NPs, avec une récupération de 96 ± 8% et une limite de quantification aussi basse que 0,9 μg / L. Cette méthode a ensuite été utilisée pour la détermination des niveaux de titane dans des échantillons de tissus prélevés sur des rats. Cependant, nos tests ont révélé que même cette méthode n'est pas assez sensible pour quantifier les niveaux de titane dans les bulbes olfactifs uniques ou l'hippocampe chez les animaux témoins

Selective activation of zebrafish estrogen receptor subtypes by chemicals by using stable reporter gene assay developed in a zebrafish liver cell line.

International audienceThe number of environmental chemical contaminants suspected to act as endocrine disruptor compounds by interacting with estrogen receptor (ER) signaling pathway has been continuously increasing. To study such interaction, the use of stable reporter gene assays is relevant, but species-specific in vitro screening assays are still lacking to address hazard assessment of estrogenic chemicals in aquatic vertebrates. Here, we describe the development of stable reporter gene assays based on stable expression of subtypes of zebrafish ER (zfERα, zfERβ1, and zfERβ2) coupled to estrogen response element-driven luciferase in a zebrafish liver (ZFL) cell line. The three established cell models, named ZELH-zfERα, ZELH-zfERβ1, and ZELH-zfERβ2, expressed stable and significant basal luciferase signal, which was induced by 17β-estradiol (E2) in a sensitive and dose-response manner at EC(50)s of 0.2, 0.03, and 0.05 nM, respectively. In addition, E2 significantly altered cell proliferation in ZELH-zfERα and ZELH-zfERβ2 cells, but not in parental ZFL and ZELH-zfERβ1 cells, suggesting a functionality of these two receptors to modulate endogenous gene expression in the transfected clones. The screening of various xenoestrogens from different classes in the three models resulted in different luciferase response patterns. Natural and synthetic estrogens and 1,1,1-trichloro-2-(2 chlorophenyl)-2-(4-chlorophenyl)ethane were active at lower concentrations in ZELH-zfERβ1 and ZELH-zfERβ2 than in ZELH-zfERα cells, whereas genistein and zearalenone metabolites as well as three benzophenone derivatives preferentially activated zfERα. Altogether, the newly established models provide specific and convenient in vitro tool for comparative assessment of zfERs selective activation by chemicals within ZFL cell context