Evaluation intégrée in vitro et in vivo des effets oestrogéniques de substances environnementales chez le poisson zèbre

Abstract

L objectif de ce travail est de contribuer à la mise en place d une approche intégrée combinant des outils in vitro et in vivo pour l évaluation des effets oestrogéniques de substances chimiques chez une espèce modèle, le poisson zèbre. Dans ce but, de nouvelles lignées cellulaires de poisson avec gène rapporteur luciférase ont été établies et comparées avec des modèles in vitro existant pour appréhender de possibles différences inter-espèces (récepteurs de truite, humain et poisson zèbre) et/ou inter modèles cellulaires. Dans un premier temps, la comparaison des effets de divers xéno-oestrogènes sur les récepteurs des oestrogènes humains (hER) ou de truite arc-en-ciel (rtER) a mis en évidence la sélectivité de certaines familles de composés pour le rtER, comme les myco-oestrogènes et les dérivés de la benzophénone (BPs) démontrant ainsi l intérêt de l utilisation de modèles spécifiques du poisson pour l évaluation des effets sur les espèces aquatiques. Dans un second temps, trois nouveaux modèles cellulaires spécifiques du poisson zèbre exprimant les trois isoformes du récepteur des oestrogènes du poisson zèbre (zfER) ont été développés dans la lignée hépatique ZFL (zebrafish liver). Ces trois nouvelles lignées cellulaires (ZELH-zfERa, ZELH-zfERb1 et ZELH-zfERb2) ont été caractérisées vis-à-vis de divers ligands de référence, et ont permis de mettre en évidence des affinités variables selon les récepteurs. Dans une dernière partie, ces nouvelles lignées ont été utilisées, en combinaison avec des mesures d effet in vivo pour l évaluation des effets oestrogéniques de 10 BPs, utilisés comme filtres anti-UV dans de nombreux produits et ont récemment été détectés dans l environnement aquatique. Une bonne adéquation est notée entre les effets in vitro des BP sur le zfERb2 et leur capacité à induire in vivo l expression de l aromatase cérébrale (Aro b) au stade larvaire (0 à 5 jours post fertilisation) mesurée à l aide d une lignée de poisson zèbre transgénique exprimant la GFP sous contrôle du promoteur du gène cyp19a1b. Il existe par ailleurs certaines discordances dans les effets oestrogéniques entre les différents niveaux d organisation biologiques. Par exemple, la benzophénone 2 (BP2) est fortement oestrogénique in vitro et in vivo chez le mâle adulte (induction de vitellogénine), mais est sans effet au stade larvaire. En revanche, la BP3 est faiblement oestrogénique in vivo (Vtg) et in vitro uniquement sur le modèle ZELH-zfERb2. En conclusion, cette étude souligne l intérêt de l utilisation combinée d outils de criblage in vitro (e.g. modèles ZELH-zfER) et in vivo (e.g. arob-GFP) permettant une évaluation à différents niveaux d organisation biologique.The aim of the present work is to contribute to the implementation of an integrated in vitro and in vivo approach to evaluate estrogenecity of chemicals in a model fish species, the zebrafish. To achieve this goal, new fish cells lines with luciferase reporter gene were developed and compared with existing in vitro models to evaluate potential inter-species (rainbow trout, human and zebrafish receptors) and/or inter-models differences. First, the comparison of xeno-estrogens effects on human estrogen receptor (hER) or rainbow trout estrogen receptor (rtER) showed the selectivity of some families of compounds for the rtER, including myco-oestrogens and derivatives of benzophenone (BPs), further demonstrating the interest of using specific fish models to assess estrogenic effect of compounds on aquatic species. Then, three specific zebrafish reporter gene models expressing each one of the three subtypes of zebrafish estrogen receptor (zfER) were developed from the liver cell line ZFL (zebrafish liver). These three new cell lines (ZELH-zfERa, ZELH zfERb1-and-ZELH zfERb2) have been characterized toward reference ligands and evidenced selective affinity according to the receptor. Finally, these new cell lines were used together with in vivo assays for the evaluation of estrogenic effects of 10 BPs. The BPs are used as UV filters in sunscreens and were detected in many environmental matrices. In vivo, we measured the expression of vitellogenin (Vtg) in adult male fish exposed during 7 days and the expression of brain aromatase (Aro b) in the larval stage (0-5 days post fertilization), by using transgenic zebrafish expressing GFP under the control of the Aro b promoter (cyp19a1b). This integrated approach has shown an adequacy between BPs in vitro effects on zfERb2 and in vivo effect on aro b. Nevertheless, some discrepancies between the estrogenic effects across levels of biological organization are observed, for example, the benzophenone 2 (BP2) is strongly estrogenic in vitro and in vivo on adult fish but has no effect at the larval stage. Conversely, BP3 had weak estrogenicity in vivo (Vtg) and in vitro only on ZELH-zfERb2. In conclusion, this study highlights the interest of using an integrated in vitro and in vivo approach to assess the estrogenicity of chemicals.PARIS-Museum Hist.Naturelle (751052304) / SudocSudocFranceF