Site-specific bioorthogonal modification of antibodies and T cell receptor ligands for use in cancer therapy and research

Cancer is a tremendously heterogeneous and dynamic disease and for that reason challenging to treat. Classical, broad-spectrum therapies like surgery, radiation, chemotherapy and combinations thereof contributed greatly to increased life expectancy of cancer patients. The universality of these therapies makes them applicable for a broad range of cancer types and patients but comes along with the risk of severe side effects or diminished efficacy. The desire for cancer-type-specific drugs and patient- personalized therapies has spurred the development of novel therapeutic concepts. Two very prominent targeted concepts, both inspired by the immune system, are antibody based drugs and immune cell therapy. Antibodies form the structural basis for multiple therapeutic molecules. Three salient formats are addressed in this thesis, namely antiproliferative monoclonal antibodies, bispecific antibodies and antibody-drug conjugates (ADCs). First, a high content assay for parallel investigation of antiproliferative potency and mode of action combining base-analog incorporation and DNA content quantification is described. Second, Tub-tag mediated C-terminal protein- protein-ligation (TuPPL) using complementary click-chemistry handles is demonstrated as a convenient method for bispecific antibody generation. Especially screening of bispecific antibody pairs could be streamlined by combinatorial linkage of individual candidates after protein production. Modification of proteins after expression is currently promoted by the advance of bioorthogonal conjugation strategies. Modification of endogenous amino acids, incorporation of unnatural amino acids and enzymatic modification are widely used for the introduction of universal bioorthogonal handles or direct attachment of functional groups. Along this line, a novel cysteine selective modular bioconjugation method using phosphonamidate electrophiles to generate stable cysteine conjugates is described here. The method was further applied to stably attach cytotoxic drug molecules to antibodies. The resulting ADCs show promising in vitro as well as in vivo efficacy and increased serum stability compared to standard maleimide conjugation. Although antibody based drugs indeed open the therapeutic window by lowering off-target effects as well as increasing tumor specific toxicity they still face limitations. Degradation and systemic clearance of the biomolecule require administration in regular intervals and tissue penetrance is limited by passive diffusion. In contrast, the use of cells as “living drugs” is a revolutionary new concept bypassing some limitations of “dead drugs”. The use of tumor specific immune cells, especially T cells, for cancer therapy shows promising results, however, the “living” nature of these drugs requires thorough characterization of the cell product. Along this line a novel T cell characterization agent, called FLEXamer, is described in this thesis that allows isolation and characterization of antigen specific T cells and associated T cell receptors. FLEXamers retain the high precision of conventional multimer reagents but unite the individual multimers in a single versatile reagent that can be functionalized on demand for the specific need. Taken together this work presents site-specific conjugation methods and novel sensitive tools for production and comprehensive characterization of sensitive and patient-specific next-generation cancer therapeutics.Die Behandlung von Krebs stellt Wissenschaftler vor eine große Herausforderung, da es sich um eine sehr heterogene und dynamische Erkrankung handelt. Mit klassischen Methoden wie operativen Eingriffen, Bestrahlung, Chemotherapie und deren Kombination konnte die Lebenserwartung von Krebspatienten deutlich verlängert werden. Diese Therapieoptionen sind zwar über ein weites Spektrum an Krebserkrankungen einsetzbar, jedoch birgt die geringe Spezifität ein hohes Risiko für Nebenwirkungen oder verminderte Wirksamkeit. Der Wunsch nach Therapeutika, die eine höhere Spezifität für die unterschiedlichen Krebsarten aufweisen und gleichzeitig eine personalisierte Behandlung des einzelnen Patienten erlauben, hat die Entwicklung von neuen therapeutischen Konzepten vorangetrieben. Zwei aktuelle Konzepte, die beide Komponenten des Immunsystems als Grundlage nutzen, sind antikörperbasierte Wirkstoffe und Immunzelltherapie. Antikörper bilden den strukturellen Kern bei einer Vielzahl von therapeutischen Molekülen. Wachstumshemmende monoklonale Antikörper, bispezifische Antikörper und Antikörper-Wirkstoff-Konjugate stellen hierbei die drei Hauptformate dar und werden in dieser Arbeit adressiert. Zuerst wird ein high-content Verfahren beschrieben, welches den Einbau von DNA-Basenanaloga und anschließende Quantifizierung des DNA-Gehalts nutzt, um das Potential eines wachstumshemmenden Antikörpers zu bestimmen. Zusätzlich ermöglicht es Einblicke in dessen Wirkmechanismus zu gewinnen. Ferner wird der Einbau komplementärer Klick-Gruppen mittels Tub-tag Konjugation zur C-terminalen Verknüpfung von Proteinen beschrieben und dessen Eignung zur Herstellung von bispezifischen Antikörpern demonstriert. Vor allem bei der Selektion von geeigneten Antikörperpaaren bietet eine solch modulare Ligationsmethode die Möglichkeit viele Kandidaten kombinatorisch zu verknüpfen nachdem sie individuell exprimiert wurden, um so komfortabel eine Bibliothek von bispezifischen Molekülen zu generieren. Im Allgemeinen wird durch die Entwicklung und Optimierung einer Vielzahl von bioorthogonaler Konjugationsmethoden die Modifikation von Proteinen aktuell stark vorangetrieben. Weit verbreitet ist die Modifikation von endogenen natürlichen Aminosäuren, der Einbau von unnatürlichen Aminosäuren und die enzymatische Modifikation, um entweder direkt eine funktionelle Einheit anzuheften oder um universelle bioorthogonale Gruppen einzubringen. In diesem Zusammenhang wird in dieser Arbeit eine neue cystein-selektive, modulare Biokonjugationsmethode beschrieben, die elektrophile Phosphonamidate verwendet, um stabile Cysteinkonjugate herzustellen. Ferner wird diese Methode zur stabilen Verknüpfung von cytotoxischen Molekülen und Antikörpern verwendet. Die daraus resultierenden Antikörper- Wirkstoff-Konjugate sind sowohl in vitro als auch in vivo aktiv und zeigen darüber hinaus eine erhöhte Plasmastabilität im Verglichen zur standardmäßigen Maleimidkonjugation. Antikörperbasierte Wirkstoffe erweitern zwar wie erwartet das therapeutische Fenster indem sie off-target Effekte reduzieren und zugleich tumor- spezifische Toxizität erhöhen, stoßen jedoch auch auf Limitationen. Biomoleküle werden aktiv abgebaut und aus dem Körper entfernt und erfordern somit eine wiederholte Verabreichung des Therapeutikums in regelmäßigen Zeitabständen. Außerdem ist die Verteilung im Körper hauptsächlich durch passive Effekte bestimmt, wodurch die Penetration in das Gewebe erschwert wird. Im Gegensatz hierzu steht der revolutionär neue Ansatz “lebendige Medikamente” zu verwenden, die aktiv im Körper proliferieren, und somit Limitationen von “leblosen Medikamenten” umgehen. Vielversprechend zeigt sich hier der Einsatz von Immunzellen, allen voran von T Zellen für die Krebstherapie. Die “lebendige” Natur dieser zellbasierten Medikamente erfordert jedoch eine umfassende Charakterisierung bevor sie dem Patienten verabreicht werden. In diesem Zusammenhang wird in dieser Arbeit ein neues Multimerreagenz, namens FLEXamer, zur Isolierung und Charakterisierung von T Zellen und deren T Zellrezeptoren beschrieben. FLEXamere erhalten die hohe Präzision von konventionellen Multimerreagenzien, vereinen jedoch die unterschiedlichen Multimere in einem einzigen vielseitigen Reagenz, das bedarfsgerecht, individuell funktionalisiert werden kann. Zusammenfassend beschäftigt sich diese Arbeit mit ortsgerichteten Biokonjugationsmethoden und neuen sensitiven Werkzeugen zur Herstellung und umfassenden Charakterisierung von sensitiven und patientenspezifischen Krebstherapeutika der nächsten Generation

Site-specific bioorthogonal modification of antibodies and T cell receptor ligands for use in cancer therapy and research

Cancer is a tremendously heterogeneous and dynamic disease and for that reason challenging to treat. Classical, broad-spectrum therapies like surgery, radiation, chemotherapy and combinations thereof contributed greatly to increased life expectancy of cancer patients. The universality of these therapies makes them applicable for a broad range of cancer types and patients but comes along with the risk of severe side effects or diminished efficacy. The desire for cancer-type-specific drugs and patient- personalized therapies has spurred the development of novel therapeutic concepts. Two very prominent targeted concepts, both inspired by the immune system, are antibody based drugs and immune cell therapy. Antibodies form the structural basis for multiple therapeutic molecules. Three salient formats are addressed in this thesis, namely antiproliferative monoclonal antibodies, bispecific antibodies and antibody-drug conjugates (ADCs). First, a high content assay for parallel investigation of antiproliferative potency and mode of action combining base-analog incorporation and DNA content quantification is described. Second, Tub-tag mediated C-terminal protein- protein-ligation (TuPPL) using complementary click-chemistry handles is demonstrated as a convenient method for bispecific antibody generation. Especially screening of bispecific antibody pairs could be streamlined by combinatorial linkage of individual candidates after protein production. Modification of proteins after expression is currently promoted by the advance of bioorthogonal conjugation strategies. Modification of endogenous amino acids, incorporation of unnatural amino acids and enzymatic modification are widely used for the introduction of universal bioorthogonal handles or direct attachment of functional groups. Along this line, a novel cysteine selective modular bioconjugation method using phosphonamidate electrophiles to generate stable cysteine conjugates is described here. The method was further applied to stably attach cytotoxic drug molecules to antibodies. The resulting ADCs show promising in vitro as well as in vivo efficacy and increased serum stability compared to standard maleimide conjugation. Although antibody based drugs indeed open the therapeutic window by lowering off-target effects as well as increasing tumor specific toxicity they still face limitations. Degradation and systemic clearance of the biomolecule require administration in regular intervals and tissue penetrance is limited by passive diffusion. In contrast, the use of cells as “living drugs” is a revolutionary new concept bypassing some limitations of “dead drugs”. The use of tumor specific immune cells, especially T cells, for cancer therapy shows promising results, however, the “living” nature of these drugs requires thorough characterization of the cell product. Along this line a novel T cell characterization agent, called FLEXamer, is described in this thesis that allows isolation and characterization of antigen specific T cells and associated T cell receptors. FLEXamers retain the high precision of conventional multimer reagents but unite the individual multimers in a single versatile reagent that can be functionalized on demand for the specific need. Taken together this work presents site-specific conjugation methods and novel sensitive tools for production and comprehensive characterization of sensitive and patient-specific next-generation cancer therapeutics.Die Behandlung von Krebs stellt Wissenschaftler vor eine große Herausforderung, da es sich um eine sehr heterogene und dynamische Erkrankung handelt. Mit klassischen Methoden wie operativen Eingriffen, Bestrahlung, Chemotherapie und deren Kombination konnte die Lebenserwartung von Krebspatienten deutlich verlängert werden. Diese Therapieoptionen sind zwar über ein weites Spektrum an Krebserkrankungen einsetzbar, jedoch birgt die geringe Spezifität ein hohes Risiko für Nebenwirkungen oder verminderte Wirksamkeit. Der Wunsch nach Therapeutika, die eine höhere Spezifität für die unterschiedlichen Krebsarten aufweisen und gleichzeitig eine personalisierte Behandlung des einzelnen Patienten erlauben, hat die Entwicklung von neuen therapeutischen Konzepten vorangetrieben. Zwei aktuelle Konzepte, die beide Komponenten des Immunsystems als Grundlage nutzen, sind antikörperbasierte Wirkstoffe und Immunzelltherapie. Antikörper bilden den strukturellen Kern bei einer Vielzahl von therapeutischen Molekülen. Wachstumshemmende monoklonale Antikörper, bispezifische Antikörper und Antikörper-Wirkstoff-Konjugate stellen hierbei die drei Hauptformate dar und werden in dieser Arbeit adressiert. Zuerst wird ein high-content Verfahren beschrieben, welches den Einbau von DNA-Basenanaloga und anschließende Quantifizierung des DNA-Gehalts nutzt, um das Potential eines wachstumshemmenden Antikörpers zu bestimmen. Zusätzlich ermöglicht es Einblicke in dessen Wirkmechanismus zu gewinnen. Ferner wird der Einbau komplementärer Klick-Gruppen mittels Tub-tag Konjugation zur C-terminalen Verknüpfung von Proteinen beschrieben und dessen Eignung zur Herstellung von bispezifischen Antikörpern demonstriert. Vor allem bei der Selektion von geeigneten Antikörperpaaren bietet eine solch modulare Ligationsmethode die Möglichkeit viele Kandidaten kombinatorisch zu verknüpfen nachdem sie individuell exprimiert wurden, um so komfortabel eine Bibliothek von bispezifischen Molekülen zu generieren. Im Allgemeinen wird durch die Entwicklung und Optimierung einer Vielzahl von bioorthogonaler Konjugationsmethoden die Modifikation von Proteinen aktuell stark vorangetrieben. Weit verbreitet ist die Modifikation von endogenen natürlichen Aminosäuren, der Einbau von unnatürlichen Aminosäuren und die enzymatische Modifikation, um entweder direkt eine funktionelle Einheit anzuheften oder um universelle bioorthogonale Gruppen einzubringen. In diesem Zusammenhang wird in dieser Arbeit eine neue cystein-selektive, modulare Biokonjugationsmethode beschrieben, die elektrophile Phosphonamidate verwendet, um stabile Cysteinkonjugate herzustellen. Ferner wird diese Methode zur stabilen Verknüpfung von cytotoxischen Molekülen und Antikörpern verwendet. Die daraus resultierenden Antikörper- Wirkstoff-Konjugate sind sowohl in vitro als auch in vivo aktiv und zeigen darüber hinaus eine erhöhte Plasmastabilität im Verglichen zur standardmäßigen Maleimidkonjugation. Antikörperbasierte Wirkstoffe erweitern zwar wie erwartet das therapeutische Fenster indem sie off-target Effekte reduzieren und zugleich tumor- spezifische Toxizität erhöhen, stoßen jedoch auch auf Limitationen. Biomoleküle werden aktiv abgebaut und aus dem Körper entfernt und erfordern somit eine wiederholte Verabreichung des Therapeutikums in regelmäßigen Zeitabständen. Außerdem ist die Verteilung im Körper hauptsächlich durch passive Effekte bestimmt, wodurch die Penetration in das Gewebe erschwert wird. Im Gegensatz hierzu steht der revolutionär neue Ansatz “lebendige Medikamente” zu verwenden, die aktiv im Körper proliferieren, und somit Limitationen von “leblosen Medikamenten” umgehen. Vielversprechend zeigt sich hier der Einsatz von Immunzellen, allen voran von T Zellen für die Krebstherapie. Die “lebendige” Natur dieser zellbasierten Medikamente erfordert jedoch eine umfassende Charakterisierung bevor sie dem Patienten verabreicht werden. In diesem Zusammenhang wird in dieser Arbeit ein neues Multimerreagenz, namens FLEXamer, zur Isolierung und Charakterisierung von T Zellen und deren T Zellrezeptoren beschrieben. FLEXamere erhalten die hohe Präzision von konventionellen Multimerreagenzien, vereinen jedoch die unterschiedlichen Multimere in einem einzigen vielseitigen Reagenz, das bedarfsgerecht, individuell funktionalisiert werden kann. Zusammenfassend beschäftigt sich diese Arbeit mit ortsgerichteten Biokonjugationsmethoden und neuen sensitiven Werkzeugen zur Herstellung und umfassenden Charakterisierung von sensitiven und patientenspezifischen Krebstherapeutika der nächsten Generation

A Simple and Sensitive High-Content Assay for the Characterization of Antiproliferative Therapeutic Antibodies

Monoclonal antibodies (mAbs) have become a central class of therapeutic agents in particular as antiproliferative compounds. Their often complex modes of action require sensitive assays during early, functional characterization. Current cell-based proliferation assays often detect metabolites that are indicative of metabolic activity but do not directly account for cell proliferation. Measuring DNA replication by incorporation of base analogues such as 5-bromo-2-deoxyuridine (BrdU) fills this analytical gap but was previously restricted to bulk effect characterization in enzyme-linked immunosorbent assay formats. Here, we describe a cell-based assay format for the characterization of antiproliferative mAbs regarding potency and mode of action in a single experiment. The assay makes use of single cell-based high-content-analysis (HCA) for the reliable quantification of replicating cells and DNA content via 5-ethynyl-2-deoxyuridine (EdU) and 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), respectively, as sensitive measures of antiproliferative mAb activity. We used trastuzumab, an antiproliferative therapeutic antibody interfering with HER2 cell surface receptor-mediated growth signal transduction, and HER2-overexpressing cell lines BT474 and SKBR3 to demonstrate up to 10-fold signal-to-background (S/B) ratios for treated versus untreated cells and a shift in cell cycle profiles indicating antibody-induced cell cycle arrest. The assay is simple, cost-effective, and sensitive, providing a cell-based format for preclinical characterization of therapeutic mAbs

Systematic analysis of the binding behaviour of UHRF1 towards different methyl- and carboxylcytosine modification patterns at CpG dyads

The multi-domain protein UHRF1 is essential for DNA methylation maintenance and binds DNA via a base-flipping mechanism with a preference for hemi-methylated CpG sites. We investigated its binding to hemi- and symmetrically modified DNA containing either 5-methylcytosine (mC), 5-hydroxymethylcytosine (hmC), 5-formylcytosine (fC), or 5-carboxylcytosine (caC). Our experimental results indicate that UHRF1 binds symmetrically carboxylated and hybrid methylated/carboxylated CpG dyads in addition to its previously reported substrates. Complementary molecular dynamics simulations provide a possible mechanistic explanation of how the protein could differentiate between modification patterns. First, we observe different local binding modes in the nucleotide binding pocket as well as the protein's NKR finger. Second, both DNA modification sites are coupled through key residues within the NKR finger, suggesting a communication pathway affecting protein-DNA binding for carboxylcytosine modifications. Our results suggest a possible additional function of the hemi-methylation reader UHRF1 through binding of carboxylated CpG sites. This opens the possibility of new biological roles of UHRF1 beyond DNA methylation maintenance and of oxidised methylcytosine derivates in epigenetic regulation

Antikörperkonjugate — Präzisionswerkzeuge mit grenzenloser Vielfalt

Antibody conjugates are a prime example of Aristotle’s famous quote: “The whole is more than the sum of its parts”. Connecting the antibody’s high binding specificity with molecules such as toxins, dyes and nucleic acids opens the doors wide to a world of high precision molecules with high versatility. In this article, we outline the concept of antibody conjugates, describe why the conjugation method matters and introduce two prominent examples that have made their way into the clinic and research labs

Characterisation, phase-stability and surface chemical properties of photocatalytic active Zr and Y co-doped anatase TiO2 nanoparticles

We report on the characterization, phase stability, surface chemical andphotocatalytic properties of Zr and Y co-doped anatase TiO2 nanoparticles prepared by homogenous hydrolysis methods using urea as precipitating agent. The materials were analyzed by scanning electron microscopy, X-ray diffraction, Raman spectroscopy, BET isotherm and BJH pore size distribution measurements. It is shown that Y and Zr ions replace Ti ions in the anatase TiO2 structures up to a critical total dopant concentration of approximately 13 wt%. The co-doped particles show increased phase stability compared to pure anatase TiO2nanoparticles. The anatase to rutile phase transformation is shown to be preceded by cation segregation and dissolution with concomitant precipitation of Y2Ti2-xZrxO7 and ZrTiO4. Co-doping modifies the optical absorption edge with a resulting attenuation of the Urbach tail. The band gap is slightly blue-shifted at high doping concentrations, and red shifted at lower doping concentrations. Formic acid adsorption was used as a probe molecule to investigate surfacechemical properties and adsorbate structures. It was found that the relative abundance ofmonodentate formate compared to bidentate coordinated formate decreases with increasing doping concentration. This is attributed to an increased surface acidity with increasing dopant concentration. Photodegradation of formic acid occurred on all samples. With mode-resolved in situ FTIR spectroscopy it is shown that the rate of photodegradation of monodentate formate species are higher than for bidentate formate species. Thus our results show that the trend ofdecreasing photo-degradation rate with increasing dopant concentration can be explained by the adsorbate structure, which is controlled by the acidity of the surface.

HP1β carries an acidic linker domain and requires H3K9me3 for phase separation.

Liquid-liquid phase separation (LLPS) mediated formation of membraneless organelles has been proposed to coordinate biological processes in space and time. Previously, the formation of phase-separated droplets was described as a unique property of HP1α. Here, we demonstrate that the positive net charge of the intrinsically disordered hinge region (IDR-H) of HP1 proteins is critical for phase separation and that the exchange of four acidic amino acids is sufficient to confer LLPS properties to HP1β. Surprisingly, the addition of mono-nucleosomes promoted H3K9me3-dependent LLPS of HP1β which could be specifically disrupted with methylated but not acetylated H3K9 peptides. HP1β mutants defective in H3K9me3 binding were less efficient in phase separationand failed to accumulate at heterochromatin . We propose that multivalent interactions of HP1β with H3K9me3-modified nucleosomes via its chromodomain and dimerization via its chromoshadow domain enable phase separation and contribute to the formation of heterochromatin compartments 

No Evidence for Ionotropic Pheromone Transduction in the Hawkmoth Manduca sexta.

Insect odorant receptors (ORs) are 7-transmembrane receptors with inverse membrane topology. They associate with the conserved ion channel Orco. As chaperon, Orco maintains ORs in cilia and, as pacemaker channel, Orco controls spontaneous activity in olfactory receptor neurons. Odorant binding to ORs opens OR-Orco receptor ion channel complexes in heterologous expression systems. It is unknown, whether this also occurs in vivo. As an alternative to this ionotropic transduction, experimental evidence is accumulating for metabotropic odor transduction, implicating that insect ORs couple to G-proteins. Resulting second messengers gate various ion channels. They generate the sensillum potential that elicits phasic-tonic action potentials (APs) followed by late, long-lasting pheromone responses. Because it is still unclear how and when Orco opens after odor-OR-binding, we used tip recordings to examine in vivo the effects of the Orco antagonist OLC15 and the amilorides MIA and HMA on bombykal transduction in the hawkmoth Manduca sexta. In contrast to OLC15 both amilorides decreased the pheromone-dependent sensillum potential amplitude and the frequency of the phasic AP response. Instead, OLC15 decreased spontaneous activity, increased latencies of phasic-, and decreased frequencies of late, long-lasting pheromone responses Zeitgebertime-dependently. Our results suggest no involvement for Orco in the primary transduction events, in contrast to amiloride-sensitive channels. Instead of an odor-gated ionotropic receptor, Orco rather acts as a voltage- and apparently second messenger-gated pacemaker channel controlling the membrane potential and hence threshold and kinetics of the pheromone response