Quantitative Proteome Profiling of C. burnetii under Tetracycline Stress Conditions

The recommended antibiotic regimen against Coxiella burnetii, the etiological agent of Q fever, is based on a semi-synthetic, second-generation tetracycline, doxycycline. Here, we report on the comparison of the proteomes of a C. burnetii reference strain either cultured under control conditions or under tetracycline stress conditions. Using the MS-driven combined fractional diagonal chromatography proteomics technique, out of the 531 proteins identified, 5 and 19 proteins were found significantly up- and down-regulated respectively, under tetracycline stress. Although the predicted cellular functions of these regulated proteins did not point to known tetracycline resistance mechanisms, our data clearly reveal the plasticity of the proteome of C. burnetii to battle tetracycline stress. Finally, we raise several plausible hypotheses that could further lead to more focused experiments on studying tetracycline resistance in C. burnetii and thus reduced treatment failures of Q fever

Μελέτη της σχέσης της σωματοστατίνης και του μονοξειδίου του αζώτου στον αμφιβληστροειδή ποντικού

Somatostatin is a neuropeptide widely distributed in the central and peripheral nervous system. It mediates a diverse number of physiological actions by interacting with specific receptors in the plasma membrane, namely SSTR1-5. These receptors belong to the family of G protein-coupled receptors and can couple to diverse signal transduction pathways. Somatostatin and its receptors are found in the retina. Recent evidence suggested the involvement of SSTR2A and SSTR2B receptors in the regulation of nitric oxide (Vasilaki et al., 2001). Subsequent studies showed that somatostatin increased nitric oxide production by an SSTR2 mechanism (Vasilaki et al., 2002). In the present study, we examined first the relationship of somatostatin and nitric oxide in the retina of wild type mice. Subsequently, we used somatostatin deficient mice in order to substantiate the role of somatostatin on NO physiology. Immunohistochemical studies were performed employing polyclonal antibodies against SSTR2A and nNOS, the neuronal isotype of the nitric oxide synthase. NADPH-diaphorase was assessed histochemically. Double labeling experiments of NADPH-diaphorase staining with SSTR2A receptor, as well as with markers of retinal cell types (PKC and MAP-1A) were performed. A morphometric study of retinal sections stained with NADPH-diaphorase was performed to detect possible differences between retinas of wild type and somatostatin deficient mice. Different ages of pairs of animals were examined. Our results showed that the SSTR2A receptor was colocalised with NADPH-diaphorase in rod bipolar cells of the mouse retina. nNOS was detected only in amacrine cells suggesting the presence of the other enzyme isoforms in the mouse retina. Morphometry measurements of retinas stained with NADPH-diaphorase showed that the thickness of the retinas was increased in somatostatin deficient mice as compared to wild type mice (age 0.5months). This increase was not observed in adult mice. These findings suggest that somatostatin acting through SSTR2A receptors may affect nitric oxide production in the mouse retina.Η σωματοστατίνη είναι ένα νευροπεπτίδιο που κατανέμεται ευρέως στο κεντρικό και το περιφερικό νευρικό σύστημα. Ασκεί τις δράσεις της αλληλεπιδρώντας με πέντε υποδοχείς που ονομάζονται SSTR1-5. Oι υποδοχείς SSTRs ανήκουν στην οικογένεια των υποδοχέων που συζευγνύονται με τις G πρωτεΐνες, και επομένως μπορούν να επηρεάσουν πολλά μονοπάτια μεταγωγής σήματος. Η σωματοστατίνη και οι υποδοχείς της απαντώνται στον αμφιβληστροειδή. Από πρόσφατες ενδείξεις υποστηρίχθηκε η εμπλοκή των υποδοχέων SSTR2A και SSTR2B στη ρύθμιση του μονοξειδίου του αζώτου (ΝΟ) (Vasilaki et al., 2001, 2002). Στην παρούσα μελέτη μελετήθηκε αρχικά η σχέση της σωματοστατίνης και του ΝΟ στον αμφιβληστροειδή ποντικού άγριου τύπου, και στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν ποντίκια ελλιπή ως προς το γονίδιο της σωματοστατίνης. Πολυκλωνικά αντισώματα έναντι του SSTR2A υποδοχέα και της nNOS, της νευρωνικής ισομορφής του ενζύμου που παράγει το ΝΟ, χρησιμοποιήθηκαν σε ιστολογικές τομές αμφιβληστροειδή. Η δραστικότητα της NADPH-διαφοράσης προσδιορίστηκε ιστοχημικά. Πραγματοποιήθηκαν πειράματα διπλής εντόπισης με τη χρώση της NADPH-διαφοράσης και του SSTR2A υποδοχέα, καθώς και με διάφορους μάρτυρες των κυττάρων του αμφιβληστροειδή (PKC και MAP-1A). Πραγματοποιήθηκε μορφομετρική μελέτη ιστολογικών τομών αμφιβληστροειδή χρωσμένων με την NADPH-διαφοράση προκειμένου να ανιχνευτούν πιθανές διαφορές μεταξύ ζώων άγριου τύπου και ελλιπών ως προς το γονίδιο της σωματοστατίνης. Χρησιμοποιήθηκαν ζεύγη ζώων διαφόρων ηλικιών. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο SSTR2A υποδοχέας συνεντοπίζεται με την NADPH-διαφοράση στα δίπολα κύτταρα που σχετίζονται με τα ραβδία. Η nNOS εντοπίστηκε σε βραχύινα κύτταρα γεγονός που είναι σε μερική συμφωνία με τη χρώση της NADPH-διαφοράσης. Μορφομετρικές μετρήσεις αμφιβληστροειδών με χρώση NADPH-διαφοράσης έδειξαν ότι το πάχος του αμφιβλη- στροειδή ήταν αυξημένο σε ζώα με έλλειψη σωματοστατίνης σε σύγκριση με ζώα άγριου τύπου (ηλικίας 0.5 μηνών). Το εύρημα αυτό δεν επιβεβαιώθηκε σε ποντικούς μεγαλύτερης ηλικίας. Τα ευρήματα αυτά υποστηρίζουν ότι η σωματοστατίνη δρώντας μέσω των SSTR2A υποδοχέων μπορεί να επηρεάζει την παραγωγή του ΝΟ στον αμφιβληστροειδή ποντικού

Study of molecular mechanisms of the pathogenesis of the Q fever agent coxiella burnetii, an intracellular bacterium

Η Coxiella burnetii είναι ένα υποχρεωτικά ενδοκυττάριο Gram-αρνητικό βακτήριο που επιβιώνει και πολλαπλασιάζεται στο φαγολυσόσωμα του κυττάρου ξενιστή, και αποτελεί τον αιτιολογικό παράγοντα του πυρετού Q. Στον άνθρωπο ο πυρετός Q παρουσιάζεται με ευρύ φάσμα κλινικών εκδηλώσεων και η αιτία αυτού του πολυμορφισμού δεν έχει διευκρινιστεί μέχρι σήμερα. Ενώ έχει αναγνωριστεί η συμβολή προδιαθεσικών παραγόντων του ξενιστή στην έκβαση της νόσου, δεν μπορούν να αποκλεισθούν και μοναδικοί παράγοντες του βακτηρίου. Αυτό στηρίζεται στη γενετική ετερογένεια που επιδεικνύουν τα διαφορετικά στελέχη C. burnetii σε γονίδια παθογένειας (Bear et al, 2009, Voth et al, 2009), καθώς και στην έκφραση ενός ιδιαίτερου λοιμογόνου δυναμικού κάθε στελέχους σε μοντέλα του πυρετού Q σε ζώα (Russell-Lodrigue et al, 2009). Υπάρχει έλλειψη μελετών, ωστόσο, όσον αφορά στην ετερογένεια των στελεχών C. burnetii σε επίπεδο πρωτεϊνών, των βασικών τελεστών όλων των κυτταρικών διεργασιών. Τα ερωτήματα που τέθηκαν στην παρούσα διατριβή είναι τα εξής: 1) Πως διαφοροποιείται η πρωτεϊνική σύσταση μεταξύ διαφορετικών στελεχών C. burnetii; 2) Πως αποκρίνεται το κύτταρο ξενιστής στη μόλυνση με διαφορετικά στελέχη C. burnetii; Για να δοθεί απάντηση επιλέχθηκαν 2 στελέχη αναφοράς που έχουν συσχετιστεί με διαφορετικές μορφές του πυρετού Q και χρησιμοποιήθηκε η πρωτεομική προσέγγιση. Από την ανάλυση των αποτελεσμάτων προέκυψε ότι τα στελέχη C. burnetii παρουσιάζουν διαφορές σε λοιμογόνους παράγοντες, υποδηλώνοντας μία περισσότερο ή λιγότερο επιθετική συμπεριφορά για το κάθε στέλεχος, ενώ επιδεικνύουν ένα διαφορετικό προφίλ ενδοκυττάριας αύξησης και παρασιτισμού υπογραμμίζοντας την διαφορετική πηγή προέλευσής τους. Η διάγνωση του πυρετού Q στηρίζεται σε ορολογικές μεθόδους οι οποίες χρησιμοποιούν ως αντιγόνο ολόκληρο βακτήριο με αποτέλεσμα χαμηλότερη ειδικότητα. Συνεπώς υπάρχει ανάγκη για ειδικά αντιγόνα και για το λόγο αυτό ο επόμενος στόχος της μελέτης ήταν η ανάπτυξη μεθοδολογίας για την ανίχνευση ειδικών αντιγόνων του πυρετού Q.The etiological agent of Q fever is Coxiella burnetii, an obligatory intracellular Gram-negative bacterium, the only known to date that survives and replicates within the eukaryotic phagolysosome. Human Q fever exhibits a wide range of clinical manifestations and the reason for this polymorphism has not been clarified so far. Predisposing host factors are critical to the clinical outcome of the disease, but it is quite possible that unique bacterial factors are also important. The latter is supported by the genetic diversity which is displayed between Coxiella burnetii strains (Bear et al, 2009, Voth et al, 2009) and a distinction in strain virulence in models of acute Q fever (Russell-Lodrigue et al, 2009). However, proteins are the final operators of every cellular process and there is a lack of studies of C. burnetii strains in the protein level. The questions that were set in this project are the followings: 1) How does protein composition differentiate between different C. burnetii strains? 2) How does the host cell respond to infection with different C. burnetii strains? To answer these questions, two C. burnetii strains which have been isolated from different sources and are associated with different clinical forms of Q fever, were used and studied by the proteomic approach. Data analysis revealed important virulence factors that were differentiated between the two strains, suggesting a more or less aggressive biological behavior for each strain. Moreover the two C. burnetii strains displayed a different profile of intracellular growth and parasitism, underlying their different source of origin. Q fever diagnosis is mainly based on serological tests. Whole cell bacterium C. burnetii is used as antigen in these tests resulting in lower specificity. Consequently there is a need for more specific antigens, thus the next goal of this project was the development of a protocol for the detection of new serodiagnostic markers of Q fever. This goal was achieved using an immunoproteomic approach

Study of molecular mechanisms of pathogenesis of the Q fever agent coxiella burnetii, an intracellular bacterium

The etiological agent of Q fever is Coxiella burnetii, an obligatory intracellular Gram-negative bacterium, the only known to date that survives and replicates within the eukaryotic phagolysosome. Human Q fever exhibits a wide range of clinical manifestations and the reason for this polymorphism has not been clarified so far. Predisposing host factors are critical to the clinical outcome of the disease, but it is quite possible that unique bacterial factors are also important. The latter is supported by the genetic diversity which is displayed between Coxiella burnetii strains (Bear et al, 2009, Voth et al, 2009) and a distinction in strain virulence in models of acute Q fever (Russell-Lodrigue et al, 2009). However, proteins are the final operators of every cellular process and there is a lack of studies of C. burnetii strains in the protein level. The questions that were set in this project are the followings: 1) How does protein composition differentiate between different C. burnetii strains? 2) How does the host cell respond to infection with different C. burnetii strains? To answer these questions, two C. burnetii strains which have been isolated from different sources and are associated with different clinical forms of Q fever, were used and studied by the proteomic approach. Data analysis revealed important virulence factors that were differentiated between the two strains, suggesting a more or less aggressive biological behavior for each strain. Moreover the two C. burnetii strains displayed a different profile of intracellular growth and parasitism, underlying their different source of origin. Q fever diagnosis is mainly based on serological tests. Whole cell bacterium C. burnetii is used as antigen in these tests resulting in lower specificity. Consequently there is a need for more specific antigens, thus the next goal of this project was the development of a protocol for the detection of new serodiagnostic markers of Q fever. This goal was achieved using an immunoproteomic approach.Η Coxiella burnetii είναι ένα υποχρεωτικά ενδοκυττάριο Gram-αρνητικό βακτήριο που επιβιώνει και πολλαπλασιάζεται στο φαγολυσόσωμα του κυττάρου ξενιστή, και αποτελεί τον αιτιολογικό παράγοντα του πυρετού Q. Στον άνθρωπο ο πυρετός Q παρουσιάζεται με ευρύ φάσμα κλινικών εκδηλώσεων και η αιτία αυτού του πολυμορφισμού δεν έχει διευκρινιστεί μέχρι σήμερα. Ενώ έχει αναγνωριστεί η συμβολή προδιαθεσικών παραγόντων του ξενιστή στην έκβαση της νόσου, δεν μπορούν να αποκλεισθούν και μοναδικοί παράγοντες του βακτηρίου. Αυτό στηρίζεται στη γενετική ετερογένεια που επιδεικνύουν τα διαφορετικά στελέχη C. burnetii σε γονίδια παθογένειας (Bear et al, 2009, Voth et al, 2009), καθώς και στην έκφραση ενός ιδιαίτερου λοιμογόνου δυναμικού κάθε στελέχους σε μοντέλα του πυρετού Q σε ζώα (Russell-Lodrigue et al, 2009). Υπάρχει έλλειψη μελετών, ωστόσο, όσον αφορά στην ετερογένεια των στελεχών C. burnetii σε επίπεδο πρωτεϊνών, των βασικών τελεστών όλων των κυτταρικών διεργασιών. Τα ερωτήματα που τέθηκαν στην παρούσα διατριβή είναι τα εξής: 1) Πως διαφοροποιείται η πρωτεϊνική σύσταση μεταξύ διαφορετικών στελεχών C. burnetii; 2) Πως αποκρίνεται το κύτταρο ξενιστής στη μόλυνση με διαφορετικά στελέχη C. burnetii; Για να δοθεί απάντηση επιλέχθηκαν 2 στελέχη αναφοράς που έχουν συσχετιστεί με διαφορετικές μορφές του πυρετού Q και χρησιμοποιήθηκε η πρωτεομική προσέγγιση. Από την ανάλυση των αποτελεσμάτων προέκυψε ότι τα στελέχη C. burnetii παρουσιάζουν διαφορές σε λοιμογόνους παράγοντες, υποδηλώνοντας μία περισσότερο ή λιγότερο επιθετική συμπεριφορά για το κάθε στέλεχος, ενώ επιδεικνύουν ένα διαφορετικό προφίλ ενδοκυττάριας αύξησης και παρασιτισμού υπογραμμίζοντας την διαφορετική πηγή προέλευσής τους. Η διάγνωση του πυρετού Q στηρίζεται σε ορολογικές μεθόδους οι οποίες χρησιμοποιούν ως αντιγόνο ολόκληρο βακτήριο με αποτέλεσμα χαμηλότερη ειδικότητα. Συνεπώς υπάρχει ανάγκη για ειδικά αντιγόνα και για το λόγο αυτό ο επόμενος στόχος της μελέτης ήταν η ανάπτυξη μεθοδολογίας για την ανίχνευση ειδικών αντιγόνων του πυρετού Q

The membrane complexome of a new Pseudomonas strain during growth on lysogeny broth medium and medium containing glucose or phenol

In this study, we have performed a systematic analysis of Pseudomonas sp. strain phDV1 membrane protein complexes by growing the strain in lysogeny broth medium, and medium containing glucose or phenol as sole carbon sources. In order to study the membrane complexome, we developed an approach for the extraction and the analysis of the membrane protein complexes in native conditions. Our strategy involves (a) enrichment of the membrane proteome from Pseudomonas sp. strain phDV1 by two washing steps; (b) solubilization using n-dodecyl-β-maltoside; (c) a combination of BN-PAGE with Tricine-SDS-PAGE; and (d) protein identification of tryptic peptides by mass spectrometry

Identification of potentially involved proteins in levofloxacin resistance mechanisms in Coxiella burnetii

The etiological agent of Q fever, Coxiella burnetii, is an obligate intracellular bacterium that multiplies within a phagosome-like parasitophorous vacuole. Fluoroquinolones have been used as an alternative therapy for Q fever. Resistance to fluoroquinolones can arise via several mechanisms utilized by pathogens to avoid killing. Until today, genome-based studies have shown that the main mechanism of C. burnetii to resist inhibition by fluoroquinolones is based on mutations in quinolone-resistance-determining region (QRDR). In this study, in a broader search at the protein level for C. burnetii mechanisms that confer resistance to fluoroquinolones, the proteomes of in vitro developed fluoroquinolone resistant bacteria and susceptible bacteria were compared using the MS-driven combined fractional diagonal chromatography (COFRADIC) proteomics technique. Quantitative comparison of the 381 proteins identified in both strains indicated the different expression of 15 bacterial proteins. These proteins are involved in different cellular processes indicating that the antibiotic resistance mechanism of the bacterium is a multifaceted process

Statistical analysis using 95% confidence settings for determining the limits of protein log2 ratio values linked to differential regulation.

<p>These limits are >3.415 and <−1.234. Thus, a protein with a value <−1.234 indicates higher abundance upon antibiotic stress, whereas a protein with a value >3.415 indicates higher abundances in the absence of antibiotic.</p

The filtering criteria used for protein identification.

<p>The filtering criteria used for protein identification.</p