Validation Strategy as a Part of the European Gas Network Protection

The European gas network currently includes approximately 200,000 km high pressure transmission and distribution pipelines. The needs and requirements of this network are focused on risk-based security asset management, impacts and cascading effects of cyber-physical attacks on interdependent and interconnected European Gas grids. The European SecureGas project tackles these issues by implementing, updating, and incrementally improving extended components, which are contextualized, customized, deployed, demonstrated and validated in three business cases, according to scenarios defined by the end-users. Just validation is considered to be a key end activity, the essence of which is the evaluation of the proposed solution to determine whether it satisfies specified requirements. Therefore, the chapter deals with the validation strategy that can be implemented for the verification of these objectives and evaluation of technological based solutions which aim to strengthen the resilience of the European gas network

Structural features of potential type III secretion chaperones and their complexes

Type III secretion systems (T3SSs) are essential mediators of the interaction of many Gram-negative bacteria with plant or animal eukaryotic cells. The T3SS pathway of plant pathogens is encoded by hrp (HR and pathogenicity) and hrc (HR and conserved) genes. The Hrc proteins direct secretion of T3SS substrates across the bacterial envelope, whereas a subset of the Hrp proteins, whose function is only partially defined, are themselves secreted by the T3SS and direct the translocation of effectors through host cell barriers. HrpG is a hypothetical class I T3SS chaperone as predicted by fold recognition algorithms and Pseudomonas syringae T3SS genes organization. Small angle X-ray scattering and circular dichroism experiments were used for evaluation of this hypothesis. In contradistinction to the homodimeric class I T3SS chaperones, HrpG forms a tetramer in solution. However the protein particle does not possess the symmetry of a closed tetrameric complex. Deletion of the 14 carboxyterminal residues led to the formation of a stable dimer in solution with the appropriate symmetry. Although the dimeric particle possesses the overall shape of class I T3SS chaperones, we could not conclusively propose that HrpG belongs to this class of chaperones because of its longer diameter and the higher content of α-helix. Moreover, HrpG was found to interact with HrpO and the carboxyterminal domain of HrcU through native electrophoresis. HrpO is a highly soluble protein of the T3SS of P. syringae pv phaseolicola. Size exclusion chromatography profiles resemble those obtained by FliJ (Fraser et al. 2003). Thus, an aberrant elution profile was also demonstrated for HrpO in the present work. HrpO was found to have an extended shape in solution by SAXS with low melting temperature by CD experiments. During the thermal unfolding experiments no intermediate population of the protein is observed. The high content of secondary structure however, discourages the classification of HrpO with intrinsically unfolded proteins (IUp). Class I T3SS chaperones bind to the N-terminal part of effectors and deliver them to the T3SS ATPase for translocation. The avrPphF operon of P. syringae pv phaseolicola possesses two open reading frames, a class I T3SS chaperone (ORF1) and its cognate virulence effector (ORF2). Although each of the proteins crystallizes quite easily, the complex was recalcitrant to crystallization. Here we present the preliminary crystallographic analysis of the AvrPphF ORF1 crystals as well as the solution structure of the AvrPphF ORF1/ORF2 complex based on small angle X-ray scattering data.Τα εκκριτικά συστήματα τύπου ΙΙΙ (T3SSs) αποτελούν εξειδικευμένα όργανα αλληλεπίδρασης πολλών Gram-αρνητικών βακτηρίων με τα ευκαρυωτικά κύτταρα. Στα φυτοπαθογόνα βακτήρια το μονοπάτι έκκρισης κωδικοποιείται από τα γονίδια hrp (HR και pathogenicity) και hrc (HR και conserved). Οι πρωτεΐνες Hrc κατευθύνουν την έκκριση των υποστρωμάτων διαμέσου του βακτηριακού φακέλου, ενώ ένα υποσύνολο των πρωτεϊνών Hrp, με μερικώς προς το παρόν μόνο προσδιορισμένες λειτουργίες, εκκρίνονται από το σύστημα και/ή βοηθούν στην έκκριση των υποστρωμάτων. Η πρωτεΐνη HrpG είναι μία υποθετική τάξης Ι σαπερόνη του Τ3SS, όπως προβλέπεται από αλγορίθμους αναγνώρισης αναδίπλωσης και από τoν τρόπο οργάνωσης της νησίδας παθογένειας της Pseudomonas syringae. Πειράματα σκέδασης ακτίνων-Χ (SAXS) σε μικρές γωνίες και κυκλικού διχρωισμού χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση της υπόθεσης αυτής. Σε αντιδιαστολή με την τάξη των ομοδιμερών τάξης Ι σαπερονών, η HrpG σχηματίζει τετραμερές σε διάλυμα. Παρόλα αυτά το τετραμερές πρωτεϊνικό σωματίδιο δεν φαίνεται να διαθέτει την αντίστοιχη συμμετρία ενός κλειστού συμπλόκου. Η απαλοιφή των 14 καρβοξυτελικών αμινοξέων της πρωτεΐνης οδηγούν στον σχηματισμό σταθερού διμερούς στο διάλυμα με την απαραίτητη δομική συμμετρία. Το διμερές σωματίδιο προσεγγίζει το γενικό σχήμα των τάξης Ι σαπερονών αλλά η κατάταξη της πρωτεΐνης στην οικογένεια των τάξης Ι σαπερονών είναι αμφίβολη λόγω της μεγαλύτερης διαμέτρου του σωματιδίου και των υψηλών ποσοστών α-ελίκων που φαίνεται να διαθέτει. Επιπρόσθετα παρατηρήθηκε μέσω εγγενούς ηλεκτροφόρησης η αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης HrpG με την καρβοξυτελική επικράτεια της HrcU και την πρωτεΐνη HrpO. H πρωτεΐνη HrpO είναι μία διαλυτή πρωτεΐνη του Τ3SS της P. syringae pv phaseolicola. Το χρωματογραφικό πρότυπο της στην στήλη μοριακής διήθησης προσεγγίζει το αντίστοιχο της μαστιγιακής πρωτεΐνης FliJ. Η πρωτεΐνη βρέθηκε να έχει μία εκτεταμένη δομή στο διάλυμα μέσω πειραμάτων SAXS, ενώ συγχρόνως παρουσιάζει χαμηλή θερμοκρασία μετάπτωσης, όπως αυτή καταγράφηκε μέσω κυκλικού διχρωισμού. Κατά την μετάπτωση αυτή δεν παρατηρήθηκε συσσώρευση ενδιάμεσου πληθυσμού. Τα υψηλά ποσοστά δευτεροταγούς δομής όμως αποκλείουν την ταξινόμηση της πρωτεΐνης στην οικογένεια των εγγενώς αδίπλωτων πρωτεϊνών. Οι τάξης Ι σαπερόνες του T3SS δεσμεύουν το αμινοτελικό τμήμα των δραστικών πρωτεϊνών και παραδίδουν τις πρωτεΐνες αυτές στην ΑΤΡάση του συστήματος. Το οπερόνιο avrPphF της P. syringae pv phaseolicola διαθέτει δύο ανοικτά πλαίσια ανάγνωσης, μία τάξης Ι σαπερόνη (ORF1) και την συγγενική σε αυτήν δραστική πρωτεΐνη (ORF2). Παρόλο που και οι δύο πρωτεΐνες κρυσταλλώνουν αρκετά εύκολα, το σύμπλοκο τους δεν ήταν δυνατό να κρυσταλλώσει. Εδώ παρουσιάζεται η προκαταρκτική ανάλυση των κρυστάλλων της πρωτεΐνης AvrPphF ORF1 και η δομή του συμπλόκου AvrPphF ORF1/ORF2 στο διάλυμα βασισμένη σε πειράματα σκέδασης ακτίνων-Χ σε μικρές γωνίες

Man's role in the diachronic development of vegetation in the island of Lefkada: connecting pollen analysis with historic and archaeologic archives

In order to reveal the role of man, in the evolution of vegetation over time in Lefkada island, a 3,5 m sediment core was extracted out from the Vlychos marsh and studied through the method of pollen analysis the results of which were correlated with the existing historical and archaeological sources. The radioactive carbon method dated shells from 5 depths of the profile and its calibrated ages were used to construct the age-depth model. The results of the radio dating show that the age of the profile goes back to 4700 years before today.A total of 43 samples, were extracted one every 8 cm from the profile, which were microscopically analyzed under a ZEISS optical microscope X 400. Pollen grains, charcoals, exotic pollen and other non-pollen palynomorph types were identified and counted at each depth. Six pollen zones and four subzones were distinguished in which were described in detail, the percentage values of tree / shrub pollen (AP), non-arboreal pollen (NAP), non-pollen palynomoprhs (NPP) and charcoals.Groups of pollen species were created (conifers, cultivation/grazing indicators, oak forests, macchia/phrygana, etc.) and the presence of each group was studied in each zone in order to reveal the palynological features of each zone. For the interpretation of the results of the pollen diagram, they were combined with historical and archaeological data. In addition, archival items from the Lefkada Historical Archive were studied (mainly from the archival material of the Skarus oak forest) which contributed to the development of the conclusions. Palynological research revealed that the role of man was that of a catalyst in the evolution of vegetation on the island. Grazing was the main activity and the factor that had the greatest impact on the image of the landscape, which is recorded continuously from the early Bronze Age until today. Grazing was also confirmed from the presence of coprophilous fungi.The cultivation of olive tree was confirmed from Early Helladic period and reached its maximum percentages in two different cultural phases, the Late Helladic period and after 1750 AD. Pollen of Vitis presents discontinuities but follows the peaks of the percentages of Olea pollen. Cereal crops have been confirmed since the early years of the bronze age. Continuous use of fires has always been a tool for managing the natural environment as shown by the continuous presence of charcoals, (with double participation rates than those of pollen in the pollen diagram) as well as from the participation of specific fire indicators of non-pollen-palynomorphs. Through the study of vegetation evolution highlighted that the deciduous oak forests, along with maquis and conifers were the predominant species of vegetation around Vlychos bay. From the bronze age until the 14th century AD., in the landscape of Vlychos bay, at the higher altitudes, the presence of deciduous/semi-sealed oak seems to be intense. After 1750 AD., the place of deciduous oaks was taken by evergreen species of maquis and clusters of Aleppo pine. Even today in the mountainous parts of the island, in places where animal husbandry and cultivation have been abandoned, are naturally afforested with fluffy and broad-leaved oak.Προκειμένου να διερευνηθεί ο ρόλος του ανθρώπου, στη διαχρονική εξέλιξη της βλάστησης στη Λευκάδα, διενεργήθηκε λήψη προφίλ ιζήματος 3,5 m από το έλος του Βλυχού, το οποίο μελετήθηκε μέσω της μεθόδου ανάλυσης της γύρης τα αποτελέσματα της οποίας συσχετίσθηκαν με τις υπάρχουσες ιστορικές και αρχαιολογικές πηγές.Με τη μέθοδο του ραδιενεργού άνθρακα έγινε η χρονολόγηση κογχυλιών από 5 βάθη του προφίλ και οι βαθμονομημένες ηλικίες του χρησιμοποιήθηκαν για την κατασκευή του μοντέλου ηλικίας-βάθους. Τα αποτελέσματα της ραδιοχρονολόγησης έδειξαν ότι η ηλικία του προφίλ ανάγεται σε 4700 χρόνια πριν από σήμερα.Εξήχθησαν συνολικά 43 δείγματα ανά 8 εκατοστά του προφίλ, τα οποία μικροσκοπήθηκαν και αναλύθηκαν σε οπτικό μικροσκόπιο τύπου ZEISS Χ 400.Σε κάθε βάθος αναγνωρίστηκαν και καταμετρήθηκαν οι γυρεόκοκκοι, η εξωτική γύρη, τα ανθρακοτεμάχια (στο εξής charcoals) και άλλοι μη γυρεοπαλυνόμορφοι τύποι (μΓΠ). Διακρίθηκαν 6 ζώνες γύρης και 4 υποζώνες, στις οποίες αναλυτικά περιγράφησαν οι ποσοστιαίες τιμές γύρης της δενδρώδους/θαμνώδους βλάστησης (AP), της γύρης μη δενδρωδών (NAP), των μΓΠ και των charcoals.Αφού δημιουργήθηκαν ομάδες ειδών γύρης (κωνοφόρων, δεικτών καλλιέργειας/ βόσκησης, δρυοδασών, μακκίας/φρυγάνων κ.ά.) μελετήθηκε σε κάθε ζώνη η παρουσία της εκάστοτε ομάδας ώστε να αποκαλυφθούν τα παλυνολογικά γνωρίσματα της κάθε ζώνης. Για την ερμηνεία των αποτελεσμάτων του διαγράμματος γύρης, έγινε συνδυασμός αυτών με ιστορικά και αρχαιολογικά δεδομένα. Επιπρόσθετα μελετήθηκαν αρχειακά τεκμήρια του Ιστορικού Αρχείου Λευκάδας (κυρίως του αρχειακού υλικού του δρυοδάσους των Σκάρων) τα οποία συνέβαλαν στην ανάπτυξη των συμπερασμάτων. Η παλυνολογική έρευνα αποκάλυψε πως ο ρόλος του ανθρώπου ήταν καταλυτικός στην πορεία εξέλιξης της βλάστησης στο νησί. Η κτηνοτροφική δραστηριότητα είχε έντονη επίδραση στην εικόνα του τοπίου, με αδιάκοπη συμμετοχή των δεικτών βόσκησης στο διάγραμμα γύρης από την πρώιμη Εποχή του Χαλκού έως σήμερα. Η κτηνοτροφική δραστηριότητα επιβεβαιώθηκε επιπλέον από την παρουσία στο προφίλ κοπρόφιλων μυκήτων. Η καλλιέργεια της ελιάς επιβεβαιώθηκε από την Πρωτοελλαδική (ΠΕ) εποχή και έκτοτε η συμμετοχή γύρης ελιάς είναι συνεχής στο διάγραμμα γύρης με κορύφωση των ποσοστών της σε δύο διαφορετικές πολιτισμικές φάσεις, την Υστεροελλαδική περίοδο και μετά το 1750 μ.Χ. Η γύρη της αμπέλου παρουσιάζει ασυνέχειες αλλά ακολουθεί την κορύφωση των ποσοστών της ελιάς. Καλλιέργειες δημητριακών επιβεβαιώθηκαν από τα πρώτα χρόνια της εποχής του Χαλκού.Η χρήση της φωτιάς αποτέλεσε διαχρονικά εργαλείο διαχείρισης του φυσικού περιβάλλοντος, γεγονός που πιστοποιείται τόσο από τη συνεχή παρουσία charcoals (με υπερδιπλάσια ποσοστά συμμετοχής σε σχέση με τα ποσοστά της γύρης, στο διάγραμμα), όσο και από τη συμμετοχή συγκεκριμένων δεικτών μη γυρεοπαλυνόμορφων τύπων που φανερώνουν εκδήλωση φωτιάς. Μέσα από τη μελέτη της διαχρονικής εξέλιξης της βλάστησης, αναδείχθηκε η έντονη παρουσία των φυλλοβόλων/ημιφυλλοβόλων δρυών στο νησί μαζί με είδη της σκληρόφυλλης αείφυλλης βλάστησης και λίγα κωνοφόρα. Από την Eποχή του Xαλκού μέχρι το 14ο αιώνα μ.Χ. στο τοπίο περιμετρικά του Βλυχού, στα μεγαλύτερα υψόμετρα, η παρουσία της φυλλοβόλου/ημιφυλλοβόλου δρυός φαίνεται να ήταν έντονη. Μετά το 1750 μ.Χ., τη θέση των φυλλοβόλων δρυών κατέλαβαν σταδιακά οι πρινώνες και τα είδη της ευμεσογειακής μακκίας βλάστησης.Σήμερα, στα ορεινά μέρη του νησιού, σε θέσεις που έχουν εγκαταλειφθεί η κτηνοτροφία και η καλλιέργεια, οι εκτάσεις δασώνονται φυσικά με αναγέννηση της χνοώδους και της πλατύφυλλης δρυός

AvrPphB, AvrPphF: Μελέτες δύο μολυσματικών παραγόντων από την Pseudomonas syringae pv. phaseolicola

Gram negative bacteria use a highly sophisticated secretion system for protein delivery into the eukaryotic host cells, the type III secretion system. The strategy they use is conserved among plant and animal pathogens. In this thesis the studies of the type III effectors AvrPphB and AvrPphF from Pseudomonas syringae pv. phaseolicola are demonstrated. The proteins were cloned to expression vectors carrying a 6-His tag and purification experiments took place. The two sitedirected mutants of AvrPphB G63A and G63E show proteolytic cleavage like the wild type protein. In the case of AvrPphF, the two open reading frames that constitute its operon suggest the common strategy of animal pathogens of a type III chaperone and its cognate effector. In silico studies predict a type III chaperon like secondary structure for ORF1 and produce a homology model based on CesT template (type III chaperone from EPEC E.coli). Co- purification experiments also suggest interaction between ORF1 and the aminoterminal part of ORF2.Τα gram αρνητικά βακτήρια χρησιμοποιούν ένα εξειδικευμένο σύστημα μεταφοράς των μολυσματικών πρωτεϊνών τους με στόχο τα ευκαρυωτικά κύτταρα. Το σύστημα αυτό έχει ονομαστεί Τύπου ΙΙΙ. Η στρατηγική των βακτηρίων είναι κοινή είτε στοχεύουν φυτικά είτε ζωικά κύτταρα. Στην παρούσα μεταπτυχιακή διατριβή μελετήθηκαν οι μολυσματικoί παράγοντες AvrPphB και AvrPphF από την Pseudomonas syringae pv. phaseolicola. Οι πρωτεϊνες κλωνοποιήθηκαν σε φορέα έκφρασης με ετικέτα έξι ιστιδινών και έγιναν προσπάθειες καθαρισμού τους. Στην περίπτωση της AvrPphB τα δύο σημειακά μεταλλάγματα G63A και G63E που μελετήθηκαν έδειξαν ότι πρωτεολύονται όπως και η αγρίου τύπου πρωτεϊνη. Στην περίπτωση του μολυσματικού παράγοντα AvrPphF, τα δύο ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης του οπερονίου του θυμίζουν την στρατηγική τσαπερόνης- μολυσματικής πρωτεϊνης που χρησιμοποιούν κατά κανόνα τα ζωικά παθογόνα βακτήρια. In silico μελέτες προβλέπουν όμοια δευτεροταγή δομή του ORF1 με τις τσαπερόνες του εκκριτικού συστήματος τύπου ΙΙΙ, ενώ κατασκευάζεται ομόλογο μοντέλο στον χώρο με βάση την μήτρα της CesT (type III chaperone από την EPEC E.coli). Από την άλλη, πειράματα συνκαθαρισμού δείχνουν το ORF1 να αλληλεπιδρά με το αμινοτελικό άκρο του ORF2, υποστηρίζοντας επίσης αυτή τη θεώρηση

α-Helices in the Type III Secretion Effectors: A Prevalent Feature with Versatile Roles

We are grateful for support for equipment from the French Government Programme Investissements d’Avenir France BioImaging (FBI, N◦ANR-10-INSB-04-01) and the French gouvernement (Agence Nationale de la Recherche) Investissement d’Avenir programme, Laboratoire d’Excellence “Integrative Biology of Emerging Infectious Diseases” (ANR-10-LABX-62-IBEID)International audienceType III Secretion Systems (T3SSs) are multicomponent nanomachines located at the cell envelope of Gram-negative bacteria. Their main function is to transport bacterial proteins either extracellularly or directly into the eukaryotic host cell cytoplasm. Type III Secretion effectors (T3SEs), latest to be secreted T3S substrates, are destined to act at the eukaryotic host cell cytoplasm and occasionally at the nucleus, hijacking cellular processes through mimicking eukaryotic proteins. A broad range of functions is attributed to T3SEs, ranging from the manipulation of the host cell’s metabolism for the benefit of the bacterium to bypassing the host’s defense mechanisms. To perform this broad range of manipulations, T3SEs have evolved numerous novel folds that are compatible with some basic requirements: they should be able to easily unfold, pass through the narrow T3SS channel, and refold to an active form when on the other side. In this review, the various folds of T3SEs are presented with the emphasis placed on the functional and structural importance of α-helices and helical domains

AvrPphB, AvrPphF: Μελέτες δύο μολυσματικών παραγόντων από την Pseudomonas syringae pv. phaseolicola

Gram negative bacteria use a highly sophisticated secretion system for protein delivery into the eukaryotic host cells, the type III secretion system. The strategy they use is conserved among plant and animal pathogens. In this thesis the studies of the type III effectors AvrPphB and AvrPphF from Pseudomonas syringae pv. phaseolicola are demonstrated. The proteins were cloned to expression vectors carrying a 6-His tag and purification experiments took place. The two sitedirected mutants of AvrPphB G63A and G63E show proteolytic cleavage like the wild type protein. In the case of AvrPphF, the two open reading frames that constitute its operon suggest the common strategy of animal pathogens of a type III chaperone and its cognate effector. In silico studies predict a type III chaperon like secondary structure for ORF1 and produce a homology model based on CesT template (type III chaperone from EPEC E.coli). Co- purification experiments also suggest interaction between ORF1 and the aminoterminal part of ORF2.Τα gram αρνητικά βακτήρια χρησιμοποιούν ένα εξειδικευμένο σύστημα μεταφοράς των μολυσματικών πρωτεϊνών τους με στόχο τα ευκαρυωτικά κύτταρα. Το σύστημα αυτό έχει ονομαστεί Τύπου ΙΙΙ. Η στρατηγική των βακτηρίων είναι κοινή είτε στοχεύουν φυτικά είτε ζωικά κύτταρα. Στην παρούσα μεταπτυχιακή διατριβή μελετήθηκαν οι μολυσματικoί παράγοντες AvrPphB και AvrPphF από την Pseudomonas syringae pv. phaseolicola. Οι πρωτεϊνες κλωνοποιήθηκαν σε φορέα έκφρασης με ετικέτα έξι ιστιδινών και έγιναν προσπάθειες καθαρισμού τους. Στην περίπτωση της AvrPphB τα δύο σημειακά μεταλλάγματα G63A και G63E που μελετήθηκαν έδειξαν ότι πρωτεολύονται όπως και η αγρίου τύπου πρωτεϊνη. Στην περίπτωση του μολυσματικού παράγοντα AvrPphF, τα δύο ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης του οπερονίου του θυμίζουν την στρατηγική τσαπερόνης- μολυσματικής πρωτεϊνης που χρησιμοποιούν κατά κανόνα τα ζωικά παθογόνα βακτήρια. In silico μελέτες προβλέπουν όμοια δευτεροταγή δομή του ORF1 με τις τσαπερόνες του εκκριτικού συστήματος τύπου ΙΙΙ, ενώ κατασκευάζεται ομόλογο μοντέλο στον χώρο με βάση την μήτρα της CesT (type III chaperone από την EPEC E.coli). Από την άλλη, πειράματα συνκαθαρισμού δείχνουν το ORF1 να αλληλεπιδρά με το αμινοτελικό άκρο του ORF2, υποστηρίζοντας επίσης αυτή τη θεώρηση

Structural Insights of Shigella Translocator IpaB and Its Chaperone IpgC in Solution

International audienceBacterial Type III Secretion Systems (T3SSs) are specialized multicomponent nanomachines that mediate the transport of proteins either to extracellular locations or deliver Type III Secretion effectors directly into eukaryotic host cell cytoplasm. Shigella, the causing agent of bacillary dysentery or shigellosis, bears a set of T3SS proteins termed translocators that form a pore in the host cell membrane. IpaB, the major translocator of the system, is a key factor in promoting Shigella pathogenicity. Prior to secretion, IpaB is maintained inside the bacterial cytoplasm in a secretion competent folding state thanks to its cognate chaperone IpgC. IpgC couples T3SS activation to transcription of effector genes through its binding to MxiE, probably after the delivery of IpaB to the secretion export gate. Small Angle X-ray Scattering experiments and modeling reveal that IpgC is found in different oligomeric states in solution, as it forms a stable heterodimer with fulllength IpaB in contrast to an aggregation-prone homodimer in the absence of the translocator. These results support a stoichiometry of interaction 1:1 in the IpgC/IpaB complex and the multi-functional nature of IpgC under different T3SS states

A protocol for ultrastructural study of Candida albicans biofilm using transmission electron microscopy

International audienceThis protocol describes how to analyze C. albicans biofilm using transmission electron microscopy. We present two approaches to observe the ultrastructure of fungal cells within unperturbed biofilms, as well as an immunogold labeling procedure. This approach maintains the architecture of the fungal biofilm close to its native state by growing C. albicans biofilm on a plastic surface. After the freeze substitution procedure, classical transmission electron microscopy or electron tomography will allow the ultrastructural analysis of the microbial community