Differential effects of paramomycin on ribosomes of Leishmania mexicana and Mammalian cells

Paromomycin, an aminoglycoside antibiotic having low mammalian cell toxicity, is one of the drugs currently used in the chemotherapy of cutaneous and visceral leishmaniasis. In order to understand the mode of action of this antibiotic at the molecular level, we have investigated the effects of paromomycin on protein synthesis in Leishmania and its mammalian hosts. We were able to demonstrate that in vivo protein synthesis in the promastigote stage of the parasite and its proliferation rate are markedly inhibited by paromomycin while being only slightly affected by other aminoglycoside antibiotics, such as streptomycin and neomycin B. Furthermore, both in vitro polypeptide synthesis induced by poly(U) as mRNA and accuracy of translation are significantly decreased by paromomycin in cell-free systems containing ribosomal particles of Leishmania promastigotes. Conversely, when ribosomes from mammalian cells are used instead of the protozoan particles, polyphenylalanine synthesis is only barely reduced by the antibiotic and the translation misreading remains almost unaltered. Surface plasmon resonance analysis of the interaction between paromomycin and protozoan or mammalian cell ribosomal RNAs shows a strong binding of antibiotic to the parasite ribosomal decoding site and practically no interaction with the mammalian cell counterpart. Our results indicating differential effects of paromomycin on the translation processes of the Leishmania parasite and its mammalian hosts can explain the therapeutic efficiency of this antibiotic as an antileishmaniasis agent.Fil: Fernández, Marisa Mariel. Consejo Nacional de Investigaciones Cientificas y Tecnicas. Oficina de Coordinacion Administrativa Houssay. Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral "profesor R. A. Margni"; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica; ArgentinaFil: Malchiodi, Emilio Luis. Consejo Nacional de Investigaciones Cientificas y Tecnicas. Oficina de Coordinacion Administrativa Houssay. Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral "profesor R. A. Margni"; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica; ArgentinaFil: Algranati, Israel David. Fundación Instituto Leloir; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentin

Molecular and functional characterization of a spermidine transporter (TcPAT12) from Trypanosoma cruzi

Trypanosoma cruzi, the etiological agent of Chagas' disease, is the only eukaryotic cell which lacks the ability to synthesize polyamines de novo. In this work, we describe for the first time the molecular and biochemical properties of a high-affinity spermidine transporter from T. cruzi. The transporter gene TcPAT12 was functionally expressed in Xenopus laevis oocytes, showing high levels of spermidine uptake. Similar apparent affinity constants for spermidine uptake were obtained when comparing T. cruzi epimastigotes and heterologous expressed TcPAT12 in X. laevis. In addition, TcPAT12 also transports putrescine and the amino acid l-arginine at lower rates than spermidine.Fil: Carrillo, Carolina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires. Fundación Instituto Leloir. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; ArgentinaFil: Canepa, Gaspar Exequiel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Investigaciones Médicas; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Algranati, Israel David. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires. Fundación Instituto Leloir. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; ArgentinaFil: Pereira, Claudio Alejandro. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Investigaciones Médicas; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentin

Fraccionamiento de aminoácidos en proteínas vegetales y valoración cromatográfica de alanina y prolina

Se preparó zeína a partir de gluten de maíz por el método de Nolam y Vickery modificado por Larco. Lazeína obtenida y la "alfa proteína" de soja preparada por Glidden Co. fueron hidrolizadas por ebullición a reflujo con ClH 6N. Serealizó el análisis cualitativo de los hidrolizados proteicos porcromatografía circular y bidimensional sobre papel. Seensayaron los siguientes métodos de cromatografía cuantitativa sobrepapel: l) determinación del area de las manchas; 2) método de elución; 3) medida de la densidad total de color; 4) determinación de la densidadmáxima de color de cada mancha. Este último método, que es el mas exacto, fue utilizado para valorar alanina y prolina en los hidrolizados dezeína y de "alfa proteína" de soja. Paraseparar los aminoácidos que aparecían juntos después de un desarrollode 16 horas se empleó cromatografías con desarrollo de 80 horas. Se describió una técnica de desarrollo múltiple en pequeñas cajasde Petri. El envejecimiento del solvente butanol-ácido acético-agua (4:1:5 v/v) produjo la disminución de los valores Rf. Realizando cromatografías con mezclas de butanol-ácido acético-agua-acetato de butilo en varias proporciones se demostró que la disminución de los Rf se debía a la esterificaciónparcial del solvente. Seestableció la siguiente relación entre los valores Rf obtenidospor cromatografías circular y monodimensional ascendente: Rr^2 (circular) = Rf. (ascendente) Se estudiaron varios métodos de fraccionamiento de mezclas de aminoácidos. Para realizar el procedimiento de extracción continua de Dakin se usó el aparato propuesto por Woolley con algunas modificaciones; este método no produjo separaciones cuantitativas. Laelectrodiálisis realizada una sola vez en una cámara de maderade tres compartimientos con electrodos de grafito resultó insuficiente para separar cuantitativamente los grupos de aminoácidos neutros, básicos y dicarboxílicos.Fil: Algranati, Israel David. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina

Trypanosoma cruzi as a model system to study the expression of exogenous genes coding for polyamine biosynthetic enzymes. Induction of DFMO resistance in transgenic parasites

Trypanosoma cruzi, the etiologic agent of Chagas' disease, is a polyamine auxotroph organism because its genome contains neither ornithine decarboxylase (ODC) nor arginine decarboxylase (ADC) genes, presumably lost during evolution. After transformation with a recombinant plasmid bearing the complete coding region of Crithidia fasciculata ODC gene, the transgenic parasites were able to synthesize putrescine and simultaneously became susceptible to alpha-difluoromethylornithine (DFMO), an irreversible inhibitor of ODC. We have studied the emergence of DFMO-resistant T. cruzi after one-step selection of ODC-transformed parasites cultivated in the presence of high levels of the drug (5 mM). Our results have indicated a duplication of the ODC gene copy number in the drug-resistant cell line. The ODC transcripts and the corresponding translation products showed very significant increases (about 7- and 25-fold, respectively) in DFMO-resistant parasites, while the ODC enzymatic activity was 5 times higher than in drug-sensitive T. cruzi. The unequal increases of ODC protein and enzymatic activity in DFMO-resistant protozoa strongly suggest that in addition to gene amplification and enhanced transcription and translation, the assembly of ODC polypeptide chains into dimeric active enzyme molecules might also contribute to regulate the development of DFMO resistanceFil: Carrillo, Carolina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires. Fundación Instituto Leloir. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; ArgentinaFil: Gonzalez, Nelida Susana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires. Fundación Instituto Leloir. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; ArgentinaFil: Algranati, Israel David. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires. Fundación Instituto Leloir. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; Argentin

Polyamine biosynthesis in Phytomonas: biochemical characterisation of a very unstable ornithine decarboxylase

The metabolism of polyamines as well as their functions as growth regulators in plants have been extensively studied for many years. However, almost nothing is known about the biosynthesis and roles of these substances in Phytomonas spp., parasites of several plants. We have used HPLC and electrophoretic analyses to investigate the presence and metabolism of polyamines in Phytomonas Jma strain, detecting both putrescine and spermidine but not spermine. Experiments carried out by incubation of intact parasites with labelled ornithine or putrescine showed the formation of radioactive putrescine or spermidine, respectively. These results indicated that Phytomonas Jma can synthesise these polyamines through the action of ornithine decarboxylase (ODC) and spermidine synthase. On the other hand, we could not detect the conversion of arginine to agmatine, suggesting the absence of arginine decarboxylase (ADC) in Phytomonas. However, we cannot ensure the complete absence of this enzymatic activity in the parasite. Phytomonas ODC required pyridoxal 5'-phosphate for maximum activity and was specifically inhibited by α-difluoromethylornithine. The metabolic turnover of the enzyme was very high, with a half-life of 10-15 min, one of the shortest found among all ODC enzymes studied to date. The parasite proteasome seems to be involved in degradation of the enzyme, since Phytomonas ODC can be markedly stabilized by MG-132, a well known proteasome inhibitor. The addition of polyamines to Phytomonas cultures did not decrease ODC activity, strongly suggesting the possible absence of antizyme in this parasite.Fil: Marcora, Maria Silvina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquimicas de Buenos Aires; Argentina. Fundación Instituto Leloir; ArgentinaFil: Cejas, Silvina. Fundación Instituto Leloir; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquimicas de Buenos Aires; ArgentinaFil: Gonzalez, Nelida Susana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquimicas de Buenos Aires; Argentina. Fundación Instituto Leloir; ArgentinaFil: Carrillo, Carolina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquimicas de Buenos Aires; Argentina. Fundación Instituto Leloir; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Química Biológica; ArgentinaFil: Algranati, Israel David. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquimicas de Buenos Aires; Argentina. Fundación Instituto Leloir; Argentin

Polyamines prevent DFMO-mediated inhibition of angiogenesis

Tumor growth mainly depend on formation of new blood vessels. DFMO (α-difluoromethylornithine), an inhibitor of polyamine biosynthesis, inhibits tumor growth in many animal tumors. Our investigation was to evaluate the requirement of polyamines for induction of angiogenesis by tumor cells and spleen lymphocytes from tumor-bearing mice. In this regard, we have added DFMO to cell cultures. The neovascular response induced either by tumor cells or spleen lymphocytes was completely abrogated. This inhibition could be reversed by the addition of exogenous putrescine. These findings suggest that the effect of DFMO on angiogenesis is, in part, mediated by the inhibition of polyamine biosynthesis.Fil: Jasnis, Maria Adela. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Oncología "Ángel H. Roffo"; ArgentinaFil: Klein, Slobodanka Mariana. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Oncología "Ángel H. Roffo"; ArgentinaFil: Monte, Martin. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Oncología "Ángel H. Roffo"; ArgentinaFil: Davel, Lilia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Oncología "Ángel H. Roffo"; ArgentinaFil: Sacerdote de Lustig, Eugenia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Oncología "Ángel H. Roffo"; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Algranati, Israel David. Instituto de Investigaciones Bioquímicas "Fundación Campomar"; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaUnidad documental simpl