DNA origami scaffolds to control lipid membrane shape

Gerüstproteine, beispielweise Proteine der Bin/Amphiphysin/Rvs (BAR) Domänen Familie, vermitteln und regulieren durch ihre Membranbindung und Selbstorganisation die Verformungen von Zellmembranen. Die quantitative Charakterisierung der Interaktionen von synthetischen Gerüst-Molekülen mit Lipidmembranen unter kontrollierten Bedingungen kann fundamental zu unserem Verständnis der physikalischen Prinzipien beitragen, die diesen Membranverformungsphänomenen zugrunde liegen. In dieser Arbeit wurde daher die DNA-Origami-Technologie verwendet, um Funktionselemente zu schaffen, die die physikalischen Eigenschaften von Gerüstproteinen aufweisen und Lipidmembranen kontrolliert deformieren können. Zunächst wurden die Vorrausetzungen bestimmt, unter denen stark negativ geladene DNA Nanostrukturen effizient an Membranen binden. Ich zeige, dass Cholesterin-Anker, die nahe an den sperrigen DNA Nanostrukturen positioniert sind, lokal an der Membranbindung gehindert sind, und dass das Vorhandensein mehrere Cholesterin-Anker oder das Einführen von DNA-„Abstandshaltern“ die Membranbindung verstärkt. Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS) Daten zeigen, dass sowohl die Anzahl als auch die Art der DNA-„Abstandshalter“ die Interaktionen der DNA-Nanostrukturen mit Lipiddoppelmembranen bestimmen. Zusätzlich zu Experimenten mit Doppelmembranen haben wir auch die experimentellen Bedingungen für FCS Experimente etabliert, die die Interaktionen von Makromolekülen und Lipidfilmen untersuchen. Untersuchungen der Selbstorganisation von DNA-Origami-Nanostrukturen auf Lipidmembranen mittels Hochgeschwindigkeits-Atomkraftmikroskopie (HSAFM) haben aufgedeckt, dass per se rein repulsive DNA Nanostrukturen auf Lipidmembranen sowohl Spitze-an-Spitze als auch Seite-an-Seite Kontakte ausbilden, und sich damit anisotropische Domänen bilden. Die bevorzugte Art der Interaktion hängt von der Oberflächendichte der Teilchen und damit der Membranspannung ab. Ich zeige auch, dass man DNA-Nanostrukturen nutzen kann, um 2D Phasenübergänge (iso- zu anisotrop) von Teilchen verschiedener Aspektverhältnisse zu untersuchen. Zuletzt verwenden wir DNA-Nanostrukturen, um Lipidmembrane zu verformen und dabei die Funktionen von Gerüstproteinen nachzuempfinden. Wir zeigen, dass Lipidmembranen von gekrümmte DNA-Gerüsten Tubus-förmig geformt werden, die damit nicht nur die Form, sondern auch die Wirkung von BAR Proteinen nachstellen können. Die Verformung der Lipidmembran korrelierte mit der Krümmung der DNA-Gerüste und deren Dichte auf der Membran. Um Membranen dynamisch und kontrolliert verformen zu können, habe ich eine DNA-Origamistruktur entworfen, die drei Zustände hat, und die von ihrer passiven in ihre Membran-verformende Konformation geschaltet werden kann. Um das Design zu optimieren wurde ein komplementärer Ansatz in Form von oxDNA Molekül-Dynamik-Simulationen (MD Simulationen) und Transmissionselektronen-mikroskopie (TEM) verwendet.Membrane-binding and self-organization of scaffolding proteins, e.g. Bin/Amphiphysin/Rvs (BAR) domain family, mediates and regulates the shape transformations of cell membranes. The quantitative characterization of the interaction of synthetic scaffolds with lipid membranes in defined conditions will greatly add to our understanding of the fundamental physical principles driving membrane-shaping phenomena. In this work, DNA origami technology was used to create elements that bear physical features of scaffolding proteins and controllably shape lipid membranes. First, I determined the requirements for efficient membrane-binding of highly negatively charged DNA nanostructures. I show that cholesteryl-anchors positioned close to the bulky DNA nanostructures are locally hindered, and that multiple cholesteryl-anchors or DNA spacers can enhance membrane binding. Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) data demonstrates that both the number and type of DNA spacer determine the interaction of DNA nanostructures with lipid bilayers. In addition to bilayers, we established conditions for FCS experiments investigating macromolecule-lipid monolayer interactions. Studies of the self-organization of DNA origami nanostructures on lipid membranes using high speed atomic force microscopy (HSAFM) revealed that both tip-to-tip and side-by-side interactions, and the resulting anisotropic domains, are observed on lipid membranes for per se purely repulsive DNA nanostructures. The preferred type of interaction depends on the particle surface density and thus membrane tension. I also demonstrate the use of DNA nanostructures for the study of isotropic-anisotropic phase transition of particles of different aspect-ratios in 2D. Last, we employ DNA nanostructures to shape lipid membranes, mimicking the function of scaffolding proteins. We show that curved DNA scaffolds tubulate lipid membranes, resembling not only the shape but also the action of BAR proteins. Lipid membrane deformation was correlated to the DNA scaffolds’ curvature and membrane density. To dynamically control membrane shaping, I present the design of a three-state DNA origami structure that can be switched from its passive to its active membrane-shaping conformation. A complementary approach of oxDNA molecular dynamic simulations (MD simulations) and transmission electron microscopy (TEM) imaging was used to optimize the design

Liquid-Ordered Phase Formation by Mammalian and Yeast Sterols: A Common Feature With Organizational Differences

Here, biophysical properties of membranes enriched in three metabolically related sterols are analyzed both in vitro and in vivo. Unlike cholesterol and ergosterol, the common metabolic precursor zymosterol is unable to induce the formation of a liquid ordered (lo) phase in model lipid membranes and can easily accommodate in a gel phase. As a result, Zym has a marginal ability to modulate the passive membrane permeability of lipid vesicles with different compositions, contrary to cholesterol and ergosterol. Using fluorescence-lifetime imaging microscopy of an aminostyryl dye in living mammalian and yeast cells we established a close parallel between sterol-dependent membrane biophysical properties in vivo and in vitro. This approach unraveled fundamental differences in yeast and mammalian plasma membrane organization. It is often suggested that, in eukaryotes, areas that are sterol-enriched are also rich in sphingolipids, constituting highly ordered membrane regions. Our results support that while cholesterol is able to interact with saturated lipids, ergosterol seems to interact preferentially with monounsaturated phosphatidylcholines. Taken together, we show that different eukaryotic kingdoms developed unique solutions for the formation of a sterol-rich plasma membrane, a common evolutionary trait that accounts for sterol structural diversity.Peer Reviewe

Protein-monolayer interactions investigated by fluorescence microscopy and correlation spectroscopy

Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2013A membrana celular é composta por uma ampla variedade de lípidos e proteínas. Através do estabelecimento de interacções entre lípidos e proteínas, quer membranares quer solúveis, podem ser originadas heterogeneidades espaciais, levando à formação de ‘jangadas lipídicas’. Estes domínios transitórios desempenham um papel fundamental em diferentes cadeias de sinalização celular. Apesar da investigação desenvolvida na área, a membrana celular é ainda hoje um dos componentes celulares menos bem compreendidos. Nas últimas décadas têm vindo a surgir um conjunto de diferentes metodologias in vitro que permitem o estudo de variados processos biológicos sob condições definidas e controladas. Neste sentido, foram desenvolvidos variados modelos membranares minimalistas, como GUVs (giant unillamelar vesicles), GPMVs (giant plasma membrane vesicles) and SLBs (supported lipid bilayers), permitindo a análise das interacções lípido-proteína até a um nível unimolecular. Quando correctamente aplicados estes modelos permitem simplificar o sistema isolando virtualmente o fenómeno ou a partícula de interesse retendo, porém, as suas características fundamentais. Apesar da vantagem evidente do uso destes modelos, estas abordagens experimentais são tediosas, envolvendo geralmente o uso de amostras de elevado volume e em que a variação de certas características membranares (como a difusão lipídica) é apenas possível por alteração da composição lipídica ou da temperatura. As monocamadas lipídicas são historicamente descritas como o primeiro sistema lipídico observado, formando-se por distribuição espontânea de moléculas lipídicas sobre a interface água - ar e formação de filmes finos sobre superfícies. Dado o seu design único, a mobilidade e compactação lipídica podem ser facilmente ajustadas neste sistema modelo por compressão da monocamada depositada na interface. Apesar de o seu uso em ensaios de ligação proteica, este sistema tem sido negligenciado na investigação membranar recente devido à sua restrita aplicação. Mais concretamente, as tinas de Langmuir comercialmente disponíveis não são compatíveis com microscopia confocal, estando assim limitadas à monitorização da pressão superficial (π). Além disso, dado o volume de cada amostra relativamente elevado (cerca de 100 mL), são necessárias elevadas quantidades de proteína purificada, comprometendo assim a sua aplicação em estudos biológicos. Neste estudo, foi utilizada uma nova tina miniaturizada de área fixa, desenvolvida no grupo por Chwastek (Chwastek & Schwille, 2013). As suas dimensões reduzidas permitem não só o uso de amostras de pequeno volume (cerca de 200 μL) como também conferem a versatilidade necessária para o seu acoplamento a um microscópio confocal. Deste modo, é possível aplicar técnicas de imagiologia de alta resolução (permitindo a eliminação de ruído de fundo, o controlo de profundidade de campo e a compilação de secções ópticas de amostras espessas oferecido pelo microscópio confocal), assim como espectroscopia de correlação de fluorescência (FCS – técnica espectroscópica cuja sensibilidade advém do uso de baixas concentrações de sonda e na consequente medição de flutuações espontâneas da intensidade de fluorescência que resultam de desvios estocásticos do sistema relativamente ao seu equilíbrio térmico). O objectivo global deste projecto prende-se com a melhor compreensão da interacção estabelecida entre proteínas e monocamadas lipídicas. Mais concretamente foi medida a ligação a monocamadas lipídicas de duas proteínas estruturalmente bem caracterizadas: a estreptavidina – proteína tetramérica solúvel com elevada afinidade de ligação para a biotina (KD ≈ 10-15 M); e a toxina da cólera – enterotoxina, secretada pela bactéria Vibrio cholerae, constituída por um anel homo-pentamérico de subunidades B (CtxB5), responsável pela sua ligação ao receptor membranar gangliósido GM1 (KD ≈ 10-9 ou 10-10 M), e uma subunidade A com actividade de ribosilação que é parcialmente internalizada pelas células do hospedeiro, perturbando cascatas celulares de sinalização e desencadeando a infecção colérica. Foram realizadosensaios de ligação proteica a monocamadas lipídicas homogéneas e com separação de fases, na ausência ou presença dos respectivos ligandos específicos, de modo a distinguir e caracterizar os diferentes comportamentos proteicos. Em última análise, procurou-se desenvolver e optimizar um ensaio universal e quantitativo de ligação proteica a membranas lipídicas. Previamente aos estudos das interacções proteína-monocamanda, procedeu-se à caracterização morfológica das monocamadas lipídicas, assim como da mobilidade lipídica, recorrendo a microscopia confocal e a FCS, respectivamente. Observou-se pois que a fluidez e homogeneidade global das monocamadas é acompanhada pelo aumento linear do coeficiente de difusão em função da densidade lipídica no intervalo estudado (50 a 90 MMA – área molecular média em Å2), tal como se prevê do modelo de área livre (free area model). Mais, os valores obtidos para o ponto crítico do DMPC (36.0 ± 4.7 e 37.2 ± 13.5 Å2 em misturas marcadas com sondas diferentes) encontram-se dentro do erro dos valores descritos na literatura. Apesar da robustez demonstrada pelo sistema, é porém necessário ter em conta a possibilidade de ocorrerem desvios em extremos de densidade lipídica (50 e 100 MMA), por formação de fases S (sólida) e G (gás), respectivamente. Após validação da metodologia proposta, procedeu-se ao estudo da influência da compactação lipídica na ligação proteica à monocamada – quer com a estreptavidina, quer com a CtxB5 observou-se uma preferência para a ligação a monocamadas de baixa densidade lipídica e, correspondentemente baixa π e elevada difusão lipídica. Estes resultados são ainda suportados pelas experiências realizadas em misturas lipídicas com separação de fase – ambas as proteínas apresentam uma elevada afinidade para a fase fluida LE (liquid expanded) em comparação com os domínios compactos LC (liquid condensed). Adicionalmente, resultados de titulações de monocamadas com CtxB5 apontam para a mesma tendência visto que a 90 MMA se obtêm intensidades de fluorescência proteica ao nível da monocamada superiores que a 50 MMA. Este comportamento já tinha sido proposto no início da década de 80 tendo por base a análise de variações de π por adição proteica a monocamadas lipídicas (Phillips et al, 1975; Fidelio et al, 1981; Cumar et al, 1982). Porém, no caso da estreptavidina observa-se ainda um comportamento extraordinário de acumulação nas bordas de domínios quando a diferença na organização lipídica entre diferentes fases é muito elevada. A especificidade de ligação foi apenas possível para a CtxB5 por incorporação de GM1 na monocamada. Titulações de monocamadas demonstraram que a presença de uma baixa concentração do gangliósido (0.1 mol %) é suficiente para aumentar fortemente a ligação da proteína à monocamada. Além disso, em sistemas lipídicos homogéneos a proteína retém apreferência por baixas densidades lipídicas. Porém, na presença de separação de fases, a presença de GM1 promove a ligação de CtxB5 a domínios LC, dado que este se incorpora preferencialmente em domínios rígidos. Apesar da elevada reprodutibilidade associada às medições em lípidos, a aplicação do sistema a proteínas tem um erro associado bastante elevado que impede ainda uma quantificação exacta da sua ligação aos lípidos. É de salientar que para além da elevada sensibilidade do sistema de detecção usado, as monocamadas lipídicas formadas sobre a interface água-ar são altamente sensíveis a diferentes factores externos (p.e. oxidação lipídica, formação de menisco e não homogeneidades da compactação lipídica aquando da deposição lipídica, evaporação da subfase, deposição proteica, etc.) que ainda não são totalmente controladas. Deste modo, é ainda necessário proceder à optimização do método de modo a poder determinar-se KD da ligação de proteínas à superfície lipídica. Este projecto resultou pois na obtenção de novos dados semi-quantitativos de que a compactação lipídica desempenha um papel importante na interacção proteína-membrana. A separação de fases surge pois como um mecanismo de regulação da ligação proteica, não só por controlo da mobilidade lipídica mas também por segregação de ligandos. Em suma, a abordagem aqui proposta surge como uma alternativa poderosa para estudos de interacções membrana-proteina, permitindo o fácil ajuste de parâmetros membranares como a compactação lipídica, difícil de regular em sistemas de bicamadas. A sua combinação potente com a microscopia confocal e espectroscopia de correlação de fluorescência resulta não só numa elevada resolução temporal da mobilidade de partículas lipídicas, como também na alta resolução espacial da ligação proteica. Deste modo, o trabalho apresentado contribuiu para a aproximação ao desenvolvimento de um novo ensaio quantitativo global de ligação proteica a membranas lipídicas.Cellular membranes are composed of a wide variety of lipids and proteins which can lead to spatial heterogeneity and formation of so-called ‘lipid rafts’, which play an important role in signaling processes. To investigate these features of lipid bilayers various in vitro models have been developed. Although a variety of experimental assays exist, they very often require large samples volume, are complicated and the membrane features can be varied only by changes in lipid composition or temperature. Here, a fixed-area miniaturized monolayer trough was used. Due to its unique design, lipid mobility in monolayers is easily accessible while keeping other factors constant. The system utilized in this study allows the use of small sample volumes (200 μL) and can be combined with a confocal microscope and thus providing access to high resolution imaging and sensitive fluorescence correlation spectroscopy (FCS) technique. The goal of the project was to design a quantitative assay by which protein-monolayer interactions can be studied. Thus, monolayers were investigated in terms of morphology and lipid mobility. Further, interactions of well-known ligand-protein pairs were studied: cholera toxin (Ctx)/ganglioside GM1 and streptavidin/biotin. The influences of phase separation and presence of lipid ligands were investigated. It was shown that the membrane affinities of cholera toxin B (CtxB5) and streptavidin depend on the surface density of lipid molecules. Moreover, FCS measurements indicate a correlation between higher protein binding and increased lipid mobility. When phase separated lipid monolayers were used, both proteins bound preferentially to liquid expanded phase (LE). However, in case of CtxB5, in the presence of the ganglioside, the protein mostly binds to the liquid condensed phase (LC). In summary, protein binding to lipid monolayers was studied by means of fluorescence microscopy and spectroscopy. During the studies, an appropriate methodology was developed and several experimental scenarios were tested

O papel das jangadas lipídicas na terapia do cancro, doença de Alzheimer e inflamação com ácidos gordos hidroxilados

Relatório de projecto no âmbito de Bolsa Universidade de Lisboa/Fundação Amadeu Dias (2010/2011). Universidade de Lisboa. Faculdade de Ciência

Membrane sculpting by curved DNA origami scaffolds

BAR domain proteins feature a “banana-like” shape which is thought to aid membrane scaffolding and membrane tubulation. Here authors use DNA origami mimicking BAR domains, giant unilamellar vesicles and fluorescence imaging to study how different BAR domain shapes bind and deform membranes

Changes in Membrane Organization upon Spontaneous Insertion of 2‑Hydroxylated Unsaturated Fatty Acids in the Lipid Bilayer

Recent research regarding 2-hydroxylated fatty acids (2OHFAs) showed clear evidence of their benefits in the treatment of cancer, inflammation, and neurodegenerative disorders such as Alzheimer’s disease. Monolayer compressibility isotherms and isothermal titration calorimetry of 2OHFA (C18–C22) in phosphatidylcholine/phosphatidylethanolamine/sphingomyelin/cholesterol (1:1:1:1 mole ratio), a mixture that mimics the composition of mammalian plasma membrane, were performed to assess the membrane binding capacity of 2OHFAs and their natural, nonhydroxylated counterparts. The results show that 2OHFAs are surface-active substances that bind membranes through exothermic, spontaneous processes. The main effects of 2OHFAs are a decrease in lipid order, with a looser packing of the acyl chains, and a decreased dipole potential, regardless of the 2OHFAs’ relative affinity for the lipid bilayer. The strongest effects are usually observed for 2-hydroxyarachidonic (C20:4) acid, and the weakest one, for 2-hydroxydocosahexaenoic acid (C22:6). In addition, 2OHFAs cause increased hydration, except in gel-phase membranes, which can be explained by the 2OHFA preference for membrane defects. Concerning the membrane dipole potential, the magnitude of the reduction induced by 2OHFAs was particularly marked in the liquid-ordered (lo) phase (cholesterol/sphingomyelin-rich) membranes, those where order reduction was the smallest, suggesting a disruption of cholesterol–sphingolipid interactions that are responsible for the large dipole potential in those membranes. Moreover, 2OHFA effects were larger than for both lo and ld phases separately in model membranes with liquid disordered (ld)/lo coexistence when both phases were present in significant amounts, possibly because of the facilitating effect of ld/lo domain interfaces. The specific and marked changes induced by 2OHFAs in several membrane properties suggest that the initial interaction with the membrane and subsequent reorganization might constitute an important step in their mechanisms of action

Fast and versatile sequence-independent protein docking for nanomaterials design using RPXDock.

Computationally designed multi-subunit assemblies have shown considerable promise for a variety of applications, including a new generation of potent vaccines. One of the major routes to such materials is rigid body sequence-independent docking of cyclic oligomers into architectures with point group or lattice symmetries. Current methods for docking and designing such assemblies are tailored to specific classes of symmetry and are difficult to modify for novel applications. Here we describe RPXDock, a fast, flexible, and modular software package for sequence-independent rigid-body protein docking across a wide range of symmetric architectures that is easily customizable for further development. RPXDock uses an efficient hierarchical search and a residue-pair transform (RPX) scoring method to rapidly search through multidimensional docking space. We describe the structure of the software, provide practical guidelines for its use, and describe the available functionalities including a variety of score functions and filtering tools that can be used to guide and refine docking results towards desired configurations