Efecto de diferentes dosis de antibióticos sobre la resistencia antimicrobiana en cepas de e. coli de pollos de engorde

[ES] El uso de antimicrobianos de amplio espectro propicia la selección de cepas multirresistentes difíciles de tratar. Diversos estudios han demostrado la existencia de transmisión de resistencias entre animales, alimentos y humanos, así como la transferencia de resistencias entre diferentes especies bacterianas en el intestino humano y animal. En el presente estudio se cultivaron muestras fecales de pollos de engorde a diferentes momentos del ciclo de crecimiento y se realizó el antibiograma de las cepas de E. coli. Se vio una elevada presencia de multirresistencias, y se demostró a nivel in vitro la transferencia de genes de resistencia entre E. coli y Salmonella.[EN] The use of broad-spectrum antimicrobials promotes the selection of multiresistant strains difficult to treat. Several studies have demonstrated the existence of transmission between animals, food and humans, as well as the transfer of resistances between different bacterial species in the human and animal gut. In the present study faecal samples from broilers were growth at different moments to the growth cycle of the broilers and susceptibility test was performed for the E. coli. An highly presence of multiresistance was observed, and the transfer of resistance genes between E. coli and Salmonella was demonstrated.[CA] L’ús d’antimicrobians d’ampli espectre afavorix la selecció de soques multirresistents difícils de tractar. Diversos estudis han demostrat l’existència de transmissió entre animals, aliments i humans, així com la transferència de resistències entre diferents espècies bacterianes al intestí humà i animals. Al present estudi es van cultivar mostres fecals de pollastres d’engreixament a diferents moments del cicle de creixement i es va fer l’antibiograma dels E. coli. Es va vore una elevada presència de multirresistències, i es va demostrar a nivell in vitro la transferència de gens de resistència entre E. coli i Salmonella.Fenollar Penadés, A. (2014). Efecto de diferentes dosis de antibióticos sobre la resistencia antimicrobiana en cepas de e. coli de pollos de engorde. http://hdl.handle.net/10251/57164.Archivo delegad

Estudio de la transmisión de resistencias a antibióticos mediante métodos moleculares en el sector avícola y su implicación para la salud pública

[ES] Los antibióticos han sido uno de los mayores logros de la medicina moderna y han contribuido al incremento de la esperanza de vida. Además, su uso en la producción ganadera primaria ha permitido incrementar significativamente su productividad. Sin embargo, su sobreuso ha llevado a la aparición de bacterias resistentes. Las bacterias resistentes a los antibióticos son causantes de miles de muertes anualmente, por lo que el control de las resistencias a los antibióticos y su monitorización es de suma importancia, tanto en bacterias aisladas de humanos, como en bacterias procedentes de animales de consumo y alimentos. La industria avícola representa uno de los sectores de producción primaria más importantes en España, tanto por producción como por volumen de ventas. En los productos avícolas, al igual que en otros productos alimentarios, se pueden encontrar bacterias resistentes a los antibióticos. Esto puede suponer un problema, especialmente por la posible transmisión de dichas bacterias resistentes al consumidor a través de la cadena alimentaria, ya que podrían reducir la eficacia de los tratamientos antibióticos en humanos. Entre los antibióticos más usados, tanto en clínica humana como en uso veterinario, se encuentran los β-lactámicos, familia a la que pertenecen las cefalosporinas, antibióticos considerados de importancia crítica. La resistencia a estos antibióticos viene determinada en la mayoría de los casos por la acción de β-lactamasas, destacando las de tipo ESBL (β-lactamasas de amplio espectro) y las de tipo AmpC. Otro grupo de antibióticos de importancia crítica son las quinolonas, entre las que se encuentra el ciprofloxacino. Aunque para estos antibióticos el mecanismo de acción suelen ser mutaciones en las dianas de acción, se han descrito genes codificados en plásmidos transmisibles que confieren resistencia a quinolonas. Además, las bacterias que presentan algunos de los genes codificados en estos plásmidos, suelen tener asociados también genes codificantes para ESBL. Las tetraciclinas, al igual que los β-lactámicos, son de los primeros antibióticos usados para tratar infecciones humanas. De los diferentes mecanismos de resistencia a las tetraciclinas, los más frecuentes son la protección del ribosoma y las bombas de eflujo, que se atribuyen a la adquisición de genes de resistencia presentes en plásmidos u otros elementos genéticos móviles. Existen otros genes que confieren resistencia a diferentes familias de antibióticos. Ese es el caso de los genes que otorgan resistencia a macrólidos, lincosamidas y estreptograminas tipo B (conocidos como genes MLS) y de los que los más comunes son los erm. En la presente tesis nos propusimos determinar las tasas de resistencia a antibióticos de uso clínico en Escherichia coli y Enterococcus spp. aislados de gallinas y huevos; conocer el efecto de un tratamiento antibiótico a las aves en la selección de resistencias a antibióticos; determinar la prevalencia de algunos de los principales genes de resistencia a β-lactámicos, quinolonas, tetraciclinas y genes de resistencia MLS, así como los cambios en las tasas de resistencia durante el crecimiento de las aves en una explotación comercial de gallinas reproductoras. En primer lugar, se determinó la prevalencia de resistencias a los antibióticos en aislados de E. coli procedentes de huevos de producción convencional, ecológica y doméstica. La mayoría de las resistencias se observaron en los aislados de huevos ecológicos (56,9% del total de resistencias) seguido de los aislados de huevos domésticos (24,8% del total) y convencionales (18,25% del total). En los 3 orígenes, la mayoría de las resistencias se observaron para la amoxicilina-clavulánico (AMC) (58,6% - 70,6%) y la tetraciclina (TE) (20% - 51,7%). Además, en el caso de los huevos ecológicos, se observaron valores importantes de resistencia a ácido nalidíxico (NA) y ciprofloxacino (CIP) (34,5%). Asimismo, fue en los aislados de provenientes de huevos ecológicos donde mayor diversidad de patrones de resistencias a antibióticos se observaron. En cuanto a genes de resistencia a antibióticos, TEM, tetA y tetB fueron los más frecuentemente observados en los 3 orígenes. Por último, la caracterización del riesgo indicó que el mayor riesgo viene dado por la resistencia a amoxicilina-clavulánico (para todos los orígenes) y que, atendiendo al origen de los huevos, es en los ecológicos donde más casos con una valoración de riesgo elevado existen. También se analizaron las resistencias a antibióticos en gallinas de 1 día de vida y el efecto que un tratamiento con amoxicilina tiene sobre la selección de resistencias entre los aislados de E. coli. Para ello, se realizó el estudio en una granja experimental con gallinas procedentes de un criadero comercial. Las gallinas no recibieron tratamiento en el día 1. Los animales se dividieron en grupos en función de la dosis del tratamiento (dosis completa, la mitad de la dosis o un tercio de la dosis). Se recolectaron los meconios de las gallinas y muestras fecales individuales. En los aislados de meconios (gallinas de 1 día de vida) se observaron resistencias en el 63,5% de los aislados y los antibióticos con las mayores tasas de resistencia fueron NA (80%), ampicilina (AMP) y AMC (70% ambos). La elevada presencia de resistencias en aves que de 1 día de vida y que no han sido tratadas, nos sugirió que la transmisión vertical desde las gallinas progenitoras puede tener un papel importante en la transmisión de resistencias. Durante el crecimiento de las gallinas se aplicaron los diferentes tratamientos con amoxicilina y se observó que, entre los grupos con tratamiento, independientemente de la dosis, no había diferencias significativas entre ellos, pero sí con el grupo control no tratado. En las aves tratadas se observaron elevadas tasas de resistencia, no solo a AMC, sino también a AMP, cefalotina, NA y TE, indicando que el tratamiento con amoxicilina no solo seleccionó cepas resistentes a este antibiótico o familia de antibióticos, sino a otros grupos de antibióticos no relacionados con los β-lactámicos. Tras los resultados obtenidos en la granja experimental, se estudió también la prevalencia de resistencias a antibióticos en explotaciones comerciales de gallinas reproductoras de la Comunidad Valenciana. Por un lado, en una de las granjas se estudió la presencia de resistencias en las gallinas de 1 día de vida y los cambios en la prevalencia de las resistencias a medida que las gallinas crecen. En los aislados de 1 día de vida, se observaron tasas de resistencia elevadas a AMP (100%), TE (98,53%), estreptomicina (S) (66,18%) y gentamicina (57,35%), además de resistencias a cefalosporinas, principalmente a la cefotaxima (CTX) (41,18%). A medida que las gallinas crecieron, se observó una disminución generalizada en la tasa de resistencias, y tanto en pollitas como en adultas, las resistencias más frecuentemente observadas fueron a AMP y a TE, mientras que las resistencias a cefalosporinas prácticamente desaparecieron. Esta reducción pudo deberse al bajo uso de antibióticos durante el crecimiento de las gallinas, que reduce la selección de cepas resistentes. En todos los aislados de las gallinas de 1 día de vida y de los aislados resistentes o con susceptibilidad intermedia a CIP, CTX y/o ceftazidima (CAZ), se detectaron por PCR las familias de genes CMY-2, SHV, TEM, qnrB y qnrS. En los aislados de las gallinas de 1 día de vida, solo se detectó el gen CMY-2. En el resto de aislados, CMY-2 fue de los menos frecuentes, mientras que los más detectados fueron SHV y TEM seguidos de qnrB y qnrS. Por otra parte, también se analizó la prevalencia de las resistencias a antibióticos en una granja de gallinas reproductoras que ya estaban en fase de producción. La mayoría de las resistencias se observaron para la AMP, la TE y el NA. Las resistencias a cefalosporinas, así como la presencia de aislados multirresistentes, fueron bajas. Entre las cepas con resistencia o susceptibilidad intermedia a CTX, CAZ y/o CIP, así como multirresistentes, se detectaron las mismas familias de genes que en el caso anterior. En esta explotación, los genes más frecuentes fueron TEM, qnrS y qnrB. Por último, de forma paralela, se analizaron las resistencias a antibióticos en aislados de Enterococcus faecalis y Enterococcus faecium en ambas explotaciones. Se observó también un cambio en la distribución de las especies de enterococos, pasando de aislar solo E. faecalis en las gallinas de 1 día de vida a ir predominando los aislados de E. faecium en las muestras de gallinas, tanto adultas como pollitas. En cuanto a las resistencias a antibióticos, entre los aislados de E. faecalis las mayores tasas de resistencias se observaron para TE y eritromicina (E), así como para CIP y C en el caso de los aislados procedentes de la explotación de gallinas adultas. En los aislados de E. faecium, la resistencias se observaron principalmente para TE y E, en ambas explotaciones. En ninguna de las explotaciones se aislaron cepas resistentes a vancomicina. A las cepas se les realizaron diferentes PCR para la detección de genes de resistencia en función del fenotipo. En los aislados resistentes a macrólidos y/o estreptograminas se detectaron los genes tipo MLS ermA y ermB. En el caso de los aislados resistentes a TE se detectaron los genes tetK, tetL, tetM, tetS y tetO. En las cepas de E. faecalis, los genes con la mayor tasa de presencia fueron los MLS y los tetM y tetL. En los aislados de E. faecium los que mayores tasas presentaron fueron los tetK, tetL, tetM y el ermB. Los resultados de la presente tesis muestran la presencia de bacterias resistentes a los antibióticos, tanto en gallinas como en productos avícolas (huevos en este caso) y que, en el caso de huevos, estas pueden ser más diversas en huevos ecológicos que en huevos de producción convencional. También se ha visto como el tratamiento con un solo antibiótico favorece la selección de resistencias a antibióticos de distintas familias y se ha demostrado también la elevada presencia resistencias a antibióticos en E. coli aislados de gallinas de 1 día de vida, incluyendo resistencias a cefalosporinas. Por último, también se ha comprobado como los genes de la familia SHV y TEM, así como los qnrB y qnrS se observan con frecuencia en E. coli no-susceptibles a cefalosporinas o ciprofloxacino, además de la elevada frecuencia de los genes ermB, tetK, tetL y tetM en aislados de enterococos procedentes de gallinas.[CA] Els antibiòtics han sigut un dels majors assoliments de la medicina moderna i han contribuït a l'increment de l'esperança de vida. A més, el seu ús en la producció ramadera primària ha permés incrementar significativament la seva productivitat. No obstant això, la sobreutilització ha portat a l’aparició de bacteris resistents. Els bacteris resistents als antibiòtics són causants de milers de morts anualment, per la qual cosa el control de les resistències als antibiòtics i el seu monitoratge és de suma importància tant per a bacteris aïllats d'humans, com per a bacteris procedents d'animals de consum i aliments. La indústria avícola representa un dels sectors de producció primària més importants a Espanya, tant per producció com per volum de vendes. En els productes avícoles, igual que en altres productes alimentaris, es poden trobar bacteris resistents als antibiòtics. Açò pot supossar un problema, especialment per la possible transmissió d'aquests bacteris resistents al consumidor mitjançant la cadena alimentària, ja que podrien reduir l'eficàcia dels tractaments antibiòtics en humans. Entre els antibiòtics més usats, tant en clínica humana com en ús veterinari, es troben els βlactàmics, família a la qual pertanyen les cefalosporines, antibiòtics considerats d'importància crítica. La resistència per a aquests antibiòtics ve determinada en la majoria dels casos per l'acció de β-lactamases, destacant les de tipus ESBL (β-lactamases d'ampli espectre) i les tipus AmpC. Un altre grup d'antibiòtics d'importància crítica són les quinolones, entre les quals es troba el ciprofloxací. Encara que per a aquests antibiòtics el mecanisme d'acció solen ser mutacions en les dianes d'acció, s'han descrit gens codificats en plasmidis transmissibles i que confereixen resistència a quinolones. A més, els bacteris que presenten alguns dels gens codificats en aquests plasmidis, solen tindre associats també gens codificants per a ESBL. Les tetraciclines, igual que els β-lactàmics, són dels primers antibiòtics que van començar a usar-se per al tractament d’infeccions humanes. Dels diferents mecanismes de resistència a les tetraciclines, els més freqüents són la protecció del ribosoma i les bombes d’efluxe, que s'atribueixen a l'adquisició de gens de resistència presents en plasmidis o altres elements genètics mòbils. Existeixen també gens que confereixen resistència a diferents famílies d'antibiòtics. Aqueix és el cas dels gens que atorguen resistència a macròlids, lincosamides i estreptogramines tipus B (coneguts com a gens MLS) i dels quals els més comuns són els erm. En la present tesi ens vam proposar determinar les taxes de resistència a antibiòtics d'ús clínic en Escherichia coli i Enterococcus spp. aïllats de gallines i ous; conéixer l'efecte d'un tractament antibiòtic a les aus en la selecció de resistències antibiòtiques; determinar la prevalença d'alguns dels principals gens de resistència a β-lactàmics, quinolones, tetraciclines i gens de resistència MLS, així com els canvis en les taxes de resistència durant el creixement de les aus en una explotació comercial de gallines reproductores. En primer lloc, es va determinar la prevalença de resistències als antibiòtics en aïllats d'E. coli procedents d'ous de producció convencional, ecològica i domèstica. La majoria de les resistències es van observar en els aïllats d'ous ecològics (56,9% del total de resistències), seguit dels aïllats d'ous domèstics (24,8% del total) i convencionals (18,25% del total). En els 3 orígens, la majoria de les resistències es van observar per a l’amoxicilina-clavulànic (AMC) (58,6% - 70,6%) i la tetraciclina (TE) (20% - 51,7%). A més, en el cas dels ous ecològics, es van observar valors importants de resistència a l’àcid nalidíxic (NA) i ciprofloxací (CIP) (34,5%). Així mateix, va anar en els aïllats de provinents d'ous ecològics on major diversitat de patrons de resistències a antibiòtics es van observar. Quant a gens de resistència a antibiòtics, van ser el TEM, el tetA i el tetB els més observats en els 3 orígens. Finalment, la caracterització del risc va indicar que el major risc ve donat per la resistència a amoxicilina-clavulànic (per a tots els orígens) i que, atés l'origen dels ous, és en els ecològics on més casos amb una valoració de risc elevat existeixen. També es van analitzar les resistències a antibiòtics en gallines d'1 dia de vida i l'efecte que un tractament amb amoxicilina té sobre la selecció de resistències entre els aïllats d'E. coli. Per a això, es va realitzar l'estudi en una granja experimental amb gallines procedents d'una granja comercial. Les gallines no van rebre tractament en el dia 1. Els animals, es van dividir en grups en funció de la dosi del tractament (dosi completa, la meitat de la dosi o un terç de la dosi). Es van recol·lectar els meconis de les gallines i mostres fecals individuals. En els aïllats de meconis (gallines d'1 dia de vida), es van observar resistències en el 63,5% dels aïllats i els antibiòtics amb les majors taxes de resistència van ser NA (80%), ampicil·lina (AMP) i AMC (70% en tots dos). L'elevada presència de resistències en aus d'1 dia de vida i que no han sigut tractades, ens va sugerir que la transmissió vertical des de les gallines progenitores pot tindre un paper important en la transmissió de resistències. Durant el creixement de les gallines es van aplicar els diferents tractaments amb amoxicilina i es va observar que, entre els grups amb tractament, independentment de la dosi, no hi havia diferències significatives entre ells, però sí amb el grup control no tractat. En les aus tractades, es van observar elevades taxes de resistència no sols a AMC, sinó també a AMP, cefalotina, NA i TE, indicant que el tractament amb amoxicilina no sols va seleccionar soques resistents a aquest antibiòtic o família d'antibiòtics, sinó a altres grups d'antibiòtics no relacionats amb els β-lactàmics. Després dels resultats obtinguts en la granja experimental, es va estudiar també la prevalença de resistències a antibiòtics en explotacions comercials de gallines reproductores de la Comunitat Valenciana. D'una banda, en una de les granges es va estudiar la presència de resistències en les gallines d'1 dia de vida i els canvis en la prevalença de les resistències a mesura que les gallines creixen. En els aïllats d'1 dia de vida, es van observar taxes de resistència elevades a AMP (100%), TE (98,53%), estreptomicina (S) (66,18%) i gentamicina (57,35%), a més de resistències a cefalosporines, principalment a la cefotaxima (CTX) (41,18%). A mesura que les gallines van créixer, es va observar una disminució generalitzada en la taxa de resistències, i tant en polletes com en adultes, les resistències més sovint observades van ser a AMP i a TE, mentre que les resistències a cefalosporines pràcticament van desaparéixer. Aquesta reducció pot haver-se sigut degut al baix ús d'antibiòtics durant el creixement de les gallines, que redueix la selecció de soques resistents. En tots els aïllats de les gallines d'1 dia de vida i dels aïllats resistents o amb susceptibilitat intermèdia a CIP, CTX i/o ceftazidima (CAZ), es van detectar mitjançant PCR les famílies de gens CMY-2, SHV, TEM, qnrB i qnrS. En els aïllats de les gallines d'1 dia de vida, només es va detectar el CMY-2. En la resta d'aïllats CMY-2 va ser dels menys freqüents, mentre que els més detectats van ser SHV i TEM seguits del qnrB i qnrS. D'altra banda, també es va analitzar la prevalença de les resistències a antibiòtics a una granja de gallines reproductores que ja estaven en fase de producció. La majoria de les resistències es van observar per a la AMP, la TE i el NA. Les resistències a cefalosporines així com la presència d'aïllats multiresistents, van ser baixos. Entre les soques amb resistència o susceptibilitat intermèdia a CTX, CAZ i/o CIP, així com multiresistents, es van detectar les mateixes famílies de gens que en el cas anterior. En aquesta explotació, els gens més freqüents van ser TEM, qnrS i qnrB. Finalment, de manera paral·lela, es van analitzar les resistències a antibiòtics en aïllats de Enterococcus faecalis i Enterococcus faecium en totes dues explotacions. A més, es va observar també un canvi en la distribució de les espècies d’enterococs, passant d'aïllar només E. faecalis en les gallines d'1 dia de vida a anar predominant els aïllats de E. faecium en les mostres de gallines, tant adultes com en polletes. Quant a les resistències a antibiòtics, entre els aïllats de E. faecalis les majors taxes de resistències es van observar per a TE i eritromicina (E), així com per a CIP i C en el cas dels aïllats procedents de l'explotació de gallines adultes. En els aïllats de E. faecium, la resistències es van observar principalment per a TE i E en totes dues explotacions. En cap de les explotacions es van aïllar ceps resistents a vancomicina. A les soques se'ls van realitzar diferents PCR per a la detecció de gens de resistència en funció del fenotip. En els aïllats resistents a macròlids i/o estreptogramines, es van detectar els gens tipus MLS ermA i ermB. En el cas dels aïllats resistents a TE es van detectar els gens tetK, tetL, tetM, tetS i tetO. En els ceps de E. faecalis, els gens amb la major taxa de presència van ser els MLS i els tetM i tetL. En els aïllats de E. faecium els que majors taxes van presentar van ser els tetK, tetL, tetM i el ermB. Els resultats de la present tesi mostren la presència de bacteris resistents als antibiòtics tant en gallines com en productes avícoles (ous en aquest cas) i que, en el cas d'ous, aquestes poden ser més diverses en ous ecològics que en ous de producció convencional. També s'ha vist com el tractament amb un sol antibiòtic afavoreix la selecció de resistències a antibiòtics de diferents famílies i s'ha demostrat també l'elevada presencia resistències a antibiòtics en E. coli aïllats de gallines d'1 dia de vida, incloent resistències a cefalosporines. Per últim, també s'ha comprovat com els gens de les famílies SHV i TEM, així com els qnrB i qnrS s'observen amb freqüència en E. coli no-susceptibles a cefalosporines o ciprofloxací, a més de l'elevada freqüència dels gens ermB, tetK, tetL i tetM en aïllats d’enterococs procedents de gallines.[EN] Antibiotics have been one of the most important achievements in modern medicine and have contributed to life expectancy increasing. Furthermore, its use in livestock production has led to a significant raise in productivity. However, its overuse has caused the apparition of resistant bacteria. Antibiotic resistant bacteria cause thousands of deaths annually, so the control of antibiotic resistance and their monitoring is of utmost importance for bacteria isolated from humans as well as bacteria isolated from food and food-animals. Poultry farming is one of the most important sectors of primary production in Spain for both production volume and sales. Poultry products, as for any other food product, antibiotic resistant bacteria can be found. These may pose a risk, especially for the possible transmission of the resistant bacteria to consume

Antimicrobial Resistance of Escherichia coli isolated in newborn chickens and effect of amoxicillin treatment during its growth

[EN] The use of antimicrobials in food animals is the major determinant for the propagation of resistant bacteria in the animal reservoir. However, other factors also play a part in particular vertical spread between the generations has been suggested to be an important transmission pathway. The objective of this paper was to determine the resistance patterns of Escherichia coli isolated from newly hatched chickens as well as to study the antibiotic pressure effect when amoxicillin was administered during their growing period. With this aim, meconium from 22 day-old Ross chickens was analyzed. In addition, during their growth period, amoxicillin treatments at days 7, 21 and 35 were carried out. Results showed a high number of E. coli resistant strains isolated from one day chickens, being the highest rates for beta-lactams group, followed by quinolone and tetracyclines. After treatment with amoxicillin, the highest percentage of resistances were detected for this antibiotic compared to the others analysed with significant differences in resistance percentages between control and treated broilers detected in relation to ampicillin, cephalothin, streptomycin, kanamycin, gentamicin, chloramphenicol and tetracycline. Differences in resistances to ciprofloxacin and nalidixic acid between control and treated animals were not observed and lack of resistance for amikacin and ceftriaxone. These results suggest the possibility of vertical transmission of resistant strains to newly hatched chickens from parenteral flocks, and seem to indicate that the treatment with amoxicillin increased the resistances of E. coli to other antibiotics.Jiménez Belenguer, AI.; Doménech Antich, EM.; Fenollar-Penadés, A.; Ferrús Pérez, MA.; Villagrá, A. (2016). Antimicrobial Resistance of Escherichia coli isolated in newborn chickens and effect of amoxicillin treatment during its growth. Avian Pathology. 45(4):501-507. doi:10.1080/03079457.2016.1168515S50150745

Novel purine chemotypes with activity against Plasmodium 2 falciparum and Trypanosoma cruzi

Malaria and Chagas disease, caused by Plasmodium spp. and Trypanosoma cruzi parasites, remain important global health problems. Available treatments for those diseases present several limitations, such as lack of efficacy, toxic side effects, and drug resistance. Thus, new drugs are urgently needed. The discovery of new drugs may be benefited by considering the significant biological differences between hosts and parasites. One of the most striking differences is found in the purine metabolism, because most of the parasites are incapable of de novo purine biosynthesis. Herein, we have analyzed the in vitro anti-P. falciparum and anti-T. cruzi activity of a collection of 81 purine derivatives and pyrimidine analogs. We firstly used a primary screening at three fixed concentrations (100, 10, and 1 µM) and progressed those compounds that kept the growth of the parasites < 30% at 100 µM to dose–response assays. Then, we performed two different cytotoxicity assays on Vero cells and human HepG2 cells. Finally, compounds specifically active against T. cruzi were tested against intracellular amastigote forms. Purines 33 (IC50 = 19.19 µM) and 76 (IC50 = 18.27 µM) were the most potent against P. falciparum. On the other hand, 6D (IC50 = 3.78 µM) and 34 (IC50 = 4.24 µM) were identified as hit purines against T. cruzi amastigotes. Moreover, an in silico docking study revealed that P. falciparum and T. cruzi hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase enzymes could be the potential targets of those compounds. Our study identified two novel, purine-based chemotypes that could be further optimized to generate potent and diversified anti-parasitic drugs against both parasites.SAF2016-76080-R (Spanish Ministry of Economy (AEI/FEDER, UE))PID2019-110810RB-I00 (Spanish Ministry of Science and Innovation)Generalitat of Catalonia Universities and Research Department, Spain (AGAUR; 2017SGR00924)Carlos III Health Institute (ISCIII)RICET Network for Cooperative Research in Tropical Diseases (ISCIII; RD12/0018/0010)Generalitat of Catalonia Department of Health (PERIS 2016–2010 SLT008/18/00132)Spanish Ministry of Education, Culture, and Sports (FPU grant ref. 14/00818)Spanish Ministry of Science, Innovation, and Universities through the “Centro de Excelencia Severo Ochoa 2019–2023” Program (CEX2018-000806-S)CERCA Progra

Risk Characterization of Antibiotic Resistance in Bacteria Isolated from Backyard, Organic, and Regular Commercial Eggs

[EN] This study was conducted to assess the risk due to antimicrobial-resistant strains of Salmonella spp., Listeria monocytogenes, and Escherichia coli isolated from the eggshell and the contents of eggs bought in markets in Valencia (Spain). Thirty-four samples from three different production styles were analyzed: standard (n = 34), organic (n = 16), and backyard (n = 10) eggs. L. monocytogenes was not isolated in any style of production. Only one strain of Salmonella was isolated from standard production, which was resistant to ciprofloxacin and amoxicillin. E. coli strains were resistant in 22% of the isolates from organic production, 12.25% from standard production, and 11.23% from backyard production. In all cases, the highest resistance was observed for amoxicillin-clavulanate. None of the isolates from standard and backyard eggs were resistant to chloramphenicol, ciprofloxacin, gentamycin, and streptomycin, while only ceftriaxone was found to be effective against all E. coli isolates from organic eggs. beta-Lactamase genes bla(TEM), bla(SHV), and bla(CMY-2) and the resistance genes for tetracycline tetA, tetB, and tetC were tested. The most commonly detected antimicrobial resistance genes among the E. coli isolates were tetA (49.30%), bla(TEM) (47.89%), and tetB (36.62%). Overall, a maximum public health risk is associated with beta-lactam antibiotics.Fenollar-Penadés, A.; Doménech Antich, EM.; Ferrús Pérez, MA.; Jiménez Belenguer, AI. (2019). Risk Characterization of Antibiotic Resistance in Bacteria Isolated from Backyard, Organic, and Regular Commercial Eggs. Journal of Food Protection. 82(3):422-428. https://doi.org/10.4315/0362-028X.JFP-18-355S422428823Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). 2014. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing: twenty-fourth informational supplement. CLSI Document M100-S24. CLSI, Wayne, PA.(2013). The European Union Summary Report on antimicrobial resistance in zoonotic and indicator bacteria from humans, animals and food in 2011. EFSA Journal, 11(5), 3196. doi:10.2903/j.efsa.2013.3196(2016). The European Union summary report on trends and sources of zoonoses, zoonotic agents and food‐borne outbreaks in 2015. EFSA Journal, 14(12). doi:10.2903/j.efsa.2016.4634Evans, J. K., Buchanan, K. L., Griffith, S. C., Klasing, K. C., & Addison, B. (2017). Ecoimmunology and microbial ecology: Contributions to avian behavior, physiology, and life history. Hormones and Behavior, 88, 112-121. doi:10.1016/j.yhbeh.2016.12.003International Organization for Standardization. 2005. Microbiology of the food chain—horizontal method for the detection and enumeration of Listeria monocytogenes and of Listeria spp. ISO 11290-1:1997/A1:2005. International Organization for Standardization, Geneva.Lanz, R., Kuhnert, P., & Boerlin, P. (2003). Antimicrobial resistance and resistance gene determinants in clinical Escherichia coli from different animal species in Switzerland. Veterinary Microbiology, 91(1), 73-84. doi:10.1016/s0378-1135(02)00263-8Rivoal, K., Fablet, A., Courtillon, C., Bougeard, S., Chemaly, M., & Protais, J. (2013). Detection of Listeria spp. in liquid egg products and in the egg breaking plants environment and tracking of Listeria monocytogenes by PFGE. International Journal of Food Microbiology, 166(1), 109-116. doi:10.1016/j.ijfoodmicro.2013.06.014Sáenz, Y., Zarazaga, M., Briñas, L., Lantero, M., Ruiz-Larrea, F., & Torres, C. (2001). Antibiotic resistance in Escherichia coli isolates obtained from animals, foods and humans in Spain. International Journal of Antimicrobial Agents, 18(4), 353-358. doi:10.1016/s0924-8579(01)00422-8Scientific Advisory Group on Antimi. (2009). Reflection paper on the use of third and fourth generation cephalosporins in food producing animals in the European Union: development of resistance and impact on human and animal health. Journal of Veterinary Pharmacology and Therapeutics, 32(6), 515-533. doi:10.1111/j.1365-2885.2009.01075.xSHIVAPRASAD, H. L. (2000). Fowl typhoid and pullorum disease. Revue Scientifique et Technique de l’OIE, 19(2), 405-424. doi:10.20506/rst.19.2.1222Utrarachkij, F., Pornraungwong, S., Siripanichgon, K., Nakajima, C., Suzuki, Y., & Suthienkul, O. (2012). Possible horizontal transmission of Salmonella via reusable egg trays in Thailand. International Journal of Food Microbiology, 154(1-2), 73-78. doi:10.1016/j.ijfoodmicro.2011.12.024Voetsch, A. C., Van Gilder, T. J., Angulo, F. J., Farley, M. M., Shallow, S., … Marcus, R. (2004). FoodNet Estimate of the Burden of Illness Caused by NontyphoidalSalmonellaInfections in the United States. Clinical Infectious Diseases, 38(s3), S127-S134. doi:10.1086/38157

Esters of Cinnamic Acid as Green Plasticizers for Polylactide Formulations with Improved Ductility

Abstract This study demonstrates the potential of different cinnamate esters, namely methyl trans‐cinnamate (MC), isobutyl cinnamate (IBC), allyl cinnamate (AC), and ethyl cinnamate (EC), as environmentally friendly plasticizers for polylactide (PLA). Plasticized PLA formulations with a constant nominal wt% of 20 of each plasticizer are compounded in a twin‐screw co‐rotating extruder and subsequently processed by injection molding. The results show exceptional plasticization efficiency of AC with an increase in elongation at break from 3.9% (neat PLA), up to 339.4% and a remarkable increase in impact strength, thus showing great potential to overcome the main drawback related to PLA intrinsic brittleness. The incorporation of cinnamates in a PLA matrix leads to a decrease in Tg from 61.7 °C down to 36.1 °C for the plasticized PLA formulation containing 20 wt% AC. Thermogravimetry analysis reveals that a slight plasticizer loss occurs during processing, as it happens with other monomeric plasticizers, but this phenomenon does not limit their plasticization efficiency. Therefore, the results obtained in this study confirm the suitability of a new family of organic compounds derived from the esterification of cinnamic acid as green plasticizers for PLA with improved toughness, with comparable, or even superior, ductile properties of typical plasticizers for PLA

Beyond the MEP Pathway: A novel kinase required for prenol utilization by malaria parasites.

A proposed treatment for malaria is a combination of fosmidomycin and clindamycin. Both compounds inhibit the methylerythritol 4-phosphate (MEP) pathway, the parasitic source of farnesyl and geranylgeranyl pyrophosphate (FPP and GGPP, respectively). Both FPP and GGPP are crucial for the biosynthesis of several essential metabolites such as ubiquinone and dolichol, as well as for protein prenylation. Dietary prenols, such as farnesol (FOH) and geranylgeraniol (GGOH), can rescue parasites from MEP inhibitors, suggesting the existence of a missing pathway for prenol salvage via phosphorylation. In this study, we identified a gene in the genome of P. falciparum, encoding a transmembrane prenol kinase (PolK) involved in the salvage of FOH and GGOH. The enzyme was expressed in Saccharomyces cerevisiae, and its FOH/GGOH kinase activities were experimentally validated. Furthermore, conditional knockout parasites (Δ-PolK) were created to investigate the biological importance of the FOH/GGOH salvage pathway. Δ-PolK parasites were viable but displayed increased susceptibility to fosmidomycin. Their sensitivity to MEP inhibitors could not be rescued by adding prenols. Additionally, Δ-PolK parasites lost their capability to utilize prenols for protein prenylation. Experiments using culture medium supplemented with whole/delipidated human plasma in transgenic parasites revealed that human plasma has components that can diminish the effectiveness of fosmidomycin. Mass spectrometry tests indicated that both bovine supplements used in culture and human plasma contain GGOH. These findings suggest that the FOH/GGOH salvage pathway might offer an alternate source of isoprenoids for malaria parasites when de novo biosynthesis is inhibited. This study also identifies a novel kind of enzyme related to isoprenoid metabolism

Conditional knockout of <i>P</i>. <i>falciparum</i> PolK gene.

(A) Diagram depicting the edition of single-exon gene P. falciparum PolK. Using Cas9-assisted genome editing, all 612 bp of the native PfPolK (WT) open reading frame were replaced by a recodonized sequence (PfPolK recod) and a 3x-HA sequence (yellow box) in the 5’ end of the sequence and all flanked by two loxP sites (orange boxes). The position of the 20-nucleotide region targeted by the single guide RNA (sgRNA) is indicated (purple box). (B) Diagram of the rapamycin-induced site-specific excision. Recombination between the loxP sites removes the entire recodonized gene (green box) and 3-HA sequence; (C) PCR detection of transgenic parasites. Wild type DNA (NF54 DiCre control) was confirmed using PolK-WT-forward and reverse primers, amplifying a fragment of 383 bp. Using PolK-recod-forward and reverse primers it was detected a fragment of 541 bp corresponding to the redoconized version of PolK in transgenic parasites (Clones E3, C3 and G9) and in a plasmid containing the recodonized PolK (pUC19 polk recod) as a control. It was used as a standard the GeneRuler 1 kb DNA Ladder (#SM0311, Thermo Scientific). (D) PCR assessment of the genome integration of the construct in the PfPolK locus. Wild type DNA (NF54 DiCre control) was confirmed using Int-control-forward and Int-WT-reverse primers, amplifying a fragment of 1053 bp. Using Int-control-forward and Int-recod-reverse primers it was detected a fragment of 972 bp corresponding to the integrated locus. It was used as a standard the GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder (#MK-130, Cellco) (E) Confirmation of the rapamycin-induced PfPolK gene excision in the clone PolK-loxP E3. The deletion was confirmed by PCR 24, 48, 96 and 144 h after treatment with DMSO (D) or rapamycin (R) using primers PolK-HR1-forward and PolK-HR2-reverse (in red and blue on panel B, respectively). Excision reduces the amplicon from 1840 bp to 799 bp, disrupting PfPolK. It was used as a standard the GeneRuler 1 kb DNA Ladder (#SM0311, Thermo Scientific). (F) Figure shows the 144h evolution of parasitemia in different clones in which PfPolK gene was excised (parasites exposed to rapamycin) or not (parasites exposed to DMSO). (G) Western blot of transgenic parasites (left) and the respective Comassie stained gel (right). Western blot was performed to analyse the HA-tagged PfPolK of parasites in which PfPolK was excised (lane 1, parasites exposed to rapamycin) or preserved (lane 2, parasites exposed to DMSO). (H) Immunofluorescence analysis of HA-tagged PfPolK of parasites in which PfPolK was excised (parasites exposed to rapamycin, Δ-Polk) or not (control parasites, exposed to DMSO). HA-tagged PfPolK is marked in red, the apicoplast is green and the nucleus in blue. For all experiments, the excision of PolK-loxP parasites was initiated by adding 50 nM rapamycin or DMSO (used as a vehicle control) to synchronized ring-stage cultures. The cells underwent a 24-hour treatment period, followed by a washout step. At this point, we considered it as time zero, and the parasites were cultured again without rapamycin. For Western blot and IF analysis, parasites were utilized at the trophozoite/shizont stage (at 24 hours). In the case of PCR analysis and the assessment of parasitemia evolution, parasites were collected at various time points, as indicated in the figure. (I) Quantitative pixel analysis of immunofluorescence images. The table presents data from the analysis of pixel overlap between the red (anti-HA antibody staining) and green (anti-FRN antibody staining) channels in five individual parasites. The count of red, green, and overlapping pixels was performed using the ImageJ software. The "Percentage of Overlap" was calculated as the ratio of overlapping pixels to the total red channel pixels, multiplied by 100, for each parasite replicate. The average and standard deviation (SD) of the percentage overlap across the five replicates are also provided.</p

Phenotypic characterization of knockout parasites.

(A) Fosmidomycin dose-response curves after 48h in parasites maintaining a functional PfPolK (DMSO (Vehicle/control)) or Δ-PolK parasites. These parasites were cultured in RPMI medium in the presence or absence of the indicated prenols (5 μM). (B) Fosmidomycin IC50 values of the results exposed in the previous panel. (C) Clindamycin dose-response curves after 96 h in parasites maintaining a functional PfPolK (DMSO—Vehicle/control) or Δ-PolK parasites. These parasites were cultured in RPMI medium in the presence or absence of GGOH (5 μM), as indicated. (D) Clindamycin IC50 values of the results exposed in the previous panel. Statistical analysis was made using one-way ANOVA/Dunnet’s Multiple Comparison Test.*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. Comparison made to Vehicle/Control data. Error bars represent standard deviation (n = 3). The excision of PolK-loxP parasites was initiated one parasitic cycle before the start of the experiments. This was achieved by adding 50 nM rapamycin or DMSO (used as a vehicle control) to synchronized cultures in the ring stage. These cells underwent a 24-hour treatment period, followed by a washout step, and then used for experiments. Parasitic growth in all experiments depicted in this figure was monitored by flow cytometry.</p