Towards the elaboration of an in vitro test to predict the carcinogenic nature of chemical and natural compounds used in the cosmetic industry

Les tests toxicologiques des produits cosmétiques étaient classiquement réalisés sur des modèles animaux. Les coûts prohibitifs et l'évolution de la perception de l'expérimentation animale dans le grand public ont encouragé le développement de tests in vitro capables de prédire la toxicité de composés potentiellement classables "CMR" (Cancérigène, Mutagène et/ou Reprotoxique). Plus récemment, en cosmétique, les tests basés sur l'expérimentation animale ont été interdits dans l'Union européenne.Dans ce travail, nous avons comparé les signatures transcriptomiques de composés cancérigènes non génotoxiques sur des épithéliums pulmonaires en utilisant des cultures bi-dimensionnelles (telles que les cellules d'épithélium bronchique humain normal, BEAS-2B) et tri-dimensionnelles (3D). Les cultures 3D sont des cellules cultivées en "interface air liquide" (ALI) reconstituant un épithélium différencié composé de différents types de cellules (cellules ciliées, cellules en gobelet, etc.). Trois cancérigènes non génotoxiques connus (chlorure de cadmium (CdCl2), hydroquinone (HQ) et acétate de myristate de phorbol (PMA)) ont été sélectionnés dans cette étude pilote. Les cultures d'ALI et de BEAS-2B ont d'abord été analysées par l'établissement du profil d'expression génétique des puces à ADN lors de l'incubation avec les substances toxiques. Cette analyse transcriptomique réalisée sur une population totale a révélé une réponse comparable sur la base d'une signature de 200 gènes entre les deux systèmes de culture utilisés et une meilleure reproductibilité en utilisant le modèle BEAS-2B. Ensuite, nous avons effectué une analyse transcriptomique sur cellules uniques afin d'identifier les biais potentiels liés aux systèmes de culture ALI et les différences dans la réponse biologique au traitement au niveau des sous-populations cellulaires. Des signatures spécifiques de chaque agent toxique, ainsi qu’une hiérarchie de réponse de chaque type cellulaire ont été établies. Des signatures propres à chaque type cellulaire ont été mise en évidence, suggérant le bien-fondé basé sur une approche d’analyse transcriptomique sur cellules niques. Une comparaison entre les ensembles de données sur cellules uniques obtenues grâce au système bi-dimensionnel et au système ALI a également été effectuée, mettant en évidence un manque de corrélation entre BEAS-2B et les populations cellulaires précédemment décrites dans les cultures tri-dimensionnelles.Globalement, nos résultats montrent que le système ALI associé à une analyse transcriptomique sur cellules uniques peut fournir des informations supplémentaires par rapport à l'analyse transcriptomique sur population totale. Des expériences devront être réalisées ultérieurement sur un plus grand nombre de substances cancérigènes non génotoxiques pour déterminer si cette méthodologie peut fournir des signatures spécifiques, prédisant la nature cancérigène non génotoxique d’un composé chimique.Toxicological tests for cosmetic products were classically performed on animal models. Prohibitive costs and evolution of the perception about animal experimentation in the general public have encouraged the development of in vitro tests capable of predicting the toxicity of compounds potentially classifiable as “CMR” (Carcinogenic, Mutagenic and/or Reprotoxic). More recently, tests based on animal experimentation have been banned in the European Union.In this work, we have compared transcriptomic signatures of non-genotoxic carcinogenic compounds on lung epithelia using bi-dimensional (such as the normal human bronchial epithelium cells, BEA-2B) and tri-dimensional (3D) cultures. 3D cultures are cells cultured in “air liquid interface” (ALI) reconstitute a differentiated epithelium composed of different types of cells (ciliated cells, goblet cells, etc.). Three known non-genotoxic carcinogens (cadmium chloride (CdCl2), hydroquinone (HQ) and Phorbol Myristate acetate (PMA)) were selected in this pilot study. ALI and BEAS-2B cultures were first analysed by microarray gene expression profiling upon incubation with the toxicants. This transcriptomic analysis performed on bulk cells revealed a comparable response based on a 200 genes signature between the two culture systems used and a better reproducibility when using the BEAS-2B model. Next, we performed single cell transcriptomic analysis to identify potential bias linked to the ALI culture systems and differences in the biological response to the treatment at the cell subpopulations level. We identified cell-type specific responses that allowed us to establish a transcriptomic signature for each cell type composing the ALI system in response to the toxicants and a hierarchy of “responding cell types”. Individual, toxicant-specific signatures were also established.A comparison between single-cell dataset belonging to bi-dimensional and ALI system, were also performed highlighting a lack of correlation between BEAS-2B and the cell populations previously described in the tri-dimensional cultures.Overall, our results show that the ALI system associated with a single cell transcriptomic analysis can provide additional information compared to bulk transcriptomic analysis. Subsequent experiments on a larger number of non-genotoxic carcinogens will have to be performed to determine whether this methodology can provide specific signatures, predicting the non-genotoxic carcinogenic nature of toxicant

Vers l'élaboration d'un test in vitro pour prédire la nature cancérigène de composés chimiques et naturels utilisés dans l'industrie cosmétique

Toxicological tests for cosmetic products were classically performed on animal models. Prohibitive costs and evolution of the perception about animal experimentation in the general public have encouraged the development of in vitro tests capable of predicting the toxicity of compounds potentially classifiable as “CMR” (Carcinogenic, Mutagenic and/or Reprotoxic). More recently, tests based on animal experimentation have been banned in the European Union.In this work, we have compared transcriptomic signatures of non-genotoxic carcinogenic compounds on lung epithelia using bi-dimensional (such as the normal human bronchial epithelium cells, BEA-2B) and tri-dimensional (3D) cultures. 3D cultures are cells cultured in “air liquid interface” (ALI) reconstitute a differentiated epithelium composed of different types of cells (ciliated cells, goblet cells, etc.). Three known non-genotoxic carcinogens (cadmium chloride (CdCl2), hydroquinone (HQ) and Phorbol Myristate acetate (PMA)) were selected in this pilot study. ALI and BEAS-2B cultures were first analysed by microarray gene expression profiling upon incubation with the toxicants. This transcriptomic analysis performed on bulk cells revealed a comparable response based on a 200 genes signature between the two culture systems used and a better reproducibility when using the BEAS-2B model. Next, we performed single cell transcriptomic analysis to identify potential bias linked to the ALI culture systems and differences in the biological response to the treatment at the cell subpopulations level. We identified cell-type specific responses that allowed us to establish a transcriptomic signature for each cell type composing the ALI system in response to the toxicants and a hierarchy of “responding cell types”. Individual, toxicant-specific signatures were also established.A comparison between single-cell dataset belonging to bi-dimensional and ALI system, were also performed highlighting a lack of correlation between BEAS-2B and the cell populations previously described in the tri-dimensional cultures.Overall, our results show that the ALI system associated with a single cell transcriptomic analysis can provide additional information compared to bulk transcriptomic analysis. Subsequent experiments on a larger number of non-genotoxic carcinogens will have to be performed to determine whether this methodology can provide specific signatures, predicting the non-genotoxic carcinogenic nature of toxicant.Les tests toxicologiques des produits cosmétiques étaient classiquement réalisés sur des modèles animaux. Les coûts prohibitifs et l'évolution de la perception de l'expérimentation animale dans le grand public ont encouragé le développement de tests in vitro capables de prédire la toxicité de composés potentiellement classables "CMR" (Cancérigène, Mutagène et/ou Reprotoxique). Plus récemment, en cosmétique, les tests basés sur l'expérimentation animale ont été interdits dans l'Union européenne.Dans ce travail, nous avons comparé les signatures transcriptomiques de composés cancérigènes non génotoxiques sur des épithéliums pulmonaires en utilisant des cultures bi-dimensionnelles (telles que les cellules d'épithélium bronchique humain normal, BEAS-2B) et tri-dimensionnelles (3D). Les cultures 3D sont des cellules cultivées en "interface air liquide" (ALI) reconstituant un épithélium différencié composé de différents types de cellules (cellules ciliées, cellules en gobelet, etc.). Trois cancérigènes non génotoxiques connus (chlorure de cadmium (CdCl2), hydroquinone (HQ) et acétate de myristate de phorbol (PMA)) ont été sélectionnés dans cette étude pilote. Les cultures d'ALI et de BEAS-2B ont d'abord été analysées par l'établissement du profil d'expression génétique des puces à ADN lors de l'incubation avec les substances toxiques. Cette analyse transcriptomique réalisée sur une population totale a révélé une réponse comparable sur la base d'une signature de 200 gènes entre les deux systèmes de culture utilisés et une meilleure reproductibilité en utilisant le modèle BEAS-2B. Ensuite, nous avons effectué une analyse transcriptomique sur cellules uniques afin d'identifier les biais potentiels liés aux systèmes de culture ALI et les différences dans la réponse biologique au traitement au niveau des sous-populations cellulaires. Des signatures spécifiques de chaque agent toxique, ainsi qu’une hiérarchie de réponse de chaque type cellulaire ont été établies. Des signatures propres à chaque type cellulaire ont été mise en évidence, suggérant le bien-fondé basé sur une approche d’analyse transcriptomique sur cellules niques. Une comparaison entre les ensembles de données sur cellules uniques obtenues grâce au système bi-dimensionnel et au système ALI a également été effectuée, mettant en évidence un manque de corrélation entre BEAS-2B et les populations cellulaires précédemment décrites dans les cultures tri-dimensionnelles.Globalement, nos résultats montrent que le système ALI associé à une analyse transcriptomique sur cellules uniques peut fournir des informations supplémentaires par rapport à l'analyse transcriptomique sur population totale. Des expériences devront être réalisées ultérieurement sur un plus grand nombre de substances cancérigènes non génotoxiques pour déterminer si cette méthodologie peut fournir des signatures spécifiques, prédisant la nature cancérigène non génotoxique d’un composé chimique

Identification of oncolytic vaccinia restriction factors in canine high-grade mammary tumor cells using single-cell transcriptomics.

Mammary carcinoma, including triple-negative breast carcinomas (TNBC) are tumor-types for which human and canine pathologies are closely related at the molecular level. The efficacy of an oncolytic vaccinia virus (VV) was compared in low-passage primary carcinoma cells from TNBC versus non-TNBC. Non-TNBC cells were 28 fold more sensitive to VV than TNBC cells in which VV replication is impaired. Single-cell RNA-seq performed on two different TNBC cell samples, infected or not with VV, highlighted three distinct populations: naïve cells, bystander cells, defined as cells exposed to the virus but not infected and infected cells. The transcriptomes of these three populations showed striking variations in the modulation of pathways regulated by cytokines and growth factors. We hypothesized that the pool of genes expressed in the bystander populations was enriched in antiviral genes. Bioinformatic analysis suggested that the reduced activity of the virus was associated with a higher mesenchymal status of the cells. In addition, we demonstrated experimentally that high expression of one gene, DDIT4, is detrimental to VV production. Considering that DDIT4 is associated with a poor prognosis in various cancers including TNBC, our data highlight DDIT4 as a candidate resistance marker for oncolytic poxvirus therapy. This information could be used to design new generations of oncolytic poxviruses. Beyond the field of gene therapy, this study demonstrates that single-cell transcriptomics can be used to identify cellular factors influencing viral replication

Blockade of the pro‐fibrotic reaction mediated by the miR‐143/‐145 cluster enhances the responses to targeted therapy in melanoma

International audienceLineage dedifferentiation toward a mesenchymal-like state displaying myofibroblast and fibrotic features is a common mechanism of adaptive and acquired resistance to targeted therapy in melanoma. Here, we show that the anti-fibrotic drug nintedanib is active to normalize the fibrous ECM network, enhance the efficacy of MAPK-targeted therapy, and delay tumor relapse in a preclinical model of melanoma. Acquisition of this resistant phenotype and its reversion by nintedanib pointed to miR-143/-145 pro-fibrotic cluster as a driver of this mesenchymal-like phenotype. Upregulation of the miR-143/-145 cluster under BRAFi/MAPKi therapy was observed in melanoma cells in vitro and in vivo and was associated with an invasive/undifferentiated profile. The 2 mature miRNAs generated from this cluster, miR-143-3p and miR-145-5p, collaborated to mediate transition toward a drug-resistant undifferentiated mesenchymal-like state by targeting Fascin actin-bundling protein 1 (FSCN1), modulating the dynamic crosstalk between the actin cytoskeleton and the ECM through the regulation of focal adhesion dynamics and mechanotransduction pathways. Our study brings insights into a novel miRNA-mediated regulatory network that contributes to non-genetic adaptive drug resistance and provides proof of principle that preventing MAPKi-induced pro-fibrotic stromal response is a viable therapeutic opportunity for patients on targeted therapy