Identification of the GDP-N-acetyl-d-perosamine producing enzymes from Escherichia coli O157:H7

AbstractGDP-N-acetyl-d-perosamine is a precursor of the LPS-O-antigen biosynthesis in Escherichia coli O157:H7. Like other GDP-6-deoxyhexoses, GDP-N-acetyl-d-perosamine is supposed to be synthesized via GDP-4-keto-6-deoxy-d-mannose, followed by a transamination- and an acetylation-reaction catalyzed by PerA and PerB. In this study, we have overproduced and purified PerA and PerB from E. coli O157:H7 in E. coli BL21. The recombinant proteins were partly characterized and the final product of the reaction catalyzed by PerB was shown to be GDP-N-acetyl-d-perosamine by chromatography, mass spectrometry, and 1H-NMR. The functional expression of PerB provides another enzymatically defined pathway for the synthesis of GDP-deoxyhexoses, which is needed to further study the corresponding glycosyltransferases in vitro

Engineering of a plasmid-free Escherichia coli strain for improved in vivo biosynthesis of astaxanthin

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>The xanthophyll astaxanthin is a high-value compound with applications in the nutraceutical, cosmetic, food, and animal feed industries. Besides chemical synthesis and extraction from naturally producing organisms like <it>Haematococcus pluvialis</it>, heterologous biosynthesis in non-carotenogenic microorganisms like <it>Escherichia coli</it>, is a promising alternative for sustainable production of natural astaxanthin. Recent achievements in the metabolic engineering of <it>E. coli </it>strains have led to a significant increase in the productivity of carotenoids like lycopene or β-carotene by increasing the metabolic flux towards the isoprenoid precursors. For the heterologous biosynthesis of astaxanthin in <it>E. coli</it>, however, the conversion of β-carotene to astaxanthin is obviously the most critical step towards an efficient biosynthesis of astaxanthin.</p> <p>Results</p> <p>Here we report the construction of the first plasmid-free <it>E. coli </it>strain that produces astaxanthin as the sole carotenoid compound with a yield of 1.4 mg/g cdw (<it>E. coli </it>BW-ASTA). This engineered <it>E. coli </it>strain harbors xanthophyll biosynthetic genes from <it>Pantoea ananatis </it>and <it>Nostoc punctiforme </it>as individual expression cassettes on the chromosome and is based on a β-carotene-producing strain (<it>E. coli </it>BW-CARO) recently developed in our lab. <it>E. coli </it>BW-CARO has an enhanced biosynthesis of the isoprenoid precursor isopentenyl diphosphate (IPP) and produces β-carotene in a concentration of 6.2 mg/g cdw. The expression of <it>crtEBIY </it>along with the β-carotene-ketolase gene <it>crtW148 </it>(NpF4798) and the β-carotene-hydroxylase gene (<it>crtZ</it>) under controlled expression conditions in <it>E. coli </it>BW-ASTA directed the pathway exclusively towards the desired product astaxanthin (1.4 mg/g cdw).</p> <p>Conclusions</p> <p>By using the λ-Red recombineering technique, genes encoding for the astaxanthin biosynthesis pathway were stably integrated into the chromosome of <it>E. coli</it>. The expression levels of chromosomal integrated recombinant biosynthetic genes were varied and adjusted to improve the ratios of carotenoids produced by this <it>E. coli </it>strain. The strategy presented, which combines chromosomal integration of biosynthetic genes with the possibility of adjusting expression by using different promoters, might be useful as a general approach for the construction of stable heterologous production strains synthesizing natural products. This is the case especially for heterologous pathways where excessive protein overexpression is a hindrance.</p

Reaktion des somatosensiblen Systems auf Stimuli unterschiedlicher Länge

Durch die Verbesserung der technischen Möglichkeiten des Magnetresonanztomographen und die Entdeckung des blood oxygenation level dependent-Effekt (BOLD-Effekt), steht eine Untersuchungsmöglichkeit zur Verfügung, die ein völlig neues Feld der Grundlagenforschung im Bereich der funktionellen Abläufe des Zentral-Nervensystems eröffnet. Im kurzen Zeitraum von der Entwicklung im Jahre 1977 bis heute wurde einer Vielzahl an Fragestellungen nachgegangen. Im Bereich des somatosensiblen Systems waren dies insbesondere die Schmerzverarbeitung und die unterschiedlichen zentralen Reaktionen auf somatosensible Stimuli verschiedenster Stärke. Dabei wurde der Einfluss der Signallänge vernachlässigt. Es wird allgemein davon ausgegangen, dass eine Verkürzung der Stimulationsdauer eine verminderte Signalstärke nach sich zieht. Ob jedoch die Reizdauer auch einen Einfluss auf die Anzahl der im Gehirn aktivierten Gebiete besitzt, ist nicht eingehend nachgeprüft worden. Aus diesem Grund wurde in der vorliegenden Untersuchung ein Reiz-setup gewählt, das Stimuli von drei verschiedenen Längen beinhaltet. Die Reizstärke blieb dabei jedoch konstant. Das Reiz-setup bestand im Einzelnen aus einer Block-Stimulation von 25 Sekunden, einer event-related-Stimulation von 2,5 Sekunden und einer event-related-Stimulation von 0,3 Sekunden Länge. Per Elektrostimulator wurde der rechte N. medianus proximal des Handgelenkes gereizt. Durch einen Magnetresonanztomographen mit einer Feldstärke von 3 Tesla wurde die zentrale BOLD-Signalantwort gemessen. Anschließend erfolgten die Aufarbeitung und statistische Auswertung der ermittelten Daten mit einer Software (LIPSIA). In den gemessenen Daten wurden 14 Regionen identifiziert, die bei der angewandten Stimulation mit Aktivität reagierten. Für diese wurde anschließend der zeitliche Verlauf des BOLD-Signal berechnet. Es wurde jeweils die maximale Signalstärke ausgemessen und nach Stimulationsart geordnet. Daraus ergab sich für jede der 14 Regionen eine gemittelte absolute Signalstärke. Diese Untersuchung führte zu folgenden Ergebnissen: (1) Im Vergleich der aktivierten Gebiete des Zentral-Nervensystems konnte nachgewiesen werden, dass eine Stimulationsdauer von mittlerer Länge im Vergleich zu längeren bzw. kürzeren Stimulationsdauern eine signifikant höhere Anzahl an Regionen aktiviert. Es konnte weiter gezeigt werden, dass kein einfaches proportionales Verhältnis zwischen Reizdauer und Signalstärke besteht. Dieses Ergebnis sollte bei der Planung und Festlegung eines Paradigmas zukünftig mit in Betracht gezogen werden. (2) Im ipsilateralen primären somatosensiblen Kortex konnte eine Deaktivierung beobachtet werden, die proportional zur absoluten Aktivierung der kontralateralen Gegenseite ausgeprägt ist. Eine Ursache für die zeitgleiche Deaktivierung ist bisher nicht bekannt. (3) Bei der Suche nach habituierendem Verhalten wurde in zwei Regionen Anzeichen für ein solches beobachtet. Zum einen handelt es sich dabei um die oben beschriebene deaktivierte Region im ipsilateralen Kortex, und zum anderen ist dies eine Region im Grenzgebiet von Brodmann Area 5 und 7. Da die beiden aufgezählten Regionen nicht zum traditionellen somatosensiblen Kortex gehören, ist eine Habituation an diesen Orten und ihre genaue Funktion von besonderem Interesse

Kinder psychisch kranker Eltern: Winterthurer Studie : wissenschaftlicher Bericht

Das Thema der psychischen Behinderung, der psychischen Invalidisierung und der gesellschaftlichen Folgen dieser Invalidisierung für die Sozialversicherungen begleitet uns bereits seit einigen Jahren. Viel weniger interessiert sich aber die breite Öffentlichkeit für die Frage, was eine psychische Erkrankung von Eltern für deren minderjährige Kinder bedeutet. Umso wichtiger schien es uns, detaillierte und verlässliche Zahlen zu liefern, die die Situation dieser Familien aufzeigen und der Frage nachgehen, wie es mit der Unterstützungssituation aussieht

In situ Elektroporation adhärenter Säugerzellen

Säugerzellen wurden auf Goldelektroden kultiviert, um in diesem System die in situ Elektroporation (EP) adhärenter und konfluenter Zellschichten zu charakterisieren. Über die Permeabilisierung von Zellen durch Applikation von Wechselspannungspulsen sollten zur Manipulation Moleküle aus dem Extrazellularraum in die Zellen eingetragen werden. Zunächst wurden durch theoretische Betrachtungen zur EP die optimalen Parameter ermittelt. Durch in situ EP von NRK-Zellen konnte der Eintrag fluoreszenzmarkierter Dextran-Moleküle bis zu einem Molekulargewicht von 2 MDa erreicht werden (Effizienz = 85 ? 100 %). Durch Kombination der EP adhärenter Zellmonoschichten mit ECIS konnte der Einfluss des Wechselspannungspulses auf die Zellmorphologie verfolgt werden. Erstmals konnte gezeigt werden, dass durch die EP adhärenter und konfluenter Zellen mit der in dieser Arbeit verwendeten Technik unter Einsatz von Wechselspannungspulsen sowohl der Eintrag von Peptiden als auch von Nukleinsäuren möglich ist

The effect of inpatient treatment on the stress experienced by parents with an excessively crying infant

Einleitung: Bis zu 40 % der Familien im ersten Trimenon sind mit einem exzessiv schreienden Kind konfrontiert. Die belastende Situation mit diesen Kindern ist ein bedeutender Faktor, weshalb Eltern professionelle Hilfe aufsuchen. Die Unterstützung durch Fachpersonen hat grosses Potential, um die Belastung der Eltern abzubauen. Stationäre Behandlungen für Familien mit Schreiproblematik zur Belastungsreduzierung wurden in keiner der bisherigen Studien thematisiert. Ziel: Das Ziel der Studie ist aufzuzeigen, welchen Beitrag ein stationäres Setting zur Reduzierung der Belastung von Eltern mit einem exzessiv schreienden Kind leisten kann. Methode: Als Design wurde die Methodologie der Grounded Theory nach Charmaz verwendet. In halbstrukturierten Interviews wurden 13 Elternteile aus 9 Familien befragt. Resultate: Zwei Kernkategorien wurden erarbeitet. „Aus dem Ruder laufen“ beschreibt, wie die Eltern die Steuerung im Familienleben verlieren. „In eigenen Alltag finden“ beschreibt wie sie die Sicherheit zurückgewinnen und eigene Bewältigungsstrategien erarbeiten. Schlussfolgerung: Ein stationärer Spitalaufenthalt entlastet Familien mit einem exzessiv schreienden Kind. Hilfreich ist der Umgebungswechsel. Beratung und Begleitung erweitern die Kompetenzen der Eltern im Handling des Kindes. Die Belastung der Eltern kann beim Austritt wieder zunehmen. Deshalb sollte die Planung und Begleitung der Abschlussphase der Behandlung sowie des Austritts verbessert werden. Introduction: Up to 40% of families are faced with a fussy, inconsolable high need infant in the first three months postpartum. A major reason for parents to seek professional help is the trying aspect of the situation with these children. The supportive role of health professionals has the greatest potential to reduce the parent’s stress and burden. To our knowledge, there are no studies on inpatient treatment for families with such infants so far. Aim: The aim of this study is to show how an inpatient setting may reduce the stress and burden of parents with an inconsolably crying infant. Method: A grounded theory approach (Charmaz) was used to analyse semi-structured interviews of 13 parents from a total of 9 families. Results: Two core categories emerged from the data: “To get out of hand” describes how parents lose the ability to control and direct family life. “To find one’s way into daily routine” describes how they once again gain confidence and develop coping strategies. Conclusion: An inpatient treatment reduces the burden on families with inconsolably crying infants. The change in the environment is helpful. Guidance and support enhance the parents’ skill and ability to handling the infant. The stress on the parents can increase again upon hospital discharge. Therefore, improvement is needed in treatment planning and parental support at the conclusion of the hospital stay as well as upon hospital discharge

Untersuchungen zu den Alkoholmarkern Ethylglucuronid und Ethylsulfat sowie zu Fettsäureethylestern in unterschiedlichen Matrices

Der Konsum von Alkohol lässt sich unter anderem durch eine Bestimmung der direkten Alkoholmarker Ethylglucuronid (EtG), Ethylsulfat (EtS) oder ausgewählte Fettsäureethylester (FAEE) in Haaren sowie in unterschiedlichen Körperflüssigkeiten belegen. Verschiedene Nachweismethoden zur Quantifizierung von EtG bzw. FAEE in Haaren sowie von EtG und EtS in Urin wurden im Rahmen dieser Arbeit optimiert und validiert und diverse Studien zum besseren Verständnis dieser Biomarker durchgeführt. Ein empfindliches Flüssigchromatographie-Verfahren mit Tandem-Massenspektrometrie-Kopplung (LC-MS/MS) mit einer Bestimmungsgrenze (4 pg/mg) deutlich unterhalb des aktuellen Grenzwertes für Abstinenzuntersuchungen (7 pg/mg) wurde erfolgreich optimiert und validiert. Eine erneute Optimierung der Methode, erforderlich aufgrund vermehrt aufgetretener Störsignale, wurde mit der Entwicklung eines automatisierten Mahlverfahrens für die Haare verknüpft. Erstmals durchgeführte, vergleichende Analysen von Haarproben im gemahlenen bzw. geschnittenen Zustand konnten zeigen, dass ein Mahlen der Haare zu signifikant höheren EtG-Konzentrationen mit einem durchschnittlichen Anstieg von 51% führte. Zur Absicherung von grenzwertigen Resultaten durch einen unabhängigen Parameter wurde eine Methode zum Nachweis der vier FAEE: Ethylmyristat, Ethylpalmitat, Ethyloleat und Ethylstearat in Haaren mittels Festphasenmikroextraktion und Gaschromatographie mit Massenspektrometrie (SPME-GC-MS), mit besonderem Augenmerk auf den unteren Konzentrationsbereich, optimiert und erfolgreich validiert. Es wurden niedrige Nachweisgrenzen (0,016 – 0,025 ng/mg) sowie gute Resultate für die Präzision und Genauigkeit mit Abweichungen =11% erreicht. Eine Bestimmung der EtG- und FAEE-Konzentrationen in 160 zufällig ausgewählten Haarproben aus Abstinenzuntersuchungen wurde durchgeführt, um den Grad der Übereinstimmung beider Marker zu ermitteln. Unter Berücksichtigung der von der Society of Hair Testing (SoHT) empfohlenen Grenzwerte wurden Übereinstimmungen in 77,5% der Fälle gefunden. Ein nahezu deckungsgleiches Ergebnis ergab eine weitere Analyse von 73 Haarproben mit grenzwertigen EtG-Konzentrationen (4 – 10 pg/mg). Mögliche Gründe für die gefundenen Abweichungen werden ausführlich diskutiert. In einer zweiten Studie wurden die EtG- und FAEE-Konzentrationen in 247 Haarsegmenten von 73 Patienten im Alkoholentzug mit deren Selbstauskünften verglichen. Eine übereinstimmende Einteilung von allen drei Parametern in die drei Klassen: abstinent, moderater oder exzessiver Konsum wurde in 43,9% der untersuchten Segmente gefunden. Die beste Übereinstimmung (76,7%) wurde für EtG bei einer Beschränkung auf das proximale Segment erreicht. Eine direkte Korrelation zu den angegebenen Trinkmengen wurde weder für EtG noch für die FAEE ermittelt. Beide Studien deuten darauf hin, dass EtG der verlässlichere Alkoholmarker zu sein scheint und daher primär zum Ausschluss einer Abstinenz eingesetzt werden sollte. In kritischen Fällen ist eine zusätzliche Bestimmung der FAEE-Konzentrationen zu empfehlen. Eine schnelle und einfache LC-MS/MS-Methode zum Nachweis von EtG und EtS in Urin mit sehr niedrigen Bestimmungsgrenzen von 0,019 mg/L bzw. 0,015 mg/L wurde erfolgreich optimiert und validiert. Zudem konnte gezeigt werden, dass der zur Verfügung stehende klinisch-chemische Analyzer für eine semiquantitative Bestimmung von EtG in Urin geeignet war. Der aktuelle EtG-Grenzwert in Urin für Abstinenzuntersuchungen von 0,1 mg/L wird unter anderem aufgrund des Verdachts von falsch positive Ergebnissen durch den Konsum oder Gebrauch von alkoholhaltigen Lebensmitteln und Hygieneprodukten fortwährend diskutiert. Durch die durchgeführten kontrollierten Trink- und Essversuche mit alkoholhaltigen Lebensmitteln konnte deutlich gemacht werden, dass ein Nachweis von EtG und EtS in Urin höchstenfalls nach einem übermäßigen Konsum der getesteten Produkte (Apfelsaft, Traubensaft, Weinsauerkraut, überreife Bananen und alkoholfreies Bier) und über einen sehr begrenzten Zeitraum möglich ist. Ein weiterer Trinkversuch ergab, dass selbst ein Grenzwert von 0,1 mg/L in Kombination mit einer Einbestellungsfrist von 24 h nicht zum Nachweis einer strikten Abstinenz geeignet ist, sondern nur zum Ausschluss dieser. Die Ergebnisse beider Versuchsreihen zeigten deutlich, dass auch die aufgenommenen Flüssigkeitsmengen einen großen Einfluss sowohl auf die gemessenen Konzentrationen als auch auf die Nachweisfenster hatten

The role of well-child visits in detecting developmental delay in preschool children

Background: Early detection of developmental delay (DD) in preschool children is crucial for counselling parents, initiating diagnostic work-up, and starting early intervention (EI). Methods: We conducted a register study of all preschool children referred for EI in the Canton of Zurich, Switzerland, in 2017 (N = 1,785) and used an online survey among primary care physicians (PCPs, N = 271) to evaluate the care service of DD children. Results: PCPs accounted for 79.5% of all referrals by physicians and had correctly referred over 90% of the children in need of EI at an average age of 39.3 months (SD 8.9). In the survey, which represents 59.2% of all pediatricians and 11.3% of all general practitioners in the Canton, PCPs reported performing a mean of 13.5 (range 0-50, SD 10.7) well-child visits per week to preschool children and estimated well-child visits to be the most frequent type of consultation (66.7%) for the identification of DD. Parents' hesitancy in accepting further evaluation or support were reported by 88.7%. Conclusions: Most preschool children with DD are identified in well-child visits. These visits represent an ideal opportunity for early detection of developmental impairment and initiation of EI. Carefully addressing parents' reservations could reduce the rate of refusal, thus improving early support for children with DD

«Teaching» in der Medizin: leicht zu lernen!

CBMEJede Ärztin und jeder Arzt geben Wissen weiter, so selbstverständlich wie fast jeder schwimmen kann. Nicht alle wollen dabei Medaillen gewinnen – ebenso wie beim Lehren in der Medizin. Basiskompetenzen sind jedoch einfach zu erwerben und müssen nicht dem Zufall überlassen werden. Dieser Beitrag skizziert Grundprinzipien des Lehrens und zeigt Wege zur individuellen Weiterentwicklung auf

Diagnosis and management of ADHD: a pediatric perspective on practice and challenges in Switzerland

Background: Attention deficit/hyperactivity disorder (ADHD) is one of the most prevalent psychiatric disorders in childhood. In Switzerland, the complex diagnosis and treatment are being carried out by adolescent-/child psychiatrists, and pediatricians. Guidelines recommend a multimodal therapy for patients with ADHD. However, it has been questioned whether health professionals follow this approach or favor drug therapy. This study aims to provide insights into the practice of pediatricians in Switzerland regarding diagnosis and treatment of ADHD and their perceptions of these processes. Method: An online survey (self-report) about current practices of diagnosis and management as well as challenges regarding ADHD was distributed to office-based pediatricians in Switzerland. One hundred fifty-one pediatricians participated. Results show that therapy options were almost always discussed with parents and older children. Exchange with parents (81%) and level of child's suffering (97%) were central when selecting therapy options. Results: Therapies about which pediatricians informed most often were: pharmacological therapy, psychotherapy, and multimodal therapy. Challenges voiced were the subjectivity of diagnostic criteria and dependence on third parties, low availability of psychotherapy, and a rather negative public attitude towards ADHD. Needs that were expressed were further education for all professionals, support for coordination with specialists and schools as well as improvement of information on ADHD. Conclusions: Pediatricians do consider a multimodal approach when treating ADHD and take the families` and children's opinions into account. Improvements of the availability of child and youth psychotherapy, the strengthening of the interprofessional cooperation with therapists and schools, and efforts to increase public knowledge about ADHD are proposed