Electrochemical Nanoprobes for Single-Cell Analysis

The measurement of key molecules in individual cells with minimal disruption to the biological milieu is the next frontier in single-cell analyses. Nanoscale devices are ideal analytical tools because of their small size and their potential for high spatial and temporal resolution recordings. Here, we report the fabrication of disk-shaped carbon nanoelectrodes whose radius can be precisely tuned within the range 5–200 nm. The functionalization of the nanoelectrode with platinum allowed the monitoring of oxygen consumption outside and inside a brain slice. Furthermore, we show that nanoelectrodes of this type can be used to impale individual cells to perform electrochemical measurements within the cell with minimal disruption to cell function. These nanoelectrodes can be fabricated combined with scanning ion conductance microscopy probes, which should allow high resolution electrochemical mapping of species on or in living cells

How to understand sensory neurons: from structurefunction studies to nanotechnology development

El dolor patológico es un problema que afecta a un gran número de personas en todo el mundo y cuyo tratamiento presenta importantes deficiencias. Para poder mejorar la calidad de vida de los pacientes es necesario que se incremente el grado de conocimiento de los procesos que llevan al establecimiento de estas patologías. Con este objetivo se ha invertido un gran esfuerzo en el estudio de los canales iónicos TRP (de las siglas en inglés Transient Receptor Potential). En concreto, se ha demostrado que los canales TRPV1, TRPM8 y TRPA1 son proteínas clave en el mecanismo de transducción del dolor. En esta tesis se afronta el estudio de este complejo proceso utilizando diferentes aproximaciones.En primer lugar, Capítulo 1, se realizó un estudio de las relaciones estructura-función en el dominio TRP de los canales TRPM8 siguiendo una estrategia de mutagénesis dirigida. Esta aproximación dio como resultado el descubrimiento de regiones de la proteína esenciales para el correcto funcionamiento de la misma y que podrían ser excelentes dianas para el diseño de nuevos fármacos analgésicos. En particular, las posiciones 981, 986, 989 y 990 se identificaron como determinantes moleculares de la función de los canales TRPM8, estando principalmente implicados en la regulación alostérica del proceso de apertura y cierre del canal. En el Capítulo 2 se abordó el desarrollo de un sistema de nanoaplicación de capsaicina (un activador del canal TRPV1). El objetivo era obtener una herramienta que permitiese la estimulación local de estos receptores en la superficie de la membrana neuronal para facilitar el estudio de su implicación en la sensación del dolor. El trabajo realizado demostró la posibilidad de utilizar nanopipetas para conseguir una aplicación cuantitativa y localizada. Además, se desarrolló un sistema que permite la aplicación de capsaicina en regiones subcelulares de las neuronas sensoriales de modo automatizado.Por último, en el Capítulo 3, se llevó a cabo el desarrollo de otra herramienta nanotecnológica para realizar medidas intracelulares de especies reactivas de oxígeno o ROS (de las siglas en inglés Reactive Oxygen Species). Este instrumento podría ayudar a comprender el efecto que estas especies tienen en el establecimiento de estados de dolor crónico. Los resultados mostraron la aplicabilidad de nanoelectrodos de carbono modificados con el electrocatalizador Azul de Prusia para la detección de peróxido de hidrógeno. Además se demostró la posibilidad de usarlos intracelularmente

Local delivery of molecules from a nanopipette for quantitative receptor mapping on live cells

Using nanopipettes to locally deliver molecules to the surface of living cells could potentially open up studies of biological processes down to the level of single molecules. However, in order to achieve precise and quantitative local delivery it is essential to be able to determine the amount and distribution of the molecules being delivered. In this work, we investigate how the size of the nanopipette, the magnitude of the applied pressure or voltage, which drives the delivery, and the distance to the underlying surface influences the number and spatial distribution of the delivered molecules. Analytical expressions describing the delivery are derived and compared with the results from finite element simulations and experiments on delivery from a 100 nm nanopipette in bulk solution and to the surface of sensory neurons. We then developed a setup for rapid and quantitative delivery to multiple subcellular areas, delivering the molecule capsaicin to stimulate opening of Transient Receptor Potential Vanilloid subfamily member 1 (TRPV1) channels, membrane receptors involved in pain sensation. Overall, precise and quantitative delivery of molecules from nanopipettes has been demonstrated, opening up many applications in biology such as locally stimulating and mapping receptors on the surface of live cells