5 research outputs found
Electrochemical Nanoprobes for Single-Cell Analysis
The measurement of key molecules in individual cells with minimal disruption to the biological milieu is the next frontier in single-cell analyses. Nanoscale devices are ideal analytical tools because of their small size and their potential for high spatial and temporal resolution recordings. Here, we report the fabrication of disk-shaped carbon nanoelectrodes whose radius can be precisely tuned within the range 5–200 nm. The functionalization of the nanoelectrode with platinum allowed the monitoring of oxygen consumption outside and inside a brain slice. Furthermore, we show that nanoelectrodes of this type can be used to impale individual cells to perform electrochemical measurements within the cell with minimal disruption to cell function. These nanoelectrodes can be fabricated combined with scanning ion conductance microscopy probes, which should allow high resolution electrochemical mapping of species on or in living cells
How to understand sensory neurons: from structurefunction studies to nanotechnology development
El dolor patológico es un problema que afecta a un gran número de personas en todo
el mundo y cuyo tratamiento presenta importantes deficiencias. Para poder mejorar la
calidad de vida de los pacientes es necesario que se incremente el grado de
conocimiento de los procesos que llevan al establecimiento de estas patologías. Con
este objetivo se ha invertido un gran esfuerzo en el estudio de los canales iónicos TRP
(de las siglas en inglés Transient Receptor Potential). En concreto, se ha demostrado
que los canales TRPV1, TRPM8 y TRPA1 son proteínas clave en el mecanismo de
transducción del dolor. En esta tesis se afronta el estudio de este complejo proceso
utilizando diferentes aproximaciones.En primer lugar, Capítulo 1, se realizó un estudio de las relaciones estructura-función
en el dominio TRP de los canales TRPM8 siguiendo una estrategia de mutagénesis
dirigida. Esta aproximación dio como resultado el descubrimiento de regiones de la
proteína esenciales para el correcto funcionamiento de la misma y que podrían ser
excelentes dianas para el diseño de nuevos fármacos analgésicos. En particular, las
posiciones 981, 986, 989 y 990 se identificaron como determinantes moleculares de la
función de los canales TRPM8, estando principalmente implicados en la regulación
alostérica del proceso de apertura y cierre del canal.
En el Capítulo 2 se abordó el desarrollo de un sistema de nanoaplicación de
capsaicina (un activador del canal TRPV1). El objetivo era obtener una herramienta
que permitiese la estimulación local de estos receptores en la superficie de la
membrana neuronal para facilitar el estudio de su implicación en la sensación del
dolor. El trabajo realizado demostró la posibilidad de utilizar nanopipetas para
conseguir una aplicación cuantitativa y localizada. Además, se desarrolló un sistema
que permite la aplicación de capsaicina en regiones subcelulares de las neuronas
sensoriales de modo automatizado.Por último, en el Capítulo 3, se llevó a cabo el desarrollo de otra herramienta
nanotecnológica para realizar medidas intracelulares de especies reactivas de oxígeno
o ROS (de las siglas en inglés Reactive Oxygen Species). Este instrumento podría
ayudar a comprender el efecto que estas especies tienen en el establecimiento de
estados de dolor crónico. Los resultados mostraron la aplicabilidad de nanoelectrodos
de carbono modificados con el electrocatalizador Azul de Prusia para la detección de
peróxido de hidrógeno. Además se demostró la posibilidad de usarlos
intracelularmente
Local delivery of molecules from a nanopipette for quantitative receptor mapping on live cells
Using nanopipettes to locally deliver molecules to the surface of living cells could potentially open up studies of biological processes down to the level of single molecules. However, in order to achieve precise and quantitative local delivery it is essential to be able to determine the amount and distribution of the molecules being delivered. In this work, we investigate how the size of the nanopipette, the magnitude of the applied pressure or voltage, which drives the delivery, and the distance to the underlying surface influences the number and spatial distribution of the delivered molecules. Analytical expressions describing the delivery are derived and compared with the results from finite element simulations and experiments on delivery from a 100 nm nanopipette in bulk solution and to the surface of sensory neurons. We then developed a setup for rapid and quantitative delivery to multiple subcellular areas, delivering the molecule capsaicin to stimulate opening of Transient Receptor Potential Vanilloid subfamily member 1 (TRPV1) channels, membrane receptors involved in pain sensation. Overall, precise and quantitative delivery of molecules from nanopipettes has been demonstrated, opening up many applications in biology such as locally stimulating and mapping receptors on the surface of live cells