Genetical, structural and functional characterization of the human BTNL gene cluster

La família B7 de proteïnes és àmpliament reconeguda per jugar un paper important en els processos inflamatoris mitjançant l'alteració de la capacitat de resposta de les cèl•lules T. La unió d’aquestes proteïnes als seus receptors situats a la superfície de cèl•lules T pot promoure (per exemple, B7-1, B7-2, ICOS- L) o inhibir (per exemple, PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7x) l'activació, la proliferació, la maduració i la producció de citoquines en cèl•lules T . A més, s’ha identificat l’expressió de diversos membres d’aquesta família de proteïnes tant en diferents tipus de tumors com en el microambient tumoral. Degut a les capacitats immunosupressores de diversos membres de la família B7, es creu que l'expressió aberrant d'aquestes molècules a interferit negativament amb la resposta immune de l' hoste, el que porta a la progressió de la malaltia. En efecte, l'expressió de proteïnes de la família B7 en molts tumors hematològics malignes s'associa sovint amb un mal pronòstic i un comportament agressiu dels tumors. Actualment, diversos membres de la família B7, com CTLA-1 i PD-1 són usats per el tractament del càncer i, més recentment , el primer agent que focalitza la via de B7, el anti-CTLA-4 MAB (ipilimumab) ha estat aprovat per l'Administració d'Aliments i Medicaments (FDA) per al tractament del melanoma metastàsic. A més, els estudis en curs dirigits a membres recentment descrits de la família B7: B7-H3, B7x, B7-H6 són prometedors , però una major clarificació del seu paper patogènic en malalties hematològiques ajudarà a identificar el seu paper més actiu com a adjuvants immunes al tractament convencional. Tot i els grans grans progressos en aquest camp , es coneix poc de les proteïnes homòlogues butyrophilin-like (BTNL). La família butyrophilin (BTN) comparteix homologia estructural amb membres de la família B7 i similars a les proteïnes B7. Gairebé tots els BTNS / BTNLs estudiats fins al moment han demostrat ser capaços d'esmorteir la resposta immune mitjançant la co-estimulació negativa en l’activació del les cèl•lules T, fent-les candidates importants en la immunitat antitumoral. Per tant, en aquest estudi, caracteritzem un clúster que conté tres gens BTNL, situats al cromosoma humà 5q35.3, a nivell genòmic, transcripcional i funcional per obtenir una visió més clara en la funció de les proteïnes BTNL. En el primer capítol, presentem la identificació d’una deleció d’una variant en nombre de còpia (CNV en anglès) de 56 kb donant com a producte un nou gen quimèric (BTNL8*3). Aquesta deleció és responsable de la sobre-expressió del tercer gen del clúster, BTNL9. Posteriorment, es desenvolupà un assaig de genotipació i es va dur a terme un anàlisi poblacional d’aquesta variant en mostres de diferents poblacions pertanyents al HapMap i el panell de diversitat humana (HGDP-CEPH). Aquest assaig de genotipació ens va permetre identificar clares diferències en l’estratificació de l’aŀlel BTNL8_BTNL3-del entre grups continentals majors. A més, presentem tagging SNPs en diverses poblacions, facilitant una genotipació futura de la variant de deleció BTNL8-BTNL3. Finalment mostrem la influència de la deleció CNV en els nivells d’expressió de diferents gens involucrats en càncer i en la resposta immune, suggerint la involucració d’aquesta CNV en rutes biològiques específiques. En el segon capítol d’aquesta tesi s’investiguen les conseqüències funcionals de la CNV trobant una sobre-expressió de BTNL9 en leucèmia limfoblàstica aguda (ALL en anglès) després del subministrament de glucocorticoides (GC). S’havia mostrat ja prèviament que uns nivells elevats de BTNL9 correlacionen amb un elevat risc en pacients de ALL amb reorganització de MLL-AF4. Per comprovar si aquesta observació és deguda a la implicació de BTNL9 en apoptosi induïda per GC, es varen analitzar diferents línies ceŀlulars pre-B ALL trobant-se una clara correlació entre els nivells d’expressió de BTNL9 i resistència a GC en ALL amb reorganització de MLL i nivells més baixos en MLL en ALL germinal. Aquests resultats suggereixen un paper completament nou i inesperat de la proteïna BTNL que podrien resultar en el desenvolupament de inhibidors específics de BTNL9 per millorar la prognosi de ALL amb reorganització de MLL. En resum, en aquesta tesi proporcionem un anàlisi del clúster de gens humà BTNL. Identifiquem un nou gen de fusió BTNL8*3 amb implicacions potencials en rutes genètiques involucrades en la regulació i proliferació immune i mostrem una clara funció de BTNL9 en la resistència a GC el la leucèmia amb reorganització de MLL. Aquestes observacions proporcionen un nou coneixement sobre la família de gens BTNL i podria proporcionar la base per noves teràpies basades en BTNL9 en ALL amb reorganització de MLL.In this thesis, we undertook a broad genomic, evolutionary, transcriptomic and functional analysis of a cluster containing three BTNL genes, namely BTNL8, BTNL3 and BTNL9, located on human chromosome 5q35.3. In the first chapter we report the identification of a 56 kb deletion copy number variant (CNV), which results in the formation of a novel chimeric gene, BTNL8*3, and leads to an upregulation in the expression-level of the third gene in the cluster, BTNL9. Next, we developed a genotyping assay and undertook a population analysis of this variant in several Hap Map and human diversity panel (HGDP-CEPH) populations. With this genotyping assay we could identify clear differences in the stratification of the BTNL8_BTNL3-del allele amongst major continental ethnic groups. In addition we report tagging SNPs in several population, facilitating the genotyping process of the BTNL8-BTNL3 deletion variant in the future. Moreover, we show an influence of the deletion CNV in the expression-level of several genes involved in cancer and immune response, suggesting an involvement of this CNV in specific biological pathways. In the second chapter we look for functional consequences of this CNV and found an upregulation of BTNL9 in acute lymphoblastic leukemia (ALL) after glucocorticoid (GC) treatment. Previously, it was shown that high-level BTNL9 correlates with high-risk in MLL-AF4 rearranged acute lymphoblastic leukemia (ALL) patients. To check whether this might be due to in involvement of BTNL9 in GC-induced apoptosis, we analyzed several pre-B ALL cell-lines and found a clear correlation between BTNL9 expression-level and resistance to GC in MLL rearranged ALL and at a lower level in MLL germ-line ALL. These results suggest a completely new and unexpected role for a BTNL protein and may led to the development of specific BTNL9 inhibitors to improve outcome of MLL rearranged ALL. Overall, we provide a comprehensive analysis of a BTNL gene cluster. We identified a new BTNL8*3 fusion-gene with potential implication in genetic pathways involved in immune regulation and proliferation, and show a clear function for BTNL9 in GC-resistance in MLL rearranged leukemia. This knowledge sheds more light on the BTNL family and may provide the basis for novel approaches using BTNL9 in MLL rearranged ALL therapy

A common 56-kilobase deletion in a primate-specific segmental duplication creates a novel butyrophilin-like protein

Background: The Butyrophilin-like (BTNL) proteins are likely to play an important role in inflammation and immune response. Like the B7 protein family, many human and murine BTNL members have been shown to control T lymphocytes response, and polymorphisms in human BTNL2 have been linked to several inflammatory diseases, such as pulmonary sarcoidosis, inflammatory bowel disease and neonatal lupus. Results: In this study we provide a comprehensive population, genomic and transcriptomic analysis of a 56-kb deletion copy number variant (CNV), located within two segmental duplications of two genes belonging to the BTNL family, namely BTNL8 and BTNL3. We confirm the presence of a novel BTNL8*3 fusion-protein product, and show an influence of the deletion variant on the expression level of several genes involved in immune function, including BTNL9, another member of the same family. Moreover, by genotyping HapMap and human diversity panel (HGDP) samples, we demonstrate a clear difference in the stratification of the BTNL8_BTNL3-del allele frequency between major continental human populations. Conclusion: Despite tremendous progress in the field of structural variation, rather few CNVs have been functionally characterized so far. Here, we show clear functional consequences of a new deletion CNV (BTNL8_BTNL3-del) with potentially important implication in the human immune system and in inflammatory and proliferative disorders. In addition, the marked population differences found of BTNL8_BTNL3-del frequencies suggest that this deletion CNV might have evolved under positive selection due to environmental conditions in some populations, with potential phenotypic consequences.The project was supported by grants from Obra Social La Caixa to J.A.; the Ramon y Cajal program to R.R.; the Spanish Ministry of Science and Innovation, Instituto de Salud Carlos III with the grants "Registro BASICMAR" Funding for Research in Health (PI051737), "GWALA project" from Fondos de Investigación Sanitaria ISC III (PI10/02064); and Fondos FEDER/EDRF Red de Investigación Cardiovascular (RD12/0042/0020) and the Fundació la Marató TV3 with the grant "GOD's project. Genestroke Consortium" (76/C/2011) to J.R. and J.J.C.; the Spanish Ministry of Science and Innovation (SAF2008-00357to NOVADIS project); the European Commission (ENGAGE project and grant agreement HEALTH-F4-2007-201413); and the Generalitat de Catalunya (Agència de Gestió d’Ajuts Universitaris i de Recerca-AGAUR) to X.