Endothelin system in intestinal villi: A possible role of endothelin-2/vasoactive intestinal contractor in the maintenance of intestinal architecture

The endothelin system consists of three ligands (ET-1, ET-2 and ET-3) and at least two receptors (ETA and ETB). In mice ET-2 counterpart is a peptide originally called " vasoactive intestinal contractor" (VIC) for this reason, this peptide is frequently named ET-2/VIC. In intestinal villi, fibroblasts-like cells express endothelin's receptors and response to ET-1 and ET-3 peptides, changing their cellular shape. Several functions have been attributed to these peptides in the " architecture" maintenance of intestinal villi acting over sub-epithelial fibroblasts. Despite this, ET-2/VIC has not been analyzed in depth. In this work we show the intestine gene expression and immunolocalization of ET-1, ET-2 and the ETA and ETB receptors from duodenum to rectus and in the villus-crypt axis in mice, allowing a complete analysis of their functions. While ET-1 is expressed uniformly, ET-2 had a particular distribution, being higher at the bottom of the villi of duodenum, ileum and jejunum and reverting this pattern in the crypts of colon and rectus, where the higher expression was at the top. We postulated that ET-2 would act in a cooperative manner with ET-1, giving to the villus the straight enough to withstand mechanical stress.Fil: Bianchi, Mariana. Universidad Nacional de Entre Ríos. Facultad de Ingeniería. Departamento de Biología. Laboratorio de Microscopía; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Adur, Javier Fernando. Universidad Nacional de Entre Ríos. Facultad de Ingeniería. Departamento de Biología. Laboratorio de Microscopía; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Takizawa, Satoshi. Institute for Biological Resources and Functions; JapónFil: Saida, Kaname. Soka University; Japón. Institute for Biological Resources and Functions; JapónFil: Casco, Victor Hugo. Universidad Nacional de Entre Ríos. Facultad de Ingeniería. Departamento de Biología. Laboratorio de Microscopía; Argentin

Tumor extracellular matrix: lessons from the second-harmonic generation microscopy

Extracellular matrix (ECM) represents more than a mere intercellular cement. It is physiologically active in cell communication, adhesion and proliferation. Collagen is the most abundant protein, making up to 90% of ECM, and 30% of total protein weight in humans. Second-harmonic generation (SHG) microscopy represents an important tool to study collagen organization of ECM in freshly unfixed tissues and paraffin-embedded tissue samples. This manuscript aims to review some of the applications of SHG microscopy in Oncologic Pathology, mainly in the study of ECM of epithelial tumors. It is shown how collagen parameters measured by this technique can aid in the differential diagnosis and in prognostic stratification. There is a tendency to associate higher amount, lower organization and higher linearity of collagen fibers with tumor progression and metastasizing. These represent complex processes, in which matrix remodeling plays a central role, together with cancer cell genetic modifications. Integration of studies on cancer cell biology and ECM are highly advantageous to give us a more complete picture of these processes. As microscopic techniques provide topographic information allied with biologic characteristics of tissue components, they represent important tools for a more complete understanding of cancer progression. In this context, SHG has provided significant insights in human tumor specimens, readily available for Pathologists.Fil: de Andrade Natal, Rodrigo. Universidade Estadual de Campinas; BrasilFil: Adur, Javier Fernando. Universidad Nacional de Entre Ríos. Instituto de Investigación y Desarrollo en Bioingeniería y Bioinformática - Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe. Instituto de Investigación y Desarrollo en Bioingeniería y Bioinformática; ArgentinaFil: Lenz Cesar, Carlos. Universidade Estadual de Campinas; BrasilFil: Vassallo, José. Universidade Estadual de Campinas; Brasi

Colon adenocarcinoma diagnosis in human samples by multicontrast nonlinear optical microscopy of hematoxylin and eosin stained histological sections

Combined multimodal nonlinear optical (NLO) microscopies were used to detect and quantify morphological changes associated with stroma and epithelial transformation in colon cancer. Our findings provide complementary information about tissue microstructure, displaying distinctive patterns between normal and malignant human colon. Additionally, we have demonstrated the usefulness of using fixed tissues for the disease diagnostic and prognostic. The present work provides a framework for using NLO techniques as a clinical diagnostic tool for human colon cancer. NLO metrics could be applied to other disorders, which are characterized by abnormal cell proliferation and collagen assembly.Fil: Adur, Javier Fernando. Universidad Nacional de Entre Ríos. Facultad de Ingeniería; Argentina. National Institute of Science and Technology on Photonics Applied to Cell Biology; Brasil. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones y Transferencia de Entre Ríos. Universidad Nacional de Entre Ríos. Centro de Investigaciones y Transferencia de Entre Ríos; ArgentinaFil: Bianchi, Mariana. Universidad Nacional de Entre Ríos. Facultad de Ingeniería; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Pelegati, Vitor B.. National Institute of Science and Technology on Photonics Applied to Cell Biology; BrasilFil: Viale, Silvia. Universidad Nacional de Entre Ríos. Facultad de Ingeniería; ArgentinaFil: Izaguirre, María Fernanda. Universidad Nacional de Entre Ríos. Facultad de Ingeniería; ArgentinaFil: Carvalho, Hernandes Faustino. Universidade Estadual de Campinas; BrasilFil: Cesar, Carlos L.. Universidade Estadual de Campinas; BrasilFil: Casco, Victor Hugo. Universidad Nacional de Entre Ríos. Facultad de Ingeniería; Argentin

Comparison of morphological changes of corneal collagen fibers treated with collagen crosslinking agents using second harmonic generation images

Corneal cross-linking (CXL) is a common surgical procedure used to modify corneal biomechanics and stabilize keratoconus progression which is still under discussion. Its side effects, which are mostly related to anatomical unpredictability and stromal exposure, are the reason for the search for new CXL agents. In this work we have quantitatively evaluated the porcine corneal stroma architecture treated with collagen crosslinking agents such as riboflavin solutions and açai extract, using second harmonic generation microscopy. Aimed at evaluating the morphological changes in the corneal stroma after collagen crosslinking under a CXL chemical agent, a tubeness filter based Hessian matrix to obtain a 3D fiber characterization of the SHG images was applied. The results showed a curling effect and shortening of the collagen fibers treated with açai as compared to the control. They also showed a higher degree of clustering of the collagen fibers with larger empty spaces when compared to the other two groups. We believe that studies such as these presented in this paper are a good direct nondestructive and free labeling evaluation technique that allows the observation of morphologic features of corneas treated with new CXL agents.Fil: Zeitoune, Angel Alberto. Universidad Nacional de Entre Ríos. Instituto de Investigación y Desarrollo en Bioingeniería y Bioinformática - Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe. Instituto de Investigación y Desarrollo en Bioingeniería y Bioinformática; ArgentinaFil: Bersanetti, Patrícia A.. Universidade Federal de Sao Paulo; BrasilFil: Schor, Paulo. Universidade Federal de Sao Paulo; BrasilFil: Erbes, Luciana Ariadna. Universidad Nacional de Entre Ríos. Instituto de Investigación y Desarrollo en Bioingeniería y Bioinformática - Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe. Instituto de Investigación y Desarrollo en Bioingeniería y Bioinformática; ArgentinaFil: Cesar, Carlos L.. Instituto Nacional de Fotônica Aplicada à Biologia Celular; Brasil. Universidade Federal do Ceara; BrasilFil: Adur, Javier Fernando. Universidad Nacional de Entre Ríos. Instituto de Investigación y Desarrollo en Bioingeniería y Bioinformática - Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe. Instituto de Investigación y Desarrollo en Bioingeniería y Bioinformática; Argentin

Quantification of Collagen Fiber Orientation and Organization by Singular Value Decomposition

Second-harmonic generation microscopy is a new imaging tool that allows analyzing non-centrosymmetric structures, such as collagen. This method can be used to detect structural organization of human ovarian extracellular matrix. Collagen remodeling can be used as early indicator of disease states, such as tumor development and invasiveness. Scoring structural characteristics like main collagen orientation and organization do allow differentiating between healthy and cancerous tissue. In this report, it is proposed a new method to calculate the main orientation angle as well as the degree of collagen fibers organization. The algorithm is based on the analysis of image Fourier transform modulus, characterizing spectral distribution by using singular value decomposition. The preliminary results obtained in this work demonstrate that the method allows to discriminate healthy from cancerous tissue.Fil: Zeitoune, Angel Alberto. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones y Transferencia de Entre Ríos. Universidad Nacional de Entre Ríos. Centro de Investigaciones y Transferencia de Entre Ríos; ArgentinaFil: Erbes, Luciana Ariadna. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones y Transferencia de Entre Ríos. Universidad Nacional de Entre Ríos. Centro de Investigaciones y Transferencia de Entre Ríos; ArgentinaFil: Casco, Victor Hugo. Universidad Nacional de Entre Ríos. Facultad de Ingeniería; ArgentinaFil: Adur, Javier Fernando. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones y Transferencia de Entre Ríos. Universidad Nacional de Entre Ríos. Centro de Investigaciones y Transferencia de Entre Ríos; Argentina. Universidad Nacional de Entre Ríos. Facultad de Ingeniería; Argentin

Development of a segmentation method for crypts of Lieberkühn detection using autofluorescence colon images

A nivel mundial, el cáncer colorrectal es una de las enfermedades con mayor impacto, cuyo pronóstico se relaciona con una detección temprana y posterior tratamiento. El procesamiento de imágenes de autofluorescencia provenientes de muestras de tejido de colon permite detectar y segmentar las aperturas de las criptas de Lieberkühn. El procedimiento se lleva a cabo utilizando información proveniente de fluoróforos endógenos. La segmentación es esencial para la cuantificación automática del tipo y distribución de las aperturas de las criptas presentes en cada tejido, en relación a los patrones establecidos por Kudo. La etapa de la patología es estimada en base a dichos patrones. Por lo tanto, se diseñó un método para segmentar las aperturas de las criptas a partir de imágenes de tejido de colon, las cuales fueron obtenidas a través de microscopía de autofluorescencia de campo amplio.Colorectal cancer is one of the diseases with the greatest impact worldwide. It is very well known that the pathology prognosis is linked to an early detection and subsequent treatment. The processing of colon autofluorescence images allows the detection and segmentation of the pits from the crypts of Lieberkühn. The procedure is done by using information coming from endogenous fluorophores. The segmentation is essential to automatically quantify the type and distribution of the pits in each tissue according the patterns established by Kudo. Based on that pattern, the pathology is staged. Therefore, a method was designed to segment the pits from colon tissue images obtained by widefield autofluorescence microscopy.Fil: Erbes, Luciana Ariadna. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones y Transferencia de Entre Ríos. Universidad Nacional de Entre Ríos. Centro de Investigaciones y Transferencia de Entre Ríos; ArgentinaFil: Zeitoune, Angel Alberto. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones y Transferencia de Entre Ríos. Universidad Nacional de Entre Ríos. Centro de Investigaciones y Transferencia de Entre Ríos; ArgentinaFil: Bianchi, Mariana. Universidad Nacional de Entre Ríos. Facultad de Ingeniería; ArgentinaFil: Ruff, Silvana. Universidad Nacional de Entre Ríos. Facultad de Ingeniería; ArgentinaFil: Casco, Victor Hugo. Universidad Nacional de Entre Ríos. Facultad de Ingeniería; ArgentinaFil: Adur, Javier Fernando. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones y Transferencia de Entre Ríos. Universidad Nacional de Entre Ríos. Centro de Investigaciones y Transferencia de Entre Ríos; Argentina. Universidad Nacional de Entre Ríos. Facultad de Ingeniería; Argentin

Epithelial Ovarian Cancer Diagnosis of SecondHarmonic Generation Images: A Semiautomatic Collagen Fibers Quantification Protocol

A vast number of human pathologic conditions are directly or indirectly related to tissular collagen structure remodeling. The nonlinear optical microscopy second-harmonic generation has become a powerful tool for imaging biological tissues with anisotropic hyperpolarized structures, such as collagen. During the past years, several quantification methods to analyze and evaluate these images have been developed. However, automated or semiautomated solutions are necessary to ensure objectivity and reproducibility of such analysis. This work describes automation and improvement methods for calculating the anisotropy (using fast Fourier transform analysis and the gray-level co-occurrence matrix). These were applied to analyze biopsy samples of human ovarian epithelial cancer at different stages of malignancy (mucinous, serous, mixed, and endometrial subtypes). The semiautomation procedure enabled us to design a diagnostic protocol that recognizes between healthy and pathologic tissues, as well as between different tumor types.Fil: Zeitoune, Angel Alberto. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones y Transferencia de Entre Ríos. Universidad Nacional de Entre Ríos. Centro de Investigaciones y Transferencia de Entre Ríos; ArgentinaFil: Luna, Johana S. J.. Universidad Nacional de Entre Ríos. Facultad de Ingeniería; ArgentinaFil: Sanchez Salas, Kynthia. Universidad Nacional de Entre Ríos. Facultad de Ingeniería; ArgentinaFil: Erbes, Luciana Ariadna. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones y Transferencia de Entre Ríos. Universidad Nacional de Entre Ríos. Centro de Investigaciones y Transferencia de Entre Ríos; ArgentinaFil: Cesar, Carlos L.. Universidade Federal do Ceará; Brasil. National Institute of Science and Technology on Photonics Applied to Cell Biology; BrasilFil: Andrade, Liliana A. L. A.. Universidade Estadual de Campinas; BrasilFil: Carvahlo, Hernades F.. Universidade Estadual de Campinas; Brasil. National Institute of Science and Technology on Photonics Applied to Cell Biology; BrasilFil: Bottcher Luiz, Fátima. Universidade Estadual de Campinas; Brasil. National Institute of Science and Technology on Photonics Applied to Cell Biology; BrasilFil: Casco, Victor Hugo. Universidad Nacional de Entre Ríos. Facultad de Ingeniería; ArgentinaFil: Adur, Javier Fernando. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones y Transferencia de Entre Ríos. Universidad Nacional de Entre Ríos. Centro de Investigaciones y Transferencia de Entre Ríos; Argentina. Universidad Nacional de Entre Ríos. Facultad de Ingeniería; Argentin

PID 6088 Estudio de la influencia de las hormonas tiroideas en el control de los sistemas de adhesión cadherinas-cateninas durante el desarrollo de vertebrados

El desarrollo de organismos pluricelulares depende en gran medida del establecimiento y mantenimiento de contactos adhesivos fuertes, pero a la vez dinámicos para posibilitar el remodelamiento tisular frente a señales específicas, tanto durante el desarrollo como en el estado adulto. Interesados en evaluar mecanismos de control hormonal de estos contactos, estudiamos si las hormonas tiroideas eran capaces de controlar el desarrollo animal a través de la regulación de la expresión de moléculas de adhesión celular (CAMs), las cuales influencian la adhesión celular y la morfología celular y tisular. Para ello, en una primera etapa, se implementaron bioensayos de bloqueo e inducción de la metamorfosis de Rhinella arenarum y se analizó por inmunohistoquímica cuantitativa el patrón de expresión de las CAMs cadherina E, b- y a-catenina en el intestino anterior o estómago larval de esta especie. En una segunda etapa se utilizaron técnicas de inmunofluorescencia y microscopia de desconvolución digital tridimensional cuantitativa para analizar la influencia de los niveles de fosforilación de las proteínas de los complejos de unión cadherina-catenina in vivo. En una tercera etapa, se analizaron los niveles de expresión de los ARNm de cadherina E y β-catenina y de sus proteínas para correlacionar los estudios morfométricos realizados con estudios moleculares, empleando retrotranscripción y amplificación de ADNcopia (ADNc) por reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) y western blotting, para, respectivamente. Para ello, se realizaron análisis bioinformáticos de las secuencias y estructuras de las moléculas bajo estudio. Los resultados obtenidos permiten postular por primera vez en forma cuantitativa, un control positivo espacial y temporal de cadherina E, b- y a-catenina por la hormona T3 durante el desarrollo metamórfico del estómago larval de Rhinella arenarum. La alteración de los niveles de fosforilación de las proteínas de los complejos de unión cadherina E-β-catenina, produce una drástica pérdida de estas moléculas en los contactos célula-célula y el incremento citoplasmático y nuclear de β-catenina en las células epidérmicas, sugiriendo la activación de la ruta de señalización nuclear mediada por β-catenina. Sorprendentemente, no se detectan cambios en la forma celular o en la arquitectura de la piel, sugiriendo que la cadherina E epidérmica estaría involucrada en la señalización celular más que en el mantenimiento de los contactos intercelulares durante el mantenimiento de la arquitectura epitelial in vivo. Finalmente, se aislaron, secuenciaron y caracterizaron filogenéticamente secuencias de nucleótidos de cadherina E y de b-catenina de Rhinella arenarum, que resultaron estar altamente conservadas rentre 8 especies de vertebrados.

Gene Expressions and Functions of Vasoactive Intestinal Contractor (VIC/ET-2) and Endothelin-1 (ET-1) in Mouse.

Este trabajo se ha centrado en el estudio del péptido Vasoactivo de Contracción Intestinal (VIC/ET-2). Para dilucidar los roles del gen VIC/ET-2, se planteó y realizó un trabajo integral sobre la distribución celular del ARNm de VIC/ET-2 en varios tejidos de animales adultos y a través de los diferentes estadios del desarrollo embrionario del ratón constituyendo el primer trabajo que presenta un estudio cuantitativo y comparativo. Comparada con la expresión de la ET-1 y los receptores ETA y ETB, la expresión fue especialmente importante en intestino ovario, útero y piel. Durante el desarrollo, se demostró que la familia de las ETs alcanza altos niveles de expresión, hacia los últimos estadios del desarrollo embrionario y al momento del parto o inmediatamente después de la ocurrencia de dicho evento en intestino, pulmón y piel. Del análisis particular sobre modelos experimentales específicos para intestino y piel; se demostró que en el intestino, el VIC/ET-2 estaría implicado en la regulación de la función de tamiz / barrera, en los procesos de movilidad y en la mecanosensibilidad de las vellosidades intestinales. Regulación que se efectuaría teniendo como blanco de acción a los fibroblastos subepiteliales y de la lámina propia. Finalmente se confirmo que VIC/ET-2 y sus receptores son activados ante la exposición a la radiación ultravioleta de longitud de onda corta (UV-C); secretado desde la epidermis, actuaría como un factor paracrino para el crecimiento de los melanocitos y para la melanización y como un factor autocrino en el crecimiento de los queratinocitos.The present work is centered in the study of the endothelins, essentially in the Vasoactive Intestinal Contractor (VIC) peptide. In order to elucidate the roles of the VIC/ET-2 gene, an integral study on the cellular distribution of VIC/ET-2 mARN in various adult-animal tissues and in different stages of embryonary development of mice was designed and performed, providing the first work to include a quantitative and comparative study of the genetic expression of various members of the endothelin system. Compared to the expression of ET-1, and ETA and ETB receptors, expression was especially important in intestine, ovary, uterus and skin. We demonstrated that ET-family members reach high expression levels in intestine, lung and skin during the last stages of embryonary development and at and immediately after birth. Based on the analysis of specific experimental models of intestine and skin, we demonstrated that in intestine, VIC/ET-2 it has been postulated that this system would be implied in the regulation of the sieve/barrier function, mobility processes and mechanic sensibility of intestinal villi. This regulation would target fibroblasts of the subepithelial and lamina propia layers. Finally, we confirmed that VIC/ET-2 and its receptors are activated by exposition to short ultraviolet radiation (UV-C); secreted from the epidermis, it would act as a paracrine factor in melanocyte growth and melanogenesis, and as an autocrine factor in keratinocyte growth.Facultad de Ingenieria. Universidad Nacional de Entre Rios

Three-dimensional morphological characterization of colorectal pits from label-free microscopy images

The prognosis of colorectal cancer (CRC), one of the most prevalent pathologies worldwide, is linked to early detection. Kudo's pit pattern classification states morphological pit patterns of the Lieberkühn crypts by analyzing the superficial mucosa, predicting the histology of colorectal lesions. Its use as a highly accurate two-dimensional diagnostic criterion has increased, mostly involving expert endoscopists’ judgment. The processing of autofluorescence images could allow the diagnostic, bypassing staining techniques and decreasing the biopsies, resources and times involved in the inspection. That criterion could be extended by data of the pit three-dimensional (3D) morphology. Thus, this work was aimed at obtaining 3D morphological information by quantifying geometrical and shape descriptors through software processing and analysis of widefield autofluorescence microscopy image stacks acquired by fresh colon tissue samples from a murine model of CRC. Statistical analyses included pits from control mice and from the second (2nd), fourth (4th), and eighth (8th) weeks of treatment. Statistically significant differences were found for almost all parameters between the pits from control and from the 4th treated week, stating that the major morphological changes begin after the 2nd week. In particular, pits from control or initial treatment time points were more tubular, straighter and less rough than the ones from later treatment points. Therefore, they may be more associated to normal or non-neoplastic crypt lumens than linked to adenomas or even cancer crypts. These preliminary outcomes could be considered an advance in 3D pit morphology characterization.Fil: Erbes, Luciana Ariadna. Universidad Nacional de Entre Ríos. Instituto de Investigación y Desarrollo en Bioingeniería y Bioinformática - Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe. Instituto de Investigación y Desarrollo en Bioingeniería y Bioinformática; ArgentinaFil: Izaguirre, María Fernanda. Universidad Nacional de Entre Ríos; ArgentinaFil: Casco, Victor Hugo. Universidad Nacional de Entre Ríos. Instituto de Investigación y Desarrollo en Bioingeniería y Bioinformática - Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe. Instituto de Investigación y Desarrollo en Bioingeniería y Bioinformática; ArgentinaFil: Adur, Javier Fernando. Universidad Nacional de Entre Ríos. Instituto de Investigación y Desarrollo en Bioingeniería y Bioinformática - Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe. Instituto de Investigación y Desarrollo en Bioingeniería y Bioinformática; Argentin