A pseudoxanthoma elasticum öröklődő betegség kialakulásáért felelős ABCC6/MRP6 gén transzkripciós szabályozásának vizsgálata = Transcriptional regulation of the pseudoxanthoma elasticum (PXE) causing ABCC6/MRP6 gene

Kísérleteimben a pseudoxanthoma elasticum öröklődő betegség kialakulásáért felelős ABCC6 gén transzkripciós szabályozását vizsgáltam és az ehhez szükséges metodikákat állítottam be és fejlesztettem tovább. Kimutattam, hogy: - a génnek 3, az evolúció során erősen konzervált nem kódoló régiója van; - a proximális promóter konzervált régió metilációja szövetspecifikus és inverz korrelációt mutat a gén kifejeződésével; - a promóterben egy aktivátor és egy represszor szekvencia található; - az aktivátor szekvencia DNS metilációra érzékeny. Beállítottam a biszulfitos genomszekvenálást, a DNáz hiperszenzibilitási esszét, illetve a gén kifejeződésének mérésére a kvantitatív PCR-t. Kifejlesztettünk egy primer-tervező és analizáló programot, mely különösen a DNS metiláció meghatározásához használatos biszulfitos genomszekvenáláshoz nyújt segítséget. A kvantitatív PCR beállítása során kialakítottunk egy általános érvénnyel alkalmazható új típusú normalizálási eljárást. Munkánk eredménye egy webszerver, öt közlemény és egy könyvfejezet. Azonosítottuk továbbá a gén 3 DNáz hiperszenzitív helyét és teszteltük számos vegyület hatását a gén kifejeződésére. Közülük többnek is kimutattuk a gátló hatását. Kísérleteink újabb iránya a gén pszeudogénjeinek kialakulását vizsgálja. Eredményeink szerint a pszeudogének non- allelikus homológ rekombinációval jöttek létre. Jelenlétük következménye pl betegségokozó mutációk kialakulása génkonverziós mechanizmussal. Kéziratunkat benyújtottuk közlésre. | The transcriptional regulation of ABCC6, the disease gene of pseudoxanthoma elasticum was investigated in the present study. I also set up and developed the techniques necessary for this work. I demonstrated: The existence of 3 evolutionarily conserved non-coding regions in the gene; The inverse correlation between the tissue-specific methylation of the proximal promoter and ABCC6 expression; The presence of an activator and a repressor in the proximal promoter; The DNA methylation dependence of the activator sequence. I set up the bisulfite genomic sequencing technique, the DNase hypersensitivity and quantitative PCR assays. We developed a primer-design and analyzer software, particularly useful in bisulfite genomic sequencing assays. We developed a novel universally applicable normalization technique for quantitative PCR. As a result of the 3-year period we developed a successful web server, published five papers, one book chapter and initiated one patenting process. We have also identified three hypersensitive sites and screened a number of molecules for their activity on the expression level of the gene. Several tested molecules had a specific inhibitory effect on ABCC6 expression Recently we studied the appearance of ABCC6 pseudogenes. Our data suggest their creation by non-allelic homologous recombination. The consequence of their presence is e.g. the development of disease-causing mutations by gene conversion events. Our manuscript describing the phenomenon is submitted

ABC transzporterek rövid és hosszútávú regulációja metabolikus stresszek hatására = Short and long term regulation of ABC transporters by metabolic sresses

Legfontosabb eredményeinket az ABCC6 gén vizsgálata során értük el. A gén mutációi a pseudoxanthoma elasticum recesszív öröklődésű betegség kialakulásához vezetnek. Megerősítettük, hogy a mutáció hordozói 10x nagyobb kockázatnak vannak kitéve a coronaria arteriabetegség kialakulása tekintetében, mint a kontroll populáció. Az ERK kaszkád aktiválódásának hatására májsejtekben megfigyelt ABCC6 expresszió-csökkenést vizsgálva azonosítottunk egy HNF4 kötőhelyet; igazoltuk, hogy az ERK1/2 aktiválása gátolja a HNF4 okozta ABCC6 expressziófokozódást; beláttuk, hogy a HNF4 szükséges a további aktivátor faktorok hatásához és meghatározza az ABCC6 szövetspecifikus expresszióját. Igazoltuk, hogy az ABCC6 gén első intronjában van egy sej- és főemlős-specifikus aktivátor szakasz, ami legalább két aktivátor fehérje kötőhelyet hordoz. Ezek egyike a C/EBP beta. Kimutattuk, hogy transzkripciós aktiváló hatásának kifejtéséhez szükség van a proximális promóterrel való együttműködésére, ami nem (közvetlenül) a HNF4 transzkripciós faktorral jön létre. Eredményeink azt sugallják, hogy az ABCC6 szerepet játszhat a hepatocyták metabolikus állapotának szabályozásában. Terveztük az ABCC6 gén epigenetikai profiljának leírását is. Beállítottunk tehát egy LC/MS-MS módszert egyedi szekvenciák és teljes genom metiláció vizsgálatára. Igazoltuk, hogy a DNS metiláció egy dinamikus egyensúly eredménye, mely a sejtek osztódásától független folyamatos demetiláció és remetiláció eredménye. | Our most important results were obtained on the ABCC6 gene. Mutations of ABCC6 lead to pseudoxanthoma elasticum, a recessive Mendelian disease. In our studies, we confirmed that mutation carriers have a 10x increased risk to develop coronary artery disease relative to controls. While studying the regulation of the gene, we observed the decrease of the expression in hepatocytes upon the activation of ERK cascade. We showed that ERK activation inhibits ABCC6 expression via HNF4, which plays a crucial role in orchestrating the transcriptional regulation of the gene and regulation of its tissue-specific expression. We also identified a primate and cell-type specific activator sequence in the 1st intron of ABCC6, which harbors at least two binding sites for activator proteins, one of which is C/EBP beta. We have shown that this activator region interacts with the proximal promoter but not directly with HNF4. Our data on the transcriptional regulation of ABCC6 suggest that ABCC6 reflect the metabolic state of hepatocytes and might play a role in influencing it. We plan to investigate the epigenetic profile of the ABCC6 gene. We set up therefore a HPLC/MS-MS method to investigate the methylation of target sequences and genomes. We showed that in contrast to previous hypotheses global methylation level is a result of a dynamic equilibrium independent of replication but depending on permanent demethylation and remethylation

Effort-induced mirror movements: A study of transcallosal inhibition in humans

During sustained, fatiguing maximal voluntary contraction of muscles of one hand, muscles of the other hand gradually become activated also. Such effort-induced mirror movements indicate a decreased ability of the central nervous system (CNS) to selectively control individual muscles. We studied whether altered transcallosal inhibition (TCI) contributed to this phenomenon. TCI was determined in ten healthy subjects by measuring the ipsilateral silent period (iSP) and the contralateral silent period (cSP) during a sustained contraction of the abductor digiti minimi, induced by focal unihemispheric ipsilateral transcranial magnetic stimulation. Mirror movements occurred in all subjects in response to the effort. There was a bilateral increase in cSPs and a parallel increase in the iSP in the contralateral working muscle. In contrast, the iSP in the mirroring muscle remained unchanged, explained by a balance of increased crossed pyramidal inhibition (cSP) and decreased transcallosal inhibition. In finely tuned unimanual movements, mirroring activity of the contralateral hand is suppressed by TCI originating in the working hemisphere. During sustained, effortful contractions, the outflow of the contralateral hemisphere is increased due to reduced TCI. Effort-induced mirror contractions are thus the result of disinhibition of contralateral crossed projections rather than disinhibition of ipsilateral uncrossed pathway

Transcriptional regulation of the ABCC6 gene and the background of impaired function of missense disease-causing mutations.

The human ATP-binding cassette family C member 6 (ABCC6) gene encodes an ABC transporter protein expressed primarily in the liver and to a lesser extent in the kidneys and the intestines. We review here the mechanisms of this restricted tissue-specific expression and the role of hepatocyte nuclear factor 4alpha which is responsible for the expression pattern. Detailed analyses uncovered further regulators of the expression of the gene pointing to an intronic primate-specific regulator region, an activator of the expression of the gene by binding CCAAT/enhancer-binding protein beta, which interacts with other proteins acting in the proximal promoter. This regulatory network is affected by various environmental stimuli including oxidative stress and the extracellular signal-regulated protein kinases 1 and 2 pathway. We also review here the structural and functional consequences of disease-causing missense mutations of ABCC6. A significant clustering of the missense disease-causing mutations was found at the domain-domain interfaces. This clustering means that the domain contacts are much less permissive to amino acid replacements than the rest of the protein. We summarize the experimental methods resulting in the identification of mutants with preserved transport activity but failure in intracellular targeting. These mutants are candidates for functional rescue by chemical chaperons. The results of such research can provide the basis of future allele-specific therapy of ABCC6-mediated disorders like pseudoxanthoma elasticum or the generalized arterial calcification in infancy

Ultrasonographic Identification of Fibromuscular Bands Associated with Neurogenic Thoracic Outlet Syndrome: The "Wedge-Sickle" Sign.

Thoracic outlet syndrome (TOS) is a disorder characterized by compression of the lower trunk of the brachial plexus, most often in association with anomalous congenital fibromuscular bands in the scalenic region. Early diagnosis is important, because the neurologic deficit associated with TOS may be irreversible. Using high-resolution ultrasound, we investigated 20 consecutive patients with clinical signs suggestive of TOS (all females, average age: 40.4 +/- 14.9 y) and 25 control patients. In 19 patients, we identified a hyper-echoic fibromuscular structure at the medial edge of the middle scalene muscle, which indented the lower trunk of the brachial plexus ("wedge-sickle sign"). It was associated with the significant enlargement (p < 0.0001) and hypo-echogenicity of the lower trunk. This novel and distinctive ultrasonographic sign allows pre-surgical identification of anomalous fibromuscular bands causing TOS. It is especially useful in patients without neurologic deficit, in whom the diagnosis may not be as straightforward