RNA가수분해효소 SAMHD1의 HIV-1 억제 기능에 대한 연구

학위논문 (박사)-- 서울대학교 대학원 : 협동과정 유전공학전공, 2015. 2. 안광석.AGS는 유전적인 질병으로 환자에게서 핵산매개면역반응에 의한 자가면역질환 증상이 나타난다. AGS와 관련된 돌연변이 유전자 중에는 SAMHD1이 있다. SAMHD1은 HIV-1 억제인자로 작용하여 세포분열이 일어나지 않는 대식세포, 수지상 세포, 휴지상태의 CD4+ T 세포에서 HIV-1의 역전사 과정을 방해한다. SAMHD1은 dNTP를 분해하는 효소 활성을 가지고 있으며 dGTP가 다른 자리 조절자로써 dNTPase 효소 활성을 갖도록 한다. 따라서 SAMHD1은 세포내 dNTP의 양을 줄임으로써 HIV-1의 복제를 저해한다고 연구되었다. 그러나 최근 보고에 따르면, SAMHD1의 dNTPase 활성과 관계없이 SAMHD1 단백질 인산화 여부에 따라 HIV-1의 복제를 억제하는 능력이 조절되는데, 이는 SAMHD1의 또 다른 역할이 있음을 시사한다. 본 연구에서는 SAMHD1이 RNA 분해효소 기능을 가지고 있음을 밝혔으며 이 효소 기능이 HIV-1을 억제하는데 필수적임을 보였다. AGS 질병과 관련된 SAMHD1의 돌연변이와 dGTP가 결합하지 못하는 돌연변이 SAMHD1을 이용하여 2가지 효소 작용 중에 어떤 것이 HIV-1 억제에 중요한지에 대해서 확인하였다. RNA 분해효소 활성만 가지고 있는 SAMHD1D137N의 경우는 HIV-1를 억제할 수 있었으나 dNTPase 활성만 가지는 SAMHD1Q548A는 HIV-1 복제를 막을 수 없었다. 이는 SAMHD1의 RNA 분해효소 활성이 HIV-1 억제 기작의 핵심이라는 것을 의미한다. 실제 SAMHD1은 HIV-1 감염초기에 직접 HIV-1 유전체 RNA에 결합하여 분해함으로써 HIV-1 생활사에 타격을 입히는 것으로 확인되었다. 인간의 대식세포나 CD4+ T 세포에 SAMHD1의 발현을 감소시켰을 때, HIV-1 유전체 RNA가 안정화 되는 실험적 결과를 이를 뒷받침한다. 또한 592번째 아미노산인 트레오닌의 인산화에 의한 HIV-1의 억제 기능 조절은 SAMHD1의 HIV-1 유전체 RNA 분해 작용에 대한 조절로 이루어짐을 보였다. 여러 실험 결과들을 통해 나는 SAMHD1이 가지는 두 가지 효소 활성 중에서 dNTPase가 아닌 RNase 효소 활성이 HIV-1를 억제하는데 중요하다는 것을 밝혔다.Sterile alpha motif (SAM) domain and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a host cell restriction factor that inhibits HIV-1 replication by impairing reverse transcription in non-cycling cells such as macrophages, dendritic cells and resting CD4+ T cells. SAMHD1 has a dGTP-induced dNTPase activity, and therefore was initially proposed to deplete intracellular dNTP level below the levels required for reverse transcription of HIV-1. However, the phosphorylation of SAMHD1 at position T592 regulates its ability to restrict HIV-1 without decreasing cellular dNTP levels, which is not consistent with a role for SAMHD1 dNTPase activity in HIV-1 restriction. Here, I show that SAMHD1 possesses RNase activity and that the RNase but not the dNTPase function is essential for HIV-1 restriction. By enzymatically characterizing Aicardi-Goutières syndrome (AGS)-associated SAMHD1 mutations and mutations in the allosteric dGTP-binding site of SAMHD1 for defects in RNase or dNTPase activity, I identify SAMHD1 point mutants that cause loss of one or both functions. The RNase-positive and dNTPase-negative SAMHD1D137N mutant is able to restrict HIV-1 infection, whereas the RNase-negative and dNTPase-positive SAMHD1Q548A mutant is defective for HIV-1 restriction. SAMHD1 associates with HIV-1 RNA and degrades it during the early phases of cell infection. SAMHD1 silencing in macrophages and CD4+ T cells from healthy donors increases HIV-1 RNA stability, rendering the cells permissive for HIV-1 infection. Furthermore, the phosphorylation of SAMHD1 at T592 negatively regulates its RNase activity in cells and consequently the ability of SAMHD1 to restrict HIV-1 infection. My results reveal that the RNase activity of SAMHD1 is responsible for preventing HIV-1 infection by directly binding and degrading the HIV-1 RNA.CONTENTS LIST OF TABLES AND FIGURES LIST OF ABBREVIATIONS ABSTRACT INTRODUCTION 1. Identification of SAMHD1 as an HIV-1 restriction factor 1.1 Structure and enzymatic activities of SAMHD1 2. Mechanisms of SAMHD1-mediated retroviral restriction 2.1 Inhibition retroviral reverse transcription by depleting intracellular dNTP pool 2.2 Phosphorylation of SAMHD1 negatively regulates its HIV-1 restriction ability 2.3 SAMHD1-mediated HIV-1 inhibition may involve its nuclease activity 3. SAMHD1 and Aicardi-Goutières syndrome MATERIALS AND METHODS 1. Ethics statement 2. Plasmids 3. Protein expression and purification 4. Preparation of DNA and RNA substrates 5. In vitro nuclease assay 6. dGTP-triphosphohydrolase assay 7. Cells and reagents 8. RNA interference 9. Viruses and VLP production 10. Quantitative real-time PCR 11. RNA-Seq analysis 12. RNA immunoprecipitation (RIP) 13. Northern blot analysis 14. Cell fractionation RESULTS 1. SAMHD1 is a processive 3ʹ-5ʹ exonuclease. 2. Ribonuclease and dNTPase are dual and separate functions of SAMHD1. 3. The ribonuclease function of SAMHD1 is critical or HIV-1 restriction 4. SAMHD1 associates with and induces destabilization of the HIV-1 genomic RNA. 5. Phosphorylation of SAMHD1 regulates RNase activity. DISCUSSION REFERENCES ABSTRACT IN KOREANDocto

A Study on Identifying a User with Multiple Cookies in Online-Market

학위논문 (석사)-- 서울대학교 대학원 : 전기·컴퓨터공학부, 2015. 2. 권태경.온라인 상점(Online market)은 판매자와 소비자들이 온라인 상에서 다양한 상품을 거래하는 공간이다. 온라인 상점에서 소비자는 매장에 직접 방문하지 않아도 원하는 물품을 구매할 수 있는 편리함이 있다. 이는 온라인 상점 시장의 이용 증가를 촉진하였으며, 꾸준한 성장세를 지속하도록 하였다. 이러한 성장세에 따라, 온라인 상점에서 사용자의 행동을 이해하고 이용할 수 있는 다양한 연구가 진행되고 있다. 그러나 대부분의 기존 연구들은 편의를 위해 한 기기에 존재하는 하나의 브라우저에 할당된 쿠키(browser cookie)를 한 명의 온라인 상점 소비자로 간주한다. 하지만, 멀티 기기(Multi-device)를 사용하는 것이 보편화되고, 한 컴퓨터에서도 소비자가 멀티 브라우저(Multi-browser)를 이용하여 접속하는 것이 일반적 현상이 기 때문에, 동일 기기의 동일 브라우저일 경우에도 여러 쿠키가 할당될 수 있다. 따라서, 하나의 쿠키를 한 명의 소비자로 대응시키는 데에는 한계가 있다. 본 논문에서는 이러한 문제를 해결하기 위해 실제 온라인 상점 소비자들의 행동 로그를 수집하여, 여러 개의 쿠키를 사용하여 접속하는 소비자를 식별하는 알고리즘을 제시한다. 또한, IP주소나 쿠키와 같은 사용자 관련 정보뿐만 아니라 상품과 관련한 정보까지 고려하여 성능을 다양한 측면에서 분석하였다. 결과적으로, 알고리즘이 여러 개의 쿠키를 사용하는 소비자를 식별할 가능성이 높다는 것을 확인하였다. 이러한 본 논문에서의 분석과 결과는, 동일 사용자의 행동패턴에 대한 이해와 이를 이용한 서비스의 품질 향상에 긍정적인 영향을 끼칠 것으로 예측된다.제 1 장 서 론 5 제 1 절 연구의 배경 5 제 2 절 논문의 구성 8 제 2 장 데이터 수집 방법 및 정보 9 제 1 절 데이터 셋 수집 경로 9 제 2 절 데이터 셋 설명 10 제 3 장 사용자 식별 알고리즘 및 분석 결과 12 제 1 절 문제 정의 및 식별 요소 분석 12 제 2 절 멀티 쿠키 사용자 식별 알고리즘 14 제 3 절 알고리즘 분석 및 결과 17 제 4 절 요약 30 제 4 장 결 론 32 제 1 절 결론 및 향후 연구 방향 32 참고문헌 34 Abstract 35Maste

Screening of potent inhibitors for protein tyrosine phosphatases.

의과학사업단/석사[한글] Protein tyrosine kinases (PTK)와 protein tyrosine phosphatases (PTP)에 의한 가역적인산화 반응의 조절은 인슐린 신호전달을 비롯한 다양한 세포 내 신호전달과정에서 중요한 역할을 한다. PTP는 세포 내 다양한 기질들을 탈인산화시킬 수 있는 기질 특이성이 낮은 효소로 알려져 왔으나, 최근 knockout생쥐 실험등으로 다양한 PTP는 생체 내에서 각기독특한 기능을 하고 있는 것으로 밝혀지고 있다. 따라서 다양한 PTP에 대한 매우 선택적이고 강력한 저해제의 개발은 당뇨병을 비롯한 여러 가지 다양한 질환의 치료적 약물로서의 사용뿐만 아니라 각 효소의 생물학적 기능의 연구에 있어서도 유용할 것으로 사료된다 본 연구에서는 이러한 연구적 배경을 바탕으로 선택적인 PTP 저해제 개발의 선도물질(lead compound)로 사용될 수 있는 강력하고 가역적인 저해제를 찾고자 하였다. 특히, PTP 효소반응 결과물의 저해작용(end-product inhibition)에 초점을 맞추어 저해물질을 스크리닝하고자 하였다. PTP 효소반응 결과물인 phosphate와 그 유도체의 저해작용을 확인한 결과 vanadate, molybdate 그리고 tungstate가 PTP-1B (protein tyrosine phosphatase-1B)와 SHP-1 (protein tyrosine phosphatase containing two SH2 domains)에 대해 1.3-18 μM 범위의 저해상수를 가짐으로써 비교적 효과적인 저해효과를 보였다. 반면 phosphate 자체는 수백 μM범위에서도 저해효과를 나타내지 않았으며, 특징적인 것은 thiophosphate가 SHP-1에 대해 선택적인 저해양상을 보였다는 점이다. 다음으로 비교적 효과적 저해양상을 나타낸 물질들을 중심으로 이들의 유도체들을 스크리닝한 결과, phosphomolybdate (PM)와 phosphotungstate (PT)가 저해상수 0.06-1.2 μM의 범위로 PTP에 대해 아주 강력한저해효과를 나타내었다. 흥미롭게도 PM과 PT는 Ser/Thr phosphatase에 대해서는 비교적 약한 저해양상을 보였으며, alkaline phosphatase에 대해서는 저해양상을 전혀 나타내지 않았다. 따라서 PM과 PT는 PTP에 대한 강력하고 선택적인 저해제임을 알 수 있었다. 이러한 in vitro 실험 결과를 세포주 단계에서 처리해 봄으로써 치료적 약물로서의 효용성을 확인해 보고자 하였다. HepG2 세포주에 PM과 PT를 처리해 본 결과, 세포 내 인산화 단백질의 변화는 in vitro의 실험결과와 비교해 볼 때 효과가 미미하였는데, 이는 PM과 PT가 HepG2 세포막을 효과적으로 투과하지 못하는데 기인한 것으로 여겨진다. 결론적으로 PM과PT는 PTP에 대한 강력하고 선택적인 저해제이며 세포 내 전달이 가능하다면 당뇨병 치료제에 대한 선도물질로서의 가능성이 충분히 있다고 사료된다. [영문] Protein tyrosine phosphatases (PTPs) constitute a family of receptor-like and cytoplasmic enzymes that catalyze the dephosphorylation of phosphotyrosine residues in a variety of receptors and signaling molecules. Together with protein tyrosine kinases (PTKs), PTPs are critically involved in regulating many cellular signaling processes. PTPs have been considered to have multiple unrelated cellular substrates, however, recently reported knockout mice deficient of particular PTPs all appear to exhibit unique phenotypes, suggesting that most PTPs would serve unique, non-redundant functions. A role for PTPs in the negative regulation of insulin signaling and a putative involvement in the insulin resistance associated with typre 2 diabetes have been postulated. The recent demonstration that mice lacking the protein tyrosine phosphates-1B (PTP-1B) have enhanced insulin sensitivity validates this. Therefore, highly selective PTP inhibitors including PTP-1B could be used as therapeutic agents for diseases and significant progress in developing such agents is being made, though most inhibitors developed so far are potent but less selective. In this study, we initiated screening of diverse compounds for PTP inhibition, focusing on the end product inhibition property of PTPs. By a systematic screening of phosphate analogues and their derivatives for PTP inhibition, we found that vanadate, molybdate, and tungstate effectively inhibited the catalytic activity of both PTP-1B and SHP-1 with Ki values between 1.3-18 μM, while thiophosphate selectively inhibited SHP-1 only. Remarkably, we found that phosphomolybdate (PM) and phosphotungstate (PT) inhibited the PTPs much more strongly than vanadate, a well-known and generally used PTP inhibitor, with Ki values of 0.06-1.2 μM. PM and PT turned out to be potent, competitive inhibitors for PTPs, but they appeared to be relatively poor inhibitors of Ser/Thr phosphatase. Interestingly, PM and PT did not inhibit alkaline phosphatase at all. Therefore, we found that PM and PT are excellent reversible inhibitors of PTP in vitro. In the further study, the efficacy of PM and PT as PTP inhibitors in intact cell was compared with that of vanadate and pervanadate by measuring phosphotyrosine levels in HepG2 cell line treated with these compounds. In contrast to the result of inhibition in vitro, PM and PT were much more ineffective as PTP inhibitors in HepG2 cell line. Therefore, we can suggest that by enhancing the ability of PM and PT to cross the cell membrane, it would be possible to be lead compounds for modulating the function of known therapeutic targets as well as type 2 diabetes.ope

에너지전환연구회 2016년 제1차 워크숍-지자체 지역에너지전환 사례와 시사점(고재경,유정민)

O 에너지전환연구회 2016년 제1차 워크숍 O 개 요 - 주제 : 지자체 지역 에너지전환 사례와 시사점 - 일시: 2016년 1월 20일(수) - 장소: 충남연구원 2층 회의실 O 주제발표 - 제1주제 : 경기도 에너지 비전 2030의 의미와 내용-고재경(경기연구원 생태환경연구실장) - 제2주제 : 서울시 원전 하나 줄이기와 충청남도 에너지 정책의 시사점-유정민(환경정의연구소 부소장) - 이후 생략서울시 원전 하나 줄이기와 충청남도 에너지 정책의 시사점 Ⅰ. 서울시 원전 하나 줄이기 추진 배경과 목적 Ⅱ. 원전 하나 줄이기 주요 사업과 성과 Ⅲ. 원전 하나 줄이기 성공요인과 향후 과제 IV. 충남에너지 전환을 위한 시사