Preparation, Characterisation and Primary Application of a Panel of MAbs against Haemagglutinin of High Pathogenic H5 Avian Influenza Virus

高致病性H5N1禽流感病毒自1997年在香港首次爆发并致死六人后，2003年底至今又在东南亚和中亚地区持续大规模爆发，除造成63人感染并死亡外，其造成的危害还严重打击了相关各国的农业经济，造成国民经济的惨重损失。世界卫生组织已向世界各国发出警告，指出H5N1病毒将最有可能成为下一次流感大流行的候选病毒株，并已开始组织世界各国参与到“大流感应对计划”中来。而当前全球流感应对计划的三大环节中最为薄弱的一环正是特异性快速诊断试剂的开发及生产。显然，开发出方便、快捷、实时的H5型流感病毒快速诊断试剂，对于尽早发现病毒并及时采取措施控制好H5N1在整个东南亚直至整个欧洲大陆流行，预防未来大流感的爆发或降...Six persons were killed in the first outbreak of high pathogenic H5N1 avain influenza virus in Hong Kong in 1997. H5N1 began to attack southeastern and central Asia since late 2003. In addition to causing fatal human diseases with 63 people dead, this new outbreak of H5N1 virus severely smashered the agricultural economy and led heavy loss of national economy in the outbreaking country. WHO has al...学位：理学硕士院系专业：生命科学学院生物学系_细胞生物学学号：20022604

Establishment of H5 Haemagglutinin Monoclonal Antibodies Panel, Identification of Broad Reactive Neutralizing Monoclonal Antibodies and Their Cross-Protection against H5N1 Infection

2003年以来，高致病性H5N1禽流感病毒（H5N1病毒）在禽类中的持续流行和不断发生的人类感染事件使人们担心H5N1病毒可能持续进化成引发人类流感大流行的大流感病毒株。为此，研制H5N1病毒的疫苗和抗体治疗药物成为当前应对H5N1病毒引发潜在流感大流行的研究热点，而H5N1病毒最主要的中和抗体来自于表面糖蛋白血凝素(HA)，因此HA成为主要研究靶标。H5N1病毒具有高度变异性，故疫苗研制的关键是疫苗株的选择。根据分子进化树分析预测结果显示H5N1病毒HA基因已演变成至少10种不同抗原性特征的变异分支（Clade0–9）。虽然病毒抗血清可真实地反映出病毒的抗原性表现型，但是H5N1病毒新变异株...Long-term endemicity of highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses in birds and sporadic human transmissions by H5N1 viruses since 2003 have raised the concern of a potential pandemic. It has been explored actively in the development of the H5N1 pre-pandemic vaccine and treatment. Hemagglutinin (HA) of H5N1 virus is the key protein producing neutralizing antibody and becomes a hot target. Give...学位：理学博士院系专业：生命科学学院生物医学科学系_生物化学与分子生物学学号：2012005140315

细胞角蛋白19片段抗原21-1含量化学发光微粒子定量免疫检测方法的建立

目的建立细胞角蛋白19片段抗原21-1(cytokeratin 19 fragment 21-1,CYFRA21-1,简称CY21-1)含量的化学发光微粒子免疫检测方法(chemiluminescent microparticle immunoassay,CMIA)。方法原核表达制备重组CY21-1(r CY21-1),用其免疫BALB/c小鼠后,收集小鼠脾脏细胞,常规杂交瘤技术与Sp2/0进行融合,制备CY21-1单抗。间接ELISA法筛选可稳定分泌CY21-1抗体的杂交瘤细胞,分别标记微性磁珠(magnetic beads,MB)和吖啶酯(acridinium ester,AE),筛选可特异检测CY21-1的单抗配对,建立CY21-1 CMIA,同时验证方法的线性及灵敏度,并与同类试剂盒进行比较。结果经筛选获得了一组能特异检测CY21-1的单抗配对MB*26B5-3E4*AE,建立的CY21-1 CMIA对检测CY21-1校准品的线性范围为0.1~1 000 ng/m L,R~2=0.992 3,检测灵敏度为0.076 ng/m L。该方法与美国雅培公司生产的Abbott CY21-1 CMIA诊断试剂盒平行检测250份临床血清标本的结果具有良好的相关性(R~2=0.961 6)。结论成功建立了CY21-1 CMIA,且具有良好的线性及灵敏度,为我国肺癌的临床筛查和早期诊断奠定了基础。福建省科技重大专项(2015Y0051,2011YZ0002-1);;厦门市科技计划项目(3502Z20120008

Evaluation of chemiluminescence immunoassays kits for detection of influenza A virus

目的考核甲型流感化学发光检测试剂的灵敏度和特异性。方法分别利用病毒分离培养液和入境人群的鼻咽拭子标本考查甲型流感试剂盒的检测灵敏度和特异性。结果化学发光法对H1、H3、H5、H7、H9等亚型的甲型流感病毒株均有很好的检出率,灵敏度明显优于flu A-dOT和dIrECTIgEn Ez flu A;对102份入境人群鼻咽拭子标本的检测灵敏度为97.62%。结论甲型流感化学发光检测试剂具有很好的灵敏度和特异性,适用于口岸现场的甲型流感快速筛查。Objective To evaluate the sensitivity and specificity of chemiluminescence immunoassays kit for detection of influenza A virus.Methods To analyze the sensitivity and specificity of three different assay kits for detection of influenza A virus by using the viral culture liquid and nasopharyngeal swabs from entry-exit travelers.Results The chemiluminescence immunoassays kit had a good detection rate when it was tested against a panel of influenza A virus strains(H1/H3/H5/H7/H9),and its sensitivity was much better than Flu A-DOT kit`s and Directigen EZ Flu A kit' chemiluminescence immunoassays kit used for the detection of 102 nasopharyngeal swabs from entryexit travelers had a detection sensitivity of 97.62%.Conclusion Chemiluminescence immunoassays kit had good sensitivity and specificity, which was fit for the rapid detection of influenza A virus at frontier ports.国家质检总局科技计划项目(2014IK045); 厦门市科技惠民项目(3502Z20144083

高致病性禽流感病毒血凝素蛋白广谱中和表位模拟肽的筛选与鉴定

以H5N1型禽流感病毒HA蛋白广谱中和单抗8H5为基础,利用噬菌体展示肽库技术及类病毒颗粒融合表达技术研究HA模拟表位。ELISA检测结果显示:筛选获得模拟HA表位的模拟肽123,进行类病毒颗粒融合蛋白表达后,仍具有与8H5单抗特异结合的能力。免疫荧光检测结果说明,类病毒颗粒免疫小鼠后产生了能与HA交叉反应的抗体。禽流感病毒HA模拟表位的研究与性质的分析及类病毒颗粒融合蛋白的表达与活性分析、免疫原性分析,都为研制禽流感通用表位疫苗奠定了基础

新城疫病毒株F48E9对CT26小鼠结肠癌的溶瘤治疗作用

目的 分析新城疫病毒株F48E9对CT26小鼠结肠癌的体内外肿瘤杀伤作用和F48E9静脉注射BLAB/c小鼠的安全性数据,评估新城疫强毒株F48E9用于溶瘤治疗的潜力,为后续基于强毒株F48E9进行基因组改造提供科学依据。方法 利用CCK-8试剂盒分析F48E9对CT26肿瘤细胞的体外杀伤效果,通过瘤内注射病毒评价F48E9对CT26荷瘤小鼠的溶瘤治疗效果,以及通过尾静脉注射病毒评估F48E9对健康BALB/c小鼠的潜在毒副作用。结果 MOI为0.1的F48E9对CT26细胞生长可表现出明显的抑制作用,随着MOI的升高,F48E9对细胞生长的抑制作用明显增强;0.1 m L浓度为2×10~7 pfu/mL的F48E9对BALB/c小鼠CT26皮下移植瘤的生长有显著抑制作用,治疗组的平均生存期为38.4 d,未治疗组的平均生存期为15.2 d;免疫组化分析显示F48E9对CT26小鼠移植瘤细胞的增殖有明显抑制作用;F48E9尾静脉注射正常BALB/c小鼠的安全性评估实验显示,该毒株对小鼠无明显副作用。结论 新城疫强毒株F48E9对CT26小鼠结直肠癌有较好的溶瘤治疗潜力,可作为候选病毒株通过后续的反向遗传学改造建立更安全有效的溶瘤病毒株,为肿瘤研究与治疗提供新手段。厦门市重大科技创新平台项目(No.3502Z20131001)资

一株抗H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体的广谱中和活性

以H5N1禽流感病毒株Ck/HK/Yu22/02作为抗原,应用常规杂交瘤技术和血凝抑制实验筛选出抗H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的单抗8H5,单抗8H5经免疫荧光鉴定具有很好的H5特异性。选择33株2002~2006年不同地域,不同宿主中分离的不同遗传变异亚系的H5N1病毒代表株,对单抗8H5分别进行血凝抑制实验及中和试验分析,结果显示单抗8H5对所有H5亚型病毒均有较强反应,而对非H5亚型标准病毒株均不反应,说明8H5是一株广谱性抗H5特异性中和单抗,并提示单抗8H5的HA识别表位可能是一个相当保守的中和表位。并且单抗8H5双抗夹心系统的初步评价显示了其在诊断应用上的前景

高致病性禽流感病毒广谱嵌合抗体的构建表达及活性研究

高致病性禽流感病毒高度变异且缺乏有效的治疗药物.在前期研究工作中,本课题组发现一株鼠源广谱中和单抗13D4,在动物实验中显示出对H5N1禽流感病毒具有广谱治疗效果.在本研究中,从分泌13D4单克隆抗体的杂交瘤细胞株中抽提总RNA,经RT-PCR扩增出轻重链可变区DNA序列,并分别与人IgG1的轻重链恒定区基因序列拼接,构建人-鼠嵌合抗体.筛选出稳定表达嵌合抗体的CHO细胞株,从培养上清中纯化出嵌合抗体.竞争Elisa结果表明,嵌合抗体与鼠源单抗能够识别同一个抗原表位并具有相似的亲和力.血凝抑制反应和中和活性测定结果证明,13D4嵌合抗体保留了对不同亚型H5N1病毒的广谱反应性,并且对两株H5N1病毒具有中和活性.本研究获得的13D4嵌合抗体将具有潜在的治疗价值

抗H5亚型禽流感病毒单链抗体在毕赤酵母中的分泌型表达和生物活性分析

在本实验室研制出的多株针对H5N1亚型禽流感血凝素单抗中,13D4单抗对所有H5亚型病毒均有血凝抑制和中和活性,具有特异性高、反应性强和识别广的特点,且在小鼠实验中显示了对各种代表株禽流感的感染和发病均具有良好的治疗效果。在此研究基础上,本实验通过基因工程构建含有13D4单链抗体(scFv)基因的毕赤酵母表达载体,实现目的蛋白的分泌性表达和纯化。经过竞争法和血凝抑制检测其活性,表明获得的单链抗体具有与原始鼠源抗体相近的反应活性和相同的识别表位。H5N1广谱中和单抗13D4的单链抗体的成功构建,为进一步研制针对H5N1禽流感病毒的治疗性抗体奠定了基础

戊型肝炎病毒抗体双抗原夹心法ELISA的建立与初步应用

目的　建立抗戊型肝炎病毒 (HEV)抗体检测的双抗原夹心ELISA(DS -ELISA) ,并应用于多种动物血清的检测。方法　将大肠杆菌表达的一段HEVORF2区重组抗原分别包被微孔板和进行辣根过氧化物酶 (HRP)标记 ,利用 5份阳性血清和 4 0份阴性血清建立双抗原夹心ELISA ;用 4 0 0份义务献血员血清比较双抗原夹心ELISA与间接法IgG抗体ELISA的符合情况 ;用 3只HEV感染猴系列血清比较双抗原夹心ELISA试剂和Genelabs公司HEVIgG试剂 ;用双抗原夹心ELISA试剂检测新疆地区的部分牛、绵羊、山羊、猪血清和上海地区的部分鸡血清中的HEV抗体。结果　建立了检测HEV抗体的双抗原夹心ELISA方法 ,对 4 0 0份义务献血员血清的检测表明其与间接法IgG抗体ELISA试剂的符合情况良好 ,并且有更高的s/co比值 ;与Genelabs公司HEVIgG试剂的比较表明双抗原夹心ELISA试剂的检出更早 ,尤其是持续时间及强度明显优于Genelabs试剂 ;在所检测的各种动物中均发现了HEV抗体 ,其中猪抗体的阳性率最高 ,表明双抗原夹心ELISA试剂可同时用于不同动物的抗HEV抗体检测。结论　利用大肠杆菌表达的HEV重组抗原建立了双抗原夹心法ELISA ,并可同时用于不同动物的抗HEV抗体检测