Contaminação do ar por Aspergillus em ambiente de reabilitação de animais marinhos

Espécies fúngicas do gênero Aspergillus são frequentemente associadas com alta mortalidade de aves marinhas em cativeiro. Tendo em vista que a aspergilose geralmente é adquirida pela inalação dos propágulos fúngicos presentes no ar, o estudo objetivou avaliar a qualidade do ar quanto às espécies de Aspergillus, das instalações internas de um centro de reabilitação de animais marinhos que frequentemente recebe pingüins, gaivotas, albatrozes e petréis acometidos por alguma moléstia. Oitenta e um dias de colheitas foram realizados distribuídos em um período de aproximadamente dois anos, através da exposição de placas de Petri contendo Agar Sabouraud dextrose acrescido de cloranfenicol no ambiente, as quais foram posteriormente incubadas a 25ºC. As colônias identificadas como pertencentes ao gênero Aspergillus, foram classificadas quanto à espécie através da avaliação macro e micro morfológica associada a uma chave de identificação. Foram obtidos 43 isolados classificados em sete espécies distintas, sendo A. fumigatus a predominante correspondendo a 27,9%, seguida de A. niger, A. flavus e outras quatro espécies de Aspergillus sp., demonstrando que as aves marinhas estão expostas a espécies fúngicas com potencial patogênico, o que enfatiza a necessidade de um controle microbiológico no ambiente onde são mantidos os animais em cativeiro.Aspergillosis in captivity seabirds is often associated with elevated rates of mortality. The infection is usually acquired by inhalation of airborne fungal conidia. The aim of this study was to evaluate the presence of Aspergillus species in the indoor environment of a rehabilitation centre for marine animals in Southern Brazil. This centre continuously receives injured penguins, seagulls, albatrosses and petrels. Petri dishes plates with Agar Sabouraud dextrose and chloramphenicol were left open for 15 minutes in 3 distinct points in the rehabilitation centre and then incubated at 25ºC. During a period of two years the indoor air was sampled in 81 occasions. A total of 43 isolates belonging to 7 different Aspergillus species were recovered. Aspegillus fumigatus was the predominant species (27.9%), followed by A. niger (25.6%), and A. flavus (16.3%). Four other Aspergillus species were isolated. This study demonstrates that seabirds were exposed to pathogenic Aspergillus species in our rehabilitation centre, reinforcing the need for a strict microbiology control of the indoor air in the captivity environment

Evaluation of the EIA® Aspergillus platelia test for the diagnosis of aspergillosis in penguins and interference of environmental contamination

Aspergillosis is a non-contagious infectious disease caused by fungi of the genus Aspergillus, especially those belonging to the Fumigati section and has been describe in several species, among them penguins. The high mortality rates attributed to this disease are due in particular to the difficulty of performing an early diagnosis. Direct diagnostic techniques for the detection of galactomannan (GM) fungal antigen in clinical samples have been increase used for the diagnosis of invasive aspergillosis (AI) in humans. GM is a polysaccharide present in the cell wall of fungi of the genus Aspergillus. Although its applicability from the demonstration of circulating GM kinetics is already establish for the early diagnosis of AI in humans, a single serum test by Platelia® Aspergillus EIA should be interpreted with caution, since the technique has some limitations. In animals, its applicability is still not well understand. The objective of this study was to evaluate the effectiveness of the Platelia EIA® Aspergillus test for the diagnosis of aspergillosis in penguins and the influence of environmental contamination on the results. Serological samples of 29 Magellanic penguins that died of aspergillosis (case group) and 23 healthy (control group) were included in the diagnostic study, which were tested from the micro plate sandwich immunoenzymatic assay kit (Platelia Aspergillus EIA ®, Bio-Rad) according to the manufacturer's instructions. For the environmental interference experiment, 12 isolates of A. fumigatus from the mycology laboratory of the FURG / FAMED School of Medicine including standard strains, clinical isolates of penguins, humans and environmental isolates were use. The filtration, sedimentation, Pour-plate and spectrophotometry steps was use to standardize the inoculum according to CLSI, 2008. GM detection was perform on three successive dilutions of the inoculums following the manufacturer's instructions. At the end, the GM index was calculated by dividing the mean OD value of the sample duplicate (clinical or strain tested) by the mean OD value of the duplicate cut-off sample provided by the kit. The serum GM index did not differ between the animals in the control and the case group (pKW = 0.097). From the values determined by the coordinates of the ROC curve, four different cutoff points (0.5, 1.0, 1.5 and 2.0) were analyzed, resulting in sensitivity rates ranging from 86.2% to 34, 5%, and specificity between 87% and 26.1%. In the evaluation of environmental interference, the lowest concentration of fungal propagates of Aspergillus fumigatus capable of generating a positive result was 480 conidia, with a median concentration of 4.8x103. It is conclude that the serum detection of GM by the Platelia Aspergillus EIA® test does not seem to be useful for the diagnosis of aspergillosis in naturally infected penguins, resulting in many falsepositives. And, in relation to the amount of A. fumigatus conidia required to determine false-positive results in the GM detection test for AI diagnosis, it was shown that the degree of environmental contamination capable of causing interference in the Platelia Aspergillus EIA® test Be robust, of about 500 conidia.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPESA aspergilose é uma doença infecciosa não contagiosa causada por fungos do gênero Aspergillus, especialmente aqueles pertencentes à secção Fumigati e já foi descrita em diversas espécies, dentre elas os pinguins. As altas taxas de mortalidade atribuídas a esta doença, são decorrentes especialmente da dificuldade de realização de um diagnóstico precoce. Técnicas diagnósticas diretas para detecção do antígeno fúngico galactomanana (GM) em amostras clínicas têm sido utilizadas de modo crescente para o diagnóstico de aspergilose invasiva (AI) em humanos. A GM constitui-se de um polissacarídeo presente na parede celular de fungos do gênero Aspergillus. Embora sua aplicabilidade já esteja estabelecida para o diagnóstico precoce da AI em humanos, uma única testagem sérica por ELISA sanduíche a partir do kit comercial Platelia® Aspergillus EIA, deve ser interpretada com cautela, pois a técnica apresenta algumas limitações. Em animais sua aplicabilidade ainda não é bem elucidada. Com isso, o estudo objetivou avaliar a eficácia do teste Platelia EIA® Aspergillus para diagnóstico da aspergilose em pinguins e a influência da contaminação ambiental nos resultados do mesmo. Foram incluídas no estudo diagnóstico, amostras séricas de 29 pinguins de Magalhães que vieram a óbito por aspergilose (grupo caso) e 23 hígidos (grupo controle), as quais foram testadas a partir do kit para ensaio imunoenzimático tipo sanduíche em microplaca (Platelia Aspergillus EIA®, Bio-Rad) conforme as instruções do fabricante. Para o experimento de interferência ambiental foram utilizados 12 isolados de A. fumigatus da micoteca do Laboratório de Micologia da Faculdade de Medicina da FURG/FAMED incluindo cepas padrão, isolados clínicos de pinguins, humanos e isolados ambientais. Foram utilizadas para padronização do inoculo etapa de filtração, sedimentação, Pour-plate e espectrofotometria de acordo com CLSI, 2008. A detecção de GM foi realizada em três diluições sucessivas dos inoculos seguindo instruções do fabricante. Ao final foi calculado o índice de GM dividindo o valor da média da DO da duplicata da amostra (clínica ou da cepa testada) pelo valor da média da DO da duplicata da amostra de cut-off fornecida pelo kit. O índice de GM sérica não diferiu entre os animais do grupo caso e controle (pKW=0,097). A partir dos valores determinados pelas coordenadas da curva ROC, quatro diferentes pontos de corte (0,5, 1,0, 1,5 e 2,0) foram analisados, resultando em taxas de sensibilidade variando de 86,2% a 34,5%, e de especificidade entre 87% e 26,1%. Já na avaliação da interferência ambiental, a menor concentração de propágulos fúngicos de Aspergillus fumigatus capaz de gerar um resultado positivo foi de 480 conidios, sendo a concentração mediana de 4,8x103. Conclui-se que adetecção sérica de GM pelo teste Platelia Aspergillus EIA® não parece ser útil para o diagnóstico da aspergilose em pinguins naturalmente infectados, resultando em muitos falso-positivos. E, em relação a quantidade de conídios de A. fumigatus necessária para determinar resultado falso-positivo no teste de detecção de GM, evidenciou-se que há necessidade de uma maciça contaminação ambiental, por no mínimo 500 conídios, para que haja interferência no Platelia Aspergillus EIA®

Monitoramento sorológico para diagnóstico precoce da aspergilose em pinguins em cativeiro

Aspergillosis is a leading cause of death in captive penguins. Though being a known problem for decades, most reported cases are still only confirmed in post-mortem examinations, requiring further studies on methods for in vivo diagnosis of the disease. This study aimed to evaluate the efficacy of detection of anti-Aspergillus fumigatus antibodies through the performance by serological monitoring with agar gel double radial immunodiffusion (AGID) for in vivo diagnosis of aspergillosis in captive penguins. The study was performed including Magellanic penguins in a rehabilitation program at Center for Recovery of Marine Animals (CRAM/FURG) in the period from 2009 to 2011. We included 134 Magellanic penguins (Spheniscus magellanicus) in rehabilitation at CRAM, which were monitored by AGID weekly until its final destination (death or release) totaling 660 studied serum samples. The serological monitoring was performed in order to detect anti-Aspergillus fumigatus antibodies using commercial antibodies and antigen. All animals were clinically monitored and post-mortem examinations were performed on penguins that died during the study period. A total of 28% (37/134) penguin died, 89.2% (33/37) of aspergillosis, 11% (4/37) of other causes and 97 were released. From the 33 animals with proven aspergillosis, 21 had anti-A. fumigatus antibodies by AGID, being the average interval between death and the positive AGID result of 16.4 days. Twelve seronegative animals eventually died of aspergillosis. The rates of sensitivity and specificity were 63.6% and 95%, respectively, and positive and negative predictive values were 80.7% and 88.9% respectively. These data demonstrate that serological monitoring for the detection of antibodies by AGID may be a useful and important tool for the diagnosis of aspergillosis in penguins. As our study with AGID in penguins is pioneer, more studies are required concerning the prognosis in cases of aspergillosis in penguins whose therapeutic intervention is based on diagnosis by AGID, considering that the average period between the positive result of this test and the death of the animal was less than one month. Key-words: Sphenisciformes. CaptivityA aspergilose é uma das principais causas de morte de pinguins em cativeiro. Embora este seja um problema conhecido há décadas, a maioria dos casos relatados são ainda confirmados em exames post-mortem, sendo necessários mais estudos sobre os métodos de diagnóstico in vivo da doença. Assim, este trabalho objetivou avaliar a eficácia da detecção de anticorpos anti-Aspergillus fumigatus através do desempenho do monitoramento sorológico por imunodifusão radial dupla em gel de ágar (IDGA) para o diagnóstico in vivo da aspergilose em pinguins em cativeiro. O estudo foi realizado incluindo pinguins-de-Magalhães em reabilitação no Centro de Recuperação de Animais Marinhos (CRAM/FURG) no período de 2009 a 2011.. Foram incluídos 134 pingüins de Magalhães (Spheniscus magellanicus) em reabilitação no Centro de Recuperação de Animais Marinhos (CRAM / FURG), que foram monitorados por IDGA semanalmente até seu destino final (morte ou de liberação), totalizando 660 amostras de soro estudadas. O monitoramento sorológico foi realizado para detecção de anticorpos anti-Aspergillus fumigatus utilizando antígeno e anticorpos comerciais. Todos os animais foram acompanhados clinicamente e exames post-mortem foram realizados em pinguins que vieram a óbito durante o período do estudo. Um total de 28% (37/134) dos pinguins veio a óbito, 89,2% (33/37) de aspergilose, 11% (4/37) de outras causas e 97 foram libertados. A partir dos 33 animais com aspergilose comprovada, 21 apresentaram anticorpos anti- A. fumigatus por IDGA, sendo o intervalo médio entre a morte e as IDGA positivas 16,4 dias. Doze animais com sorologia negativa vieram a óbito por aspergilose. As taxas de sensibilidade e especificidade foram de 63,6% e 95%, respectivamente, e os valores preditivo positivo e negativo foram 80,7% e 88,9%, respectivamente. Estes dados demonstram que o acompanhamento serológico para a detecção de anticorpos por IDGA pode ser uma ferramenta útil e importante para o diagnóstico de aspergilose em pinguins. Como nosso estudo com IDGA em pinguins é pioneiro, maiores estudos são necessários acerca do prognóstico dos casos de aspergilose em pinguins cuja intervenção terapêutica se baseie no diagnóstico por IDGA, considerando que o período médio entre o resultado positivo deste teste e o óbito do animal foi de menos de um mês

ISOLATION AND IDENTIFICATION OF Aspergillus spp. FROM THE WATER USED FOR REHABILITATION OF MAGELLANIC PENGUINS

Aspergillosis is the main cause of mortality in captivity penguins. The infection occurs mainly by conidia inhalation of the Aspergillus genus, however, the fungus can also be dispersed by water. Therefore, this study aimed to evaluate water quality of the pool where the rehabilitated penguins remain at Centro de Recuperação de Animais Marinhos in Rio Grande city, Brazil, searching for the presence of the fungus Aspergillus spp. Water samples were collected weekly during a ten-month period and processed within six hours, applying the technique of filtrating membrane, with incubation at 25 ºC and 37 ºC during seven days. Of the forty samples analyzed, thirty-two were positive for the presence of Aspergillus genus, from these 60% correspond to A. fumigatus. Some variables significantly interfered on the isolation of Aspergillus genus and/or Aspergillus fumigatus specie, such as incubation temperature, seasonality and population density. This study showed Aspergillus spp. is present in the water, being one of the possible sources of infections for penguins in rehabilitation

Can Aspergillus fumigatus conidia cause false-positive results in the galactomannan enzyme immunoassay test?

Abstract INTRODUCTION: Several factors can cause false-positive results in the galactomannan (GM) test; however, others remain unknown. Presently, the impact of airborne contamination by Aspergillus conidia during enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) remains uninvestigated. METHODS: We studied 12 A. fumigatus isolates. Fungal conidia were serially diluted and tested for GM detection using the Platelia® Aspergillus enzyme immunoassay (EIA). RESULTS: The conidia concentration required for an EIA-positive result was 4.8 × 103 (median). CONCLUSIONS: This is the first study to evaluate the impact of environmental contamination on the Platelia® Aspergillus EIA assay. Only massive contamination can interfere with GM optical readings, suggesting that environmental contamination does not cause false-positive test results