Identification and molecular characterization of resistance mechanisms against cellular immune effectors to optimize cancer immunotherapies

Es existieren zahlreiche Immuntherapien um malignen Erkrankungen zu begegnen. Ihnen gemein ist, dass der Erfolg einer solchen Therapie von der Sensitivität gegenüber den eingesetzten Immuneffektoren und deren zytotoxischen Mechanismen abhängt. Deswegen haben wir ein Modell entwickelt, mit dem molekulare Resistenzmechanismen von Tumorzellen gegenüber antigenspezifischen zytotoxischen T-Zellen in vitro und in vivo untersucht werden können. Als Tumormodell dienten dabei murine Fibroblasten, welche mit dem adenoviralen Onkogen E1A transformiert wurden und das Epitop Ad5E1A234-243 im murinen H2-Db MHC-Klasse-I Kontext präsentieren (E1A-MEF). Als korrespondierende Immuneffektoren verwendeten wir E1A-spezifische, T-Zellrezeptor transgene zytotoxische T-Zellen (ZTL). Mit Hilfe dieses Systems konnten wir drei verschiedene Faktoren identifizieren, welche zu einer Resistenz gegenüber antigenspezifischen ZTL beitragen. In Vorarbeiten wurde ein erstes Kandidatengen, die Cyclooxygenase-2 (COX-2), identifiziert. Dieses Enzym, welches für die Produktion des Gewebshormons Prostaglandin E2 verantwortlich ist, wurde bereits im Zusammenhang mit der Tumorentstehung und der Resistenzbildung in der Literatur beschrieben. In unserem murinen Immuntherapiemodell führte die COX-2-Überexpression zu einer Resistenz gegenüber ZTLs in vitro, die sich in einer deutlichen Steigerung des klonogenen Überlebens der Tumorzellen nach Ko-Kultur mit antigenspezifischen ZTLs darstellte. Ebenfalls konnte gezeigt werden, dass die Überlebenszeit von Mäusen mit COX-2-exprimierenden Tumoren nach adoptivem Transfer mit E1A-spezifischen ZTLs deutlich verkürzt war. In einem Modell für Immunsurveillance zeigten COX-2 exprimierende Tumore ein deutlich schnelleres Wachstum, so dass gezeigt werden konnte, dass COX-2 auch zu einer spezifischen Immunresistenz in vivo führt. In weiterführenden Experimenten wurde festgestellt, dass die vermehrte COX-2 Expression die Sekretion von Interferon-gamma durch antigenspezifische T-Zellen reduziert und damit die Sensitivität von Tumorzellen vermindert wird. Die exogene Zugabe von Interferon-gamma konnte die COX-2-vermittelte Immunresistenz überwinden. COX-2 ist damit ein Beispiel für einen zell-autonomen Resistenzmechanismus gegenüber spezifischen Immuneffektoren. In dieser Arbeit wurden zwei weitere Resistenz vermittelnde Faktoren identifiziert: das ribosomale Protein S9 (RPS9) und der eukaryotische Elongationsfaktor 1B delta (EF1Bδ). Die Überexpression dieser beiden Gene führte sowohl zu einer Resistenz gegenüber antigenspezifischen T-Zellen als auch zu einer Resistenz gegenüber Apoptose induzierenden Stimuli. In dieser Arbeit beschreiben wir die Beteiligung von RPS9 und EF1Bδ an der Ausbildung eines Resistenzmechanismus gegenüber ZTLs und zytotoxischen Substanzen, welcher vermutlich durch die Aktivierung des MAP-Kinase Signalwegs verursacht wird.The efficacy of immune surveillance and antigen-specific cancer immunotherapy equally depends on the activation of a sustained immune response targeting cancer antigens and the susceptibility of cancer cells to immune effector mechanisms. A detailed understanding of the activation and regulation of cancer-specific immune reaction as well as the mechanisms determining the effector phase of immune elimination is crucial for successful implementation and improvement of such immunotherapies. Therefore, we have development an experimental system for unbiased identification of mechanisms that modulate the susceptibility of cancer to the cytotoxic effects of activated, antigen-specific T cells. This system is based on murine embryonic fibroblasts expressing the adenoviral epitope E1A to serve as cancer model (E1A-MEF) and E1A-specific, receptor-transgenic cytotoxic T cells as corresponding immune effectors. Using this system we have identified three different factors that confer resistance to cancer cell elimination by antigen-specific cytotoxic T cells (CTL). The first analyzed candidate is cyclooxygenase 2 (COX-2) which, when expressed in E1A-MEF, increased the clonogenic survival of the cancer cells when cocultured with antigen-specific T cells. COX-2 expressing tumors established in immune-deficient mice were less susceptible to adoptive immunotherapy with TCR-transgenic lymphocytes in vivo. The immune surveillance of COX-2 positive tumor cells in TCR-transgenic mice was less efficient, too. Mechanistically, COX-2 expression decreased the sensitivity of cancer cells to activated antigen-specific T cells by modulating the release of interferon-gamma. Addition of interferon-gamma sensitized COX-2 expressing E1A-MEF to tumor suppression by their respective cellular targets. Here we describe a first example of a cell-autonomous resistance mechanism that is specific for cellular immune effectors. Two further identified factors that confer resistance to antigen-specific CTL are the ribosomal protein S9 (RPS9) and the eukaryotic elongation factor 1 delta (EF1Bδ). Expressing RPS9 and EF1Bδ in E1A-MEF caused an increased clonogenic survival of cells when cocultured with antigen-specific T cells. Furthermore, RPS9 and EF1Bδ expression mediated resistance to cytotoxic stimuli. Presumable, the resistance to cellular immune effectors and to apoptosis inducing drugs results from an activation of the MAP-kinase pathway. Here we describe the involvement of two factors belonging to the protein biosynthesis machinery in the development of resistance to cytotoxic stimuli as well as antigen-specific CTL

Exploration of the therapeutic effect of the anti-Mesothelin-immunoconjugate Anetumab Ravtansine on murine models of cancer of the cervix uteri

Mesothelin (MSLN) ist ein membranständiges Glykoprotein, das unter physiologischen Bedingungen nur von mesothelialen Zellen exprimiert wird. In verschiedenen Tumorentitäten wurde eine Überexpression von Mesothelin beobachtet, was dieses Membranprotein zu einem Ziel für neue antikörperbasierte Immuntherapien macht. In dieser Studie wurde die Expression von Mesothelin in humanen Zervixkarzinomen sowie die therapeutische Wirksamkeit des anti-Mesothelin-Immunkonjugates Anetumab Ravtan-sine (BAY 94-9343) an murinen Zervixkarzinommodellen untersucht. Methoden: Die Mesothelinexpression von 79 Zervixkarzinomproben wurde mittels immunhistochemische Färbung (IHC) bewertet. Es wurden drei Zervixkarzinomzelllinien mit starker (HeLa), moderater (Caski) und ohne (Cx-03) Mesothelinexpression ausgewählt. Die zytotoxische Wirkung von Anetumab Ravtansine wurde auf diese drei Zelllinien mittels MTT-Assay getestet. Danach wurde die Tumorantwort auf BAY 94-9343 in murinen Zervixkarzinommodellen untersucht. Hierfür wurden Scid Mäuse mit HeLa, Caski oder Cx-03 Tumoren mit unterschiedlichen Konzentrationen von BAY 94-9343 oder PBS als Kontrolle behandelt. Die Tumorantwort wurde mittels RECIST-Score bemessen. Ergebnisse: 50/79 (63%) Zervixkarzinome zeigten eine positive Mesothelinexpression in der IHC-Färbung. Die Adenokarzinome hatten einen höheren Anteil an MSLN-positiven Tumoren, als die Plattenepithelkarzinome (77% gegen 57%). Die MTT-Untersuchung zeigte eine spezifische, dosisabhängige zytotoxische Wirkung von Anetumab Ravtansine auf Mesothelin-exprimierende Zervixkarzinomzellen. BAY 94-9343 zeigte keine Wirkung auf den Mesothelin-negativen Caski-Tumoren im Tiermodell. Bei moderater Mesothelin-expression (Cx-03-Tumoren) konnte 1/7 Tumore unter der Therapie mit 10 mg/kg BAY 94-9343 zweimal pro Woche oder mit wöchentlicher Gabe von 15 mg/kg BAY 94-9343 eradiziert werden. Bei hoher Mesothelinexpression (HeLa Tumore), wurden durch die Gabe von 10 mg/kg BAY 94-9343, zweimal pro Woche, 7/8 Tumoren komplett eradiziert. Sowohl die Gabe von 15 mg/kg einmal pro Woche als auch alle 3 Wochen, konnte eine Eradikation bei allen (7/7) Mäusen erreichen. Zusammenfassung: In der vorliegenden Studie konnte gezeigt werden, dass nahezu 75% der Adenokarzinome der Zervix und etwa die Hälfte der Plattenepithelkarzinome prinzipiell für eine Therapie mit Anetumab Ravtansine geeignet sind. Die Wirksamkeit von Anetumab Ravtansine ist abhängig von der Stärke der Mesothelinexpression, sodass eine sorgfältige Selektion durch IHC erfolgen sollte.The cell surface glycoprotein Mesothelin (MSLN) is physiologically expressed in mesothelial cells. It has been found that MSLN is overexpressed in several tumor entities. The aim of this study was to evaluate the MSLN expression in cervical cancer and the therapeutical effect of the novel anti-Mesothelin drug conjugate Anetumab Ravtansine (BAY 94-9343). Methods: We analyzed the expression of MSLN in 79 cervical carcinomas through im-munohistochemistry. We selected three cervical cancer cell lines with high (HeLa), moderate (Caski) and no (Cx-03) MSLN expression and measured the cytotoxicity of Anetumab Ravtansine via MTT-Assay. BAY 94-9343 was applied for dose-efficiency studies in Scid mice previously injected with the cervical cancer entities mentioned above. The RECIST-Score was used to evaluate the tumor response. Results: In 77% of cervical adenocarcinomas, Mesothelin was expressed to high levels. Among squamous cell carcinomas of the cervix uteri expression levels were lower, but 57% still showed a MSLN expression. Anetumab Ravtansine showed a MSLN- and dose-dependent therapeutic effect in cervical cancer models in the MTT-Assay. There was no shown effect of BAY 94-9343 in the MSLN-negative Caski model in Scid mice. Applying BAY 94-9343 at a dose of 10 mg/kg twice weekly or 15 mg/kg weekly induced complete tumor regression in 1/7 mice in the Cx-03 model with moderate MSLN-expression. 7/8 HeLa-tumors with high MSLN expression have been eradicated applying BAY 94-9343 at a dose of 10 mg/kg twice weekly and 7/7 HeLa-tumors have been eradicated applying BAY 94-9343 at a dose of 15 mg/kg weekly or every three weeks. Conclusions: With an overexpression of Mesothelin in almost three quarters of the cervical adenocarcinomas and over the half of the squamous cell carcinomas of the cervix uteri, Anetumab Ravtansine should be further investigated in the treatment of cervical cancer

Einschätzung der Verwendbarkeit und Aussagekraft von toxikologisch relevanten Endpunkten der TiO2- und BaSO4-NP anhand eines In vitro-Langzeitmodells für in vivo

Nanopartikel (NP) werden insbesondere bei Herstellungs- und Verarbeitungsprozessen in nanotechnologischen Betrieben in die Umgebungsluft freigesetzt und vornehmlich via Inhalation in den menschlichen Organismus aufgenommen. Aufgrund ihrer Größe und veränderter physikochemischer Eigenschaften stellen NP ein bisher nicht genügend einschätzbares Gesundheitsrisiko dar. Daher steht die Interaktion aspirierter NP mit dem Lungengewebe im Fokus nanotoxikologischer Untersuchungen. Die Effekte aerogener NP wurden sowohl in vivo mittels Inhalation und Instillation als auch in vitro in Zellkultursystemen eingehend untersucht. Als Hauptmechanismus der toxischen Effekte wird dabei die NP-induzierte Bildung reaktiver Sauerstoffagenzien postuliert. Der resultierende oxidative Stress ist in der Lage, zelluläre Bestandteile wie Membrane, Proteine, DNA und Organellen zu schädigen und infolgedessen Entzündungsprozesse und Zelltod auszulösen. Diesbezüglich erfordern die Fortschritte der Nanotechnologie, die mit einem zunehmenden Umgang des Menschen mit NP einhergehen, eine entsprechende Risikobewertung. Aufgrund von fehlender Standardisierung sowie von Unterschieden in der Dosimetrie und den Messverfahren konnten die Wirkmechanismen der NP bislang nicht vollständig aufgeklärt werden. Zudem stehen die Ergebnisse von Hochdosis-Akutstudien wegen der unrealistischen Belastung in der Kritik. Aus diesem Grund war ein Ziel der vorliegenden Arbeit, eine realitätsnahe Bewertung des Risikopotenzials der PSLT-NP TiO2 und BaSO4 nach Langzeitexposition zu geringen Dosen in vitro zu ermitteln. Als weiteres Ziel soll das dazu etablierte Modell die Aussagekraft von In vitro-Studien erhöhen, um eine einfache und reproduzierbare Prognose von adversen biologischen Effekten in vivo zu erreichen und somit Tierversuche zu reduzieren. Das Modell wurde auf Basis von In vivo-Langzeitstudien mit niedriger Dosis auf höchstem europäischen Standard etabliert und soll die chronische Exposition von Angestellten gegenüber aerogener NP in nanotechnologischen Betrieben nachbilden. Die Exposition erfolgte in einem ein- bis dreimonatigen Untersuchungszeitraum jeweils sechs Stunden täglich über fünf Tage die Woche. Die gemäß standardisiertem Dispersionsprotokoll gelösten NP wurden dabei in humanen Typ II-Alveolarepithelzellen (A549) auf die biologischen Endpunkte Viabilität und Zelltod, ROS-Generierung sowie Beeinträchtigung des mitochondrialen Membranpotenzials untersucht. Ebenfalls wurde ein Einfluss der NP auf die Zellproliferation und den Zellzyklus analysiert. Der Schwerpunkt wurde dabei auf die Beobachtung der subakuten und subchronischen Effekte beider PSLT-NP gelegt. Neben den toxischen Effekten standen insbesondere die noninvasive markierungsfreie Betrachtung und Quantifizierung der zellulären Aufnahme sowie der intrazellulären NP-Verteilung auf Einzelzellebene anhand der konfokalen Raman-Mikroskopie im Mittelpunkt der Arbeit. Denn die daraus ermittelten Informationen stellen mit der relativen Dosis sowie der Beeinträchtigung der Zellorganellen einen essenziellen Faktor für die Risikobewertung dar. Auf Basis der Quantifizierung der NP konnte erstmals eine starke Reduktion des Gehalts an intrazellulären NP in A549-Zellen nach subakuter und subchronischer Exposition festgestellt werden. Insbesondere bei dem Gehalt intrazellulärer BaSO4-NP wurde trotz konstanter Exposition ein starker Rückgang verzeichnet, sodass nach subchronischer Exposition lediglich in der höchsten Konzentration vereinzelte BaSO4-Aggregate detektiert werden konnten. Auf Grundlage dieser Ergebnisse kann eine Aufnahmeresistenz der beiden NP in vitro vermutet werden. Diese stimmt zudem mit dem ermittelten geringen zytotoxischen Potenzial der NP überein. Eine Pixelanalyse zeigt im Vergleich, besonders nach subakuter/subchronischer Exposition, eine mehrfach größere Menge an TiO2-NP als an BaSO4-NP innerhalb der Zellen. Demnach beeinflusst die postulierte Resistenz die Aufnahmefähigkeit von BaSO4-NP mehr als von TiO2-NP. Trotz des festgestellten geringen toxischen Potenzials beider NP auf Lungenepithelzellen nach Langzeitexposition zu realitätsnahen geringen Dosen sind die Auswirkungen der NP-Resistenz in vivo zu klären. Denn neben einem verstärkten Abtransport ohne Lungenschädigung ist weiterhin eine Translokation in extrapulmonale Gewebe mit unbekannten Auswirkungen möglich. Zudem zeigt die Kolokalisation der NP mit intrazellulären Organellen eine Präferenz der TiO2-NP für die Mitochondrien sowie der BaSO4-NP für das endoplasmatische Retikulum. Dabei kolokalisieren beide NP nach subakutem/subchronischem Expositionszeitraum verstärkt mit dem ER. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen eine starke Korrelation mit den Beobachtungen der Langzeitinhalationsstudien in vivo. Denn die präferierte Kolokalisation der TiO2-NP mit den Mitochondrien als Quelle der ROS stimmt mit der Induktion von ROS als Ursache toxischer Effekte in vivo überein. Ebenfalls gehen die in vivo beobachtete rasche initiale Lungenclearance sowie die Translokation von inhalierten BaSO4-NP in das Knochengewebe konform mit der ermittelten Resistenzentwicklung und der präferierten Kolokalisation mit dem ER, da dieses sowie das Knochengewebe stehen Calciumspeicher in Verbindung stehen. Demnach konnte mithilfe des in der vorliegenden Arbeit etablierten Modells und markierungsfreier CRM-Verfahren in vitro eine Prognose von adversen Effekten in vivo erreicht werden. Zusammenfassend zeigen die beiden PSLT-NP TiO2 und BaSO4 nach realistischer Langzeitexposition gegenüber geringen Mengen ein geringes toxisches Potenzial für A549-Zellen. Die erstmals beobachtete Entwicklung einer NP-Resistenz mit daraus folgender geringer effektiver Dosis kann eine Ursache dafür darstellen. Mithilfe des etablierten In vitro-Modells nach EU-Standard sowie der markierungsfreien CRM ist es zudem gelungen, eine einfache und validierte Möglichkeit zur Risikopotenzialeinschätzung zu schaffen und so dazu beizutragen, die Aussagekraft von In vitro-Studien zu erhöhen sowie aufwendige Tierstudien einzusparen.:Inhaltsverzeichnis I Abbildungsverzeichnis IV Abkürzungsverzeichnis VI 1 Einleitung 1 1.1 Nanopartikel und deren Anwendungsbereiche 2 1.2 Berufsbedingte NP-Exposition 4 1.3 Aufnahmewege der Nanomaterialien 6 1.3.1 Die Lunge als Haupteintrittspforte 7 1.3.2 Zelluläre Aufnahmemechanismen 10 1.4 Toxisches Potenzial der NP 12 1.4.1 Oxidativer Stress 12 1.4.2 Einfluss auf die Zellvitalität 14 1.4.3 Auswirkung auf den Zellzyklus 17 1.4.4 Induktion einer Entzündungsreaktion 19 1.5 Biologische Antwort auf TiO2 und BaSO4 als poorly soluble, low toxicity (PSLT) NP in vivo und in vitro 20 1.5.1 TiO2-NP 21 1.5.2 BaSO4-NP 25 2 Zielsetzung der Arbeit 30 3 Materialien und Methoden 32 3.1 Geräte 32 3.2 Materialien 32 3.2.1 Nanopartikel 32 3.2.2 Chemikalien 32 3.2.3 Verbrauchsmaterialien 33 3.3 Software 33 3.4 Methoden 33 3.4.1 Präparation der Nanopartikel 33 3.4.2 Zellbiologische Methoden 34 3.4.3 Biophysikalische Methoden 37 3.4.4 Zytotoxizität-Assays 49 3.4.5 Statistische Auswertung 53 4 Ergebnisse 54 4.1 Charakterisierung der TiO2- und BaSO4-NP 54 4.2 Zytotoxische Effekte der NP auf A549-Zellen 59 4.2.1 Determination von Apoptose und Nekrose 59 4.2.2 Induktion von ROS in NP-exponierten A549-Zellen 61 4.2.3 MMP als Marker der Apoptose 62 4.2.4 Zellzyklus und Zellproliferation unter Einfluss der NP 63 4.3 Aufnahme und Verteilung der NP in alveolaren Epithelzellen 68 4.3.1 Chemisch selektive Bildgebung der A549-Zellen 68 4.3.2 Semiquantifizierung der NP-Aufnahme in A549-Zellen 70 4.3.3 Aggregatsbildung innerhalb der Einzelzelle 80 4.3.4 Intrazelluläre Lokalisation der NP 83 5 Diskussion 89 5.1 Extra- und intrazelluläre NP-Charakterisierung 91 5.2 Evaluation zytotoxischer Auswirkungen von TiO2- und BaSO4-NP unter subchronischen In vitro-Expositionsszenarien 97 5.3 Aufnahme und Verteilung der NP in A549-Zellen 102 5.3.1 Aufnahme der TiO2- und BaSO4-NP 102 5.3.2 Kolokalisation der NP mit den verschiedenen Zellorganellen 108 5.4 Abschätzung des Risikopotenzials 112 6 Zusammenfassung der Arbeit 115 7 Literaturverzeichnis 118 8 Anhang 159 8.1 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 159 8.2 Lebenslauf 160 8.3 Danksagung 16

Detektion bakterieller Multiresistenzen: Etablierung molekularer Testsysteme für patientennahe Screening-Verfahren

Multiresistente Erreger (MRE), wie der Methicillin-resistente Staphylococcus aureus, Vancomycin-resistente Enterokokken und multiresistente gramnegative Bakterien, die β Lactamasen mit erweitertem Wirkspektrum produzieren und/oder Carbapenem resistent sind, verursachen immer häufiger nosokomiale Infektionen. Diese sind schwer zu behandeln und gehen mit einer höheren Morbidität und Mortalität einher. Da besiedelte oder infizierte Patienten ein Reservoir und Vehikel für die Verbreitung von MRE im Krankenhaus darstellen, ist es essentiell, asymptomatische MRE-Träger frühzeitig durch ein aktives Screening zu identifizieren und gegebenenfalls gezielte Hygienemaßnahmen zu ergreifen. In der vorliegenden Arbeit wurde ein TaqMan® Real-Time PCR System entwickelt, das es ermöglicht 42 bakterielle Antibiotikaresistenzgene der vier klinisch wichtigsten MRE parallel und direkt aus Screening-Abstrichen nachzuweisen. Im Vergleich zum kulturbasierten Goldstandard konnten MRE innerhalb von 2,5 h mit hoher Sensitivität und Spezifität sowie mit hohen positiven und negativen Vorhersagewerten detektiert werden. Nach Integration spezieller hochdurchsatzgeeigneter mikrofluider PCR Karten konnten darüber hinaus erstmals molekularbiologische Daten zur Art und Häufigkeit von Resistenzgenen in einer Kohorte von Flüchtlingen (n = 506) im Vergleich zu einer Kontrollkohorte des deutschen FoCus-Netzwerks (n = 100) erhoben werden. Die erhöhte Prävalenz einiger Resistenzdeterminanten in der Kohorte Flüchtlinge und die Beobachtung, dass diese unabhängig von potentiellen Pathogenen auftreten, deuten darauf hin, dass nicht nur die phänotypische Resistenz in Problemkeimen, sondern auch die zugrundeliegenden Resistenzgene in apathogenen Kommensalen der mikrobiellen Flora größerer Aufmerksamkeit bedürfen. Dieses leistungsfähige und schnelle Real-Time PCR-basierte System könnte somit als „same day“ MRE-Screeningtest unmittelbar bei Krankenhausaufnahme eingesetzt werden und potentiell Transmissionsraten senken, Isolationszeiten verkürzen und Kosten sparen

Retrospektives Audit im Rahmen des klinikinternen Qualitätsmanagements zum Einfluss des Kolonisationsscreenings auf mikrobiologische Diagnostik und Antibiotika-Therapie der Late onset Sepsis bei Frühgeborenen mit einem Geburtsgewicht unter 1.500 g

Hintergrund: Seit 2012 empfiehlt die Kommission für Krankenhaushygiene und Infektionsprävention (KRINKO) für auf der neonatologischen Intensivstation (NICU) behandelte Frühgeborene mit einem Geburtsgewicht unter 1.500 g (Very low birth weight infants, VLBWI) ein wöchentliches Kolonisationsscreening (KoS) auf multiresistente (MRE) und besonders pathogene Erreger. Unter MRE werden subsummiert: multiresistente gramnegative Erreger (MRGN), Methicillin-resistenter S. aureus (MRSA) und Vancomycin-resistente Enterokokken (VRE). Die beiden Ziele des KoS sind: 1. Prävention der horizontalen Transmission und nachfolgenden nosokomialen Infektion (NI); 2. Wirksame empirische Antibiotikatherapie (ABT) von NI bei VLBWI mit vorbestehender MRE-Kolonisation. Es wird diskutiert, ob das KoS dem Konzept des Antibiotic Stewardship (ABS) dadurch entgegenwirkt, dass vermehrt Reserveantibiotika wie Carbapeneme als empirische ABT eingesetzt werden, wenn bei durch MRGN kolonisierten VLBWI eine NI auftritt. Carbapeneme sollten ausschließlich bei NI durch MRGN oder bei NI mit Organversagen eingesetzt werden. Fragestellungen: Auswirkung des KoS auf die ABT, insbesondere den Einsatz von Reserveantibiotika; Auswirkung des KoS auf mikrobiologische Diagnostik und ABT der Late onset sepsis (LOS); Prävalenz von MRE-Kolonisation und durch MRE verursachter NI; Risikofaktoren der MRGN-Kolonisation; Einfluss der ABT auf den MRGN-Erstnachweis; Indikationen einer Carbapenem-Therapie; Standard operation procedures (SOPs) und Drug Monitoring; Identifikation für das Qualitätsmanagement (QM) relevanter Prozesse auch zur Vorbereitung der Einführung eines ABS-Programms. Material und Methodik: Retrospektive Kohortenanalyse aller 3 Jahre vor (2009-2011) bis 3 Jahre nach Einführung des KoS (2012-2014) auf der NICU und der neonatologischen Intermediate Care (IMC), Klinik für Allgemeine Pädiatrie und Neonatologie des Universitätsklinikums des Saarlandes, behandelten VLBWI. Untersuchung der ABT in Form der Length of Therapy (LoT), Days of Therapy (DoT) in Abhängigkeit von NI, Device-Anwendung und Diagnostik bei Verdacht auf LOS (Blutkultur, Spitzen zentraler (Central line, CL) Gefäßkatheter). Ergebnisse: Verglichen mit der Kohorte vor Einführung (n=191) zeigte sich nach Einführung des KoS (n=201) eine signifikante Abnahme von LoT (p<0,001) und DoT (p<0,001). Dies war durch die signifikante Abnahme von LoT (p<0,001) und DoT (p<0,001) in der Geburtsgewichtsklasse 1.000-1.499 g bedingt; in dieser waren die DoT für Carbapeneme (p=0,009) und Teicoplanin (p=0,040) signifikant niedriger, was durch eine signifikante seltenere LOS (p=0,025) verursacht wurde. In den beiden anderen Geburtsgewichtsklassen zeigte sich kein signifikanter Unterschied der LoT (p=1,000 für VLBWI <500 g, p=0,754 für VLBWI von 500-999 g). Die DoT für Carbapeneme war in der Gesamtkohorte nach 21 Einführung des KoS nicht signifikant unterschiedlich (p=0,341). Signifikante Unterschiede in der ABT nach Einführung des Kos fanden sich in der Gesamtkohorte nur als höhere DoT für Cefuroxim (p=0,003) und niedrigere DoT für Ciprofloxacin (p=0,046). Die Kohorte nach Einführung des KoS wies ein signifikant niedrigeres medianes Geburtsgewicht (1.060 g vs. 1.120 g, p=0,046) und eine signifikant längere Verweildauer (68 Tage vs. 61 Tage, p=0,015) auf. Mit Ausnahme der Geburtsgewichtsklasse 1.000-1.499 g bestand kein signifikanter Unterschied (p=0,948) in der LOS-Prävalenz (n=77 vs. n=95). Die Anwendungsrate der Devices CL (p=0,079), periphere Venenverweilkanüle [PVK (p=0,209)] und ihre Assoziation zu einer Sepsis (CL: p=0,611, PVK: p=0,071) war nicht signifikant unterschiedlich. Die Praxis der Blutkultur- und CL-Diagnostik bei LOS unterschied sich nach Einführung des KoS nicht signifikant von derjenigen vor Einführung: Eine Blutkulturdiagnostik wurde bei 61 % vs. 59 % (p=0,916) der Episoden, eine CL-Diagnostik bei 93,5 vs. 94,7 % (p=0,916) der Episoden durchgeführt. In der Gesamtkohorte (n=392) wurde bei 91 VLBWI ein MRGN nachgewiesen; hiervon 55 nach Einführung des KoS (2MRGN in 83/91 (91,2 %) der Fälle). Eine LOS durch zuvor im KoS nachgewiesene MRE wurde nicht beobachtet; zwei Blutstrominfektionen (BSI) durch MRGN waren zugleich der Erstnachweis. Im KoS MRGN-positive VLBWI (n=55) wiesen verglichen mit MRGN-negativen (n=146) eine signifikant längere Verweildauer auf NICU (p=0,002) und IMC (p=0,015) auf; Geburtsgewicht (p=0,147) und Gestationsalter (p=0,197) waren nicht signifikant verschieden. Die Anwendungsrate von CL (p=0,001) und PVK (p=0,001) war bei MRGN-positiven VLBWI signifikant höher, die LOS-Prävalenz (p=0,067) hingegen nicht signifikant verschieden. Die LoT war signifikant länger (p=0,001), die DoT (p=0,001) signifikant höher; der Einsatz von Ampicillin/Sulbactam (DoT, p=0,002) und Gentamicin (DoT, p=0,021) war signifikant mit dem Nachweis eines MRGN assoziiert. Ein MRGN wurde im KoS im Median am 43. Lebenstag (Interquartilsabstand 26-86, Min. 1, Max. 133) nachgewiesen; je länger die LoT (p=0,020) und je höher die DoT für Carbapeneme (p=0,023), desto signifikant später war der Erstnachweis. Eine ABT mit Carbapenemen (n=122) war in der Gesamtpopulation signifikant häufiger, je niedriger Geburtsgewicht (p<0,001) und Gestationsalter (p<0,001) und je höher die Anwendungsrate von CL (p<0,001) und PVK (p<0,001) waren. Carbapeneme wurden bei MRGN-positiven VLBWI nicht signifikant häufiger (p=0,167) eingesetzt; ihr Einsatz war auch zumeist nicht durch MRGN-Positivität im KoS begründet. SOPs zu Blutkulturdiagnostik und ABT der LOS lagen nicht vor; Vancomycin und Gentamicin wurden ohne ein Drug Monitoring eingesetzt. Die Gesamtkohorte weist abgesehen von der 22 seltenen Nekrotisierenden Enterokolitis (n=10; nur Verdachtsfälle) keine strukturellen Besonderheiten auf. Schlussfolgerungen: Die Einführung des KoS führte weder zu einer Verbrauchszunahme von Reserveantibiotika noch zu einer Änderung der Blutkultur- und CL-Diagnostik der LOS. Mit Ausnahme von VLBWI der Geburtsgewichtsklasse 1.000-1.499, welche nach Einführung des KoS eine Abnahme der LOS-Prävalenz unbekannter Ursache aufwiesen, war der ausbleibende Verbrauchsanstieg in den anderen Geburtsgewichtsklassen und der Gesamtkohorte nicht durch eine niedrigere Rate von NI bedingt. Da der Erstnachweis eines MRGN im KoS überwiegend erst nach der kritischen Phase der Intensivtherapie erfolgte, hatte dieser offensichtlich keine Auswirkung mehr auf den Einsatz von Carbapenemen. Verweildauer und LoT, insbesondere DoT für Ampicillin/Sulbactam und DoT für Gentamicin, wurden als Risikofaktoren der MRGN-Kolonisation identifiziert. Eine Carbapenem-Therapie führte zu einem signifikant späteren MRGN-Erstnachweis; dies könnte darauf hindeuten, dass MRGN im KoS solange nicht nachgewiesen wurden, wie eine gegen MRGN wirksame Carbapenem-Therapie erfolgte. Es sollte durch weitere Studien untersucht werden, ob die Sensitivität des KoS während einer gegen die zu untersuchenden Pathogene wirksamen ABT reduziert ist. Als QM-relevante Prozesse wurde das Fehlen von SOPs und Drug Monitoring sowie das Missverhältnis von Blutkultur- zu CL-Diagnostik identifiziert. Die Einführung eines ABS-Programms erfordert Investitionen in Strukturen (patientenbezogene elektronische Verordnung der ABT, SOPs) und Personal (infektiologische Audits).Background: Since 2012, the Commission for Hospital Hygiene and Infection Prevention (KRINKO, Germany) recommends a weekly colonization screening (KoS) for multidrug-resistant (MRE) and highly pathogenic bacteria in very low birth weight (< 1.500 g) infants (VLBWI). The term “MRE” refers to multidrug-resistant gram-negative pathogens (MRGN), methicillin-resistant S. aureus (MRSA) and vancomycin-resistant enterococci (VRE). The KoS serves two purposes: 1. Prevention of horizontal transmission and subsequent nosocomial infection (NI); 2. Effective empirical antibiotic therapy (ABT) of NI in VLWBI with a history of MRGN colonization. There is an ongoing debate whether MRGN colonization increases the use of carbapenems as a first-line treatment when NI is suspected; such an increase would be in stark contrast to the concept of antibiotic stewardship (ABS). Carbapenems should be reserved for the empiric treatment of NI caused by MRGN or NI complicated by organ failure. Objectives: To assess the impact of KoS on ABT, in particular on the use of third-line antibiotics; to determine its impact on microbiologic diagnostics and on ABT of late onset sepsis (LOS); to evaluate the prevalence of MRE colonization and NI caused by MRE; to determine risk factors of MRGN colonization; to assess factors influencing the first detection of MRGN; to determine the use of carbapenems; to evaluate standard operation procedures (SOPs) and drug monitoring; to identify relevant issues for quality management (QM) prior to the implementation of an ABS program. Methods: Retrospective cohort analysis of all VLBWI treated 3 years before (2009-2011) and 3 years after the introduction of the KoS (2012-2014); Site: Tertiary NICU and neonatal intermediate care (IMC) Unit, Department of General Pediatrics and Neonatology, University Hospital of Saarland; assessment of ABT [Length of Therapy (LoT) and Days of Therapy (DoT)] with regard to occurrence of NI, use of intravascular devices and microbiologic diagnostics (blood culture, tips of central vascular catheters, CL) when LOS was suspected. Results: Compared to the cohort prior to introduction of the KoS (n=191), a significant decrease in LoT (p<0.001) and DoT (p<0.001) was seen thereafter (n=201). This was due to a significant decrease in LoT (p<0.001) and DoT (p<0.001) in the birth weight category of 1,000-1,499 g; in this weight category, the DoT for carbapenems (p=0.009) and teicoplanin (p=0.040) were significantly lower, which was caused by a significantly rarer occurrence of LOS (p=0.025). In the other two birth weight categories, no significant difference in LoT (p=1,000 for the category of <500 g, p=0.754 for the category of 500-999 g) was seen. In the total cohort, the DoT for carbapenems was not significantly different (p=0.341) after introduction of the KoS; significant differences in ABT were only noted for a higher DoT for cefuroxime (p=0.003) and a lower DoT for ciprofloxacin (p=0.046). 24 After the introduction of the KoS, a significantly lower median birth weight (1,060 g vs. 1,120 g, p=0.046) and a significantly longer in-hospital stay (68 days vs. 61 days, p=0.015) were seen. Apart from the birth weight category of 1,000-1,499 g, there was no significant difference (p=0.948) in LOS prevalence (n=77 vs. n=95). The use of CLs (p=0.079) and peripheral intravenous cannulas [PVK (p=0.209)] and their association with sepsis (CL: p=0.611, PVK: p=0.071) were not significantly different. Microbiologic evaluation of suspected LOS (blood culture and CL tips) was not significantly affected by the KoS (p=0.916): Blood culture was performed in 61,0 % vs. 59,0 % (p=0,916) of episodes, CL diagnostics in 93,5 vs. 94,7 % (p=0,916). In the total study cohort (n=392), MRGN was detected in 91 VLBWI (55 by KoS) with 83/91 (91.2 %) being 2MRGN. There was no case of a LOS caused by MRE previously detected by KoS; two bloodstream infections (BSI) caused by MRGN were not detected by KoS. MRGN-positive VLBWI (n=55, after introduction of the KoS) spent significantly more time in NICU (p=0.002) and IMC (p=0.015) compared to MRGN-negative ones (n=146); birth weight (p=0.147) and gestational age (p=0.197) did not significantly differ between the two groups. The use of CL (p=0.001) and PVK (p=0.001) was significantly higher in MRGN-positive VLBWI, but the LOS prevalence (p=0.067) was not significantly different. LoT (p=0.001) was significantly longer, DoT (p=0.001) significantly higher in MRGN-positive VLBWI; the use of ampicillin/sulbactam (DoT, p=0.002) and gentamicin (DoT, p=0.021) was significantly associated with the detection of MRGN. Median time of detection of MRGN by KoS was 43 days of life (interquartile range 26-86, min. 1, max. 133): the longer the LoT (p=0.020) and the higher the DoT for carbapenems (p=0.023), the later the first detection by KoS. Carbapenems were frequently used in the total study cohort (n=122) with a significant association with lower birth weight (p<0.001), lower gestational age (p<0.001), and more frequent use of CL (p<0.001) and PVK (p<0.001). In contrast, carbapenems were not used significantly more frequently in MRGN-positive VLBWI (p=0.167); their use was also mostly not due to MRGN positivity in the KoS. SOPs for blood culture diagnostics and for ABT of LOS were not available; vancomycin and gentamicin were used without drug monitoring. The total study cohort showed no unusual demographic characteristics - aside from the rareness of necrotizing enterocolitis (n=10; only suspected cases, no surgery required). Conclusions: Neither an increase in the of use of third-line antibiotics, nor a modification of microbiologic diagnostics of suspected LOS (blood culture and CL tips) were seen after introduction of the KoS. Aside from the birth weight category of 1,000-1,499 demonstrating a lower LOS prevalence of unknown cause, changes in the rate of NI did not account for the use of third-line antibiotics in the other categories of birth weight and the total cohort. 25 Since first detection of MRGN by the KoS mainly occurred after the critical phase of intensive care therapy, it did not influence the use of carbapenems. In-hospital stay, LoT, DoT for ampicillin/sulbactam and DoT for gentamicin were identifiable risk factors for MRGN colonization. Carbapenems significantly delayed the first detection of MRGN; this suggests that MRGN are not detected by KoS while Carbapenems – effective against MRGN – are used. Further studies are required to verify that the sensitivity of KoS is reduced by ABT if ABT is effective against the pathogens targeted by KoS. Lack of SOPs and drug monitoring as well as a mismatch between blood culture diagnostics and CL diagnostics were QM-relevant processes. The introduction of an ABS program requires investments in adequate infrastructure (e.g., patient-based electronic prescription of ABTs, SOPs) and human resources (e.g., infectiological audits)

Molekulare Mechanismen der pharmakologischen Resistenz kolorektaler Karzinomzelllinien gegen das Chemotherapieregime FOLFIRI

Metastasierung und Therapieresistenz stellen die wesentlichen Hindernisse bei der kurativen Behandlung des Kolorektalkarzinoms (KRK) dar und sind Hauptursache für die krebsbedingte Sterblichkeit. Bei etwa einem Viertel der KRK-Patient*innen liegen bei Erstdiagnose Fernmetastasen vor, bei ca. der Hälfte der Erkrankten treten im Verlauf Fernmetastasen auf (Kumbrink et al., 2021; Van Cutsem & Oliveira, 2009; Vatandoust et al., 2015). Fluoropyrimidin-basierte Chemotherapieregime sind das Grundgerüst der systemischen KRK-Therapie, welche durch weitere klassische Zytostatika sowie Antikörper-basierte Wirkstoffe erweitert werden kann. Das Kombinationsschema bestehend aus 5-Fluoruracil, Irinotecan und Leucovorin – syn. FOLFIRI – wird bei metastasiertem KRK (mKRK) als Erst- oder Zweitlinientherapie eingesetzt (Leitlinienprogramm Onkologie (Deutsche Krebsgesellschaft, 2019). Trotz der Wirksamkeit dieser Kombinationsbehandlung, durch die die Überlebensrate deutlich verbessert werden konnte, führen intrinsische und erworbene Resistenzmechanismen zur Progression der Krankheit (Jensen et al., 2015; Lyskjær et al., 2019). Um molekularen Mechanismen und Biomarker der FOLFIRI-Resistenz auf Transkriptomebene zu identifizieren, wurden aus den KRK -Zelllinien Colo205, HT29 und SW480 drei FOLFIRI-resistente Subzelllinien durch kontinuierliche Behandlung mit steigenden FOLFIRI-Konzentrationen hergestellt. Als biologische Effekte der FOLFIRI-Resistenz konnten Änderungen in der Genexpression, morphologische Veränderungen sowie Anpassung des Zellzyklus und Zelltod-Resistenz beobachtet werden. Zur Identifikation von resistenz-assoziierten Expressionssignaturen oder potentiell prognostischen Biomarkern wurde eine RNA-Sequenzierung der parentalen sowie der resistenten Zelllinien durchgeführt. Insgesamt 284 differentiell exprimierte Gene (DEGs) wurden nach der bioinformatischen Analyse der RNA-Sequenzierung von 24 Proben ermittelt (Colo205: 222 Gene, HT29: 47 Gene, SW480: 30 Gene). Anschließend wurden diese DEGs miteinander abgeglichen und 12 DEGs identifiziert, die in zwei oder allen drei Zelllinien konsistent dysreguliert waren. Mittels Kaplan-Meier (KM-) Überlebenszeitanalyse des Kolon-Adenokarzinom-Datensatz (COAD) des Krebsgenomatlas (The Cancer Genome Atlas, TCGA, PanCancer Atlas Datenset ) wurden hieraus drei prognostisch relevante Gene (TACSTD2, PERP und CAV2) identifiziert, die sich signifikant mit kürzerem Überleben bei KRK assoziiert zeigten. Diese Ergebnisse wurden mit den Ergebnissen einer klinischen Studie (GSE62322) abgeglichen. In dieser Studie wurden von 21 Chemotherapie-naiven KRK-Patient*innen Tumorproben entnommen, worauf eine postoperative Chemotherapie mit FOLFIRI folgte. Um eine Gensignatur zu identifizieren, die das Ansprechen auf FOLFIRI vorhersagen soll, wurden im nächsten Schritt die Expressionsdaten der auf FOLFIRI ansprechenden Patient*innen mit denen der nicht auf FOLFIRI ansprechenden Patient*innen verglichen. Im Abgleich mit diesen Expressionsdaten konnten die drei Gene TACSTD2, PERP und CAV2 nicht als signifikant dysreguliert bzw. als Teil der Gensignatur nachgewiesen werden. Jedoch konnten die Gene SERPINE2 und TNC aus der Liste aller 284 DEGs in den klinischen Tumorproben ebenfalls als signifikant differentiell exprimiert nachgewiesen werden und mittels KM-Überlebenszeitanalyse als prognostisch relevant eingestuft werden. Diese drei bzw. fünf identifizierten Gene können nun Grundlage für weitere experimentelle Schritte sein, um neue diagnostische und prognostische Biomarker für die klinische Praxis zu etablieren