The Role of MED12 in Adipogenesis

In order for any function to occur within a cell, transcription factors must be able to interact with genes. When this occurs, genes are expressed, and ultimately, proteins are translated and perform the specific function that needs to be done within the cell. In order for this to occur, genes must interact with transcription machinery. The Mediator complex recruits transcription factors to genes in order to promote cell-type specific gene expression. The Mediator complex is a multi-protein complex consisting of four modules: head, middle, tail, and kinase. The kinase module is known to dissociate from the rest of the complex in order to phosphorylate other proteins for the purposes of propagating signals. MED12 of the kinase module has been shown to mediate CDK8 function by binding to Cyclin C, allowing for phosphorylation and propagation of signals. Throughout this thesis, I demonstrate MED12’s role in allowing CDK8 function in promoting cell-type specific gene expression. Through the use of siRNA-mediated knockdowns of MED12, it is evident that MED12 plays a role in the initiation of adipogenesis. qRT-PCR and staining confirm this assumption, as there is significantly less adipogenesis occurring in hASCs when MED12 is knocked down. This is further evidenced by reduced expression of early adipogenic markers, most notably, PPAR-γ. If MED12 initiates cell type-specific gene expression of differentiating adipocytes, then it may be used as a target to direct fat formation to reduce the effects of obesity

Xeno-free extraction, culture, and cryopreservation of human adipose-derived mesenchymal stem cells

Molecules of animal or bacterial origin, which pose a risk for zoonoses or immune rejection, are com-monly used for extraction, culture, and cryopreservation of mesenchymal stem cells. There is no se-quentialandorderlyprotocolforproducinghumanadipose-derivedstemcells(hASCs)underxeno-freeconditions. Afterstandardizinga humanplateletlysate (hPL) productionprotocol,four humanadiposetissue samples were processed through explants with fetal bovine serum (FBS)-supplemented or hPL-supplemented media for extracting the adipose-derived stem cells. The cells were cultivated in cellculture medium + hPL (5%) or FBS (10%). The cellular replication rate, immunophenotype, and differ-entiation potential were evaluated at fourth passage. Cellular viability was evaluated before and aftercryopreservation of the cells, with an hPL-based solution compared with an FBS-based solution. Theexplants cultured in hPL-supplemented media showed earlier and faster hASC proliferation than didthosesupplementedwithFBS.Likewise,cellsgrowninhPL-supplementedmediashowedagreaterpro-liferation rate, without losing the immunophenotype. Osteogenic differentiation of xeno-free hASCwas higher than the hASC produced in standard conditions. However, adipogenic differentiationwas reduced in xeno-free hASC. Finally, the cells cryopreserved in an hPL-based solution showed ahigher cellular viability thanthecells cryopreserved inanFBS-based.In conclusion, we have developeda complete xeno-free protocol for extracting, culturing, and cryopreserving hASCs that can be safelyimplemented in clinical studies

Etablierung einer Transfektionsmethode für humane Kieferperiostzellen

Stammzellen eröffnen der regenerativen Medizin durch ihr großes Differenzierungspotential ungeahnte Möglichkeiten. Die Anwendung von embryonalen Stammzellen wird jedoch kontrovers diskutiert. Patienteneigene, adulte Stammzellen sind ethisch unbedenklich, erzeugen keine immunologischen Reaktionen und sind leicht verfügbar. Aber sie haben ein geringes Differenzierungspotential, können sich also nicht in jede Zellart entwickeln und zeigen ein deutlich niedrigeres Proliferationspotential als beispielsweise embryonale Stammzellen. Die erstmals von Yamanaka und Kollegen im Jahr 2006 generierten induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) vereinen viele positive Aspekte von embryonalen und adulten Stammzellen. Die ersten Methoden zur Gewinnung von iPS-Zellen bargen die Gefahr der Integration von fremdem Erbgut in das Genom der menschlichen Zellen, was eine klinische Anwendung untersagte. Derzeitige integrations- und xenofreie Methoden zur Generierung von iPS-Zellen sind häufig ineffizient und teilweise mit einer hohen Zellsterblichkeit verbunden. Ziel ist es, eine effektive, zellschonende und leicht reproduzierbare Methode zu entwickeln, die frei ist von immunreaktiven Substanzen und xenogenem Material. Auch wenn inzwischen iPS-Zellen schon vereinzelt in klinischen Studien zum Einsatz kamen, müssen noch etliche Hürden in Bezug auf die Generierung, Kultivierung und Langzeitkonservierung überwunden werden. Ziel dieser Arbeit war die Etablierung einer Methode zur Transfektion von humanen Kieferperiostzellen, die in serumfreien MesenCult-Medium gezüchtet wurden. Die Zellen wurden mit Hilfe einer modifizierten, GFP-markierten mRNA transfiziert, was eine quantitative Beurteilung der Transfektionsraten ermöglichte. Die Integration von fremdem Erbgut ins Genom der Zielzelle ist hier ausgeschlossen. Vor der Lagerung in Stickstoff zeigten serumfrei kultivierte Kieferperiostzellen, auch nach Ausschluss von Ausreißern, für alle drei Transfekte nur sehr geringe Transfektionseffizienzen von unter 30 %. Nach Kryokonservierung wurden zum Teil signifikant höhere Transfektionseffizienzen von bis zu 86,6 % mit dem Transfekt Lipofectamine3000 erzielt. Da sich neben der hohen Erfolgsquote, eine vertretbaren Zytotoxizität in der Fluoreszenz-mikroskopie abzeichnete, wurde Lipofectamine3000 für die folgenden Versuche als alleiniges Transfekt verwendet. Die für die MesenCult-Zellen der Zellpassage 5 erreichten Transfektions-effizienzen nach vorheriger Stickstofflagerung konnten bei der Transfektion von Zellen der Zellpassagen 6 nicht reproduziert werden, wie ein weiterer Versuch zeigte. In einem abschließenden Versuch wurde der Einfluss von mehrmaliger Transfektion auf die Transfektionseffizienz untersucht. Das Erfolgsmaximum lag nach 48 Stunden und einmaliger Transfektion bei durchschnittlich 73,6 % GFP-positiver Zellen. Nach zweimaliger Transfektion zeigten sich nach 96 Stunden noch 62,5 % der Zellen positiv. Die geringste Menge an GFP-positiven Zellen (56,8 %) bei gleichzeitig hoher Zellsterblichkeit wurde nach dreimaliger Transfektion detektiert. Die Verwendung von weiter modifizierter mRNA, zusätzlicher microRNA oder gar selbst-replizierender RNA stellt weitere vielversprechende Methoden für eine sichere und effiziente Generierung von iPS-Zellen dar. Die Unterdrückung proinflammatorischer Signalwege mit Hilfe eines Interferon-Inhibitors scheint bei vielen Methoden unumgänglich. Eine sichere und effiziente Methode zur Generierung von iPS-Zellen ermöglicht, neben der Schaffung von individuellen patientenspezifischen Gewebetransplantaten, auch die Verwendung in der Entwicklung von Medikamenten und der Simulation von Krankheitsmodellen.

Expresión exógena de telomerasa humana (hTERT) en células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo humano (A-MSC) como una estrategia para la obtención de líneas celulares

Las células madre mesenquimales (MSCs) son células multipotenciales de tipo adulto localizadas en múltiples tejidos como el adiposo y la médula ósea. Se ha demostrado ampliamente su utilidad en la terapia celular y medicina regenerativa. Una de las alternativas más prometedoras en este campo es el uso de los factores paracrinos secretados por las células madre, conocidos como secretoma, los cuales estimulan la regeneración celular y la angiogénesis y disminuyen la inflamación y otros mecanismos como la apoptosis. Los cultivos primarios de las células mesenquimales se ven marcados principalmente por la limitada esperanza de vida, la variabilidad fenotípica dependiente del donante y de los métodos de obtención y cultivo, el desarrollo de senescencia después de 20 - 30 duplicaciones de la población y cambios en la expresión genética con disminución en la tasa de proliferación a medida que se aumentan los subcultivos, por lo que el secretoma obtenido a partir de estos puede presentar variabilidad e implica obtención constante de muestras y la renovación periódica del cultivo primario. Una estrategia para algunos de estos problemas es la generación de líneas celulares de las MSCs. En este trabajo se generó la expresión exógena de telomerasa humana (hTERT) a partir de una transducción lentiviral como estrategia para prolongar la esperanza de vida celular y establecer líneas celulares de A-MSC, sin embargo se observó que las células no logran inmortalizarse con este proceso y que adicional su ciclo celular se vio afectado por la expresión de hTERT, causando la detención de la proliferación incluso en pases tempranos, se propone entonces la utilización de oncogenes para la inmortalización que permitan la regulación del ciclo celular, para así mitigar el efecto deletéreo de la telomeasa en las células.Abstract: Mesenchymal stem cells (MSCs) are multipotential adult cells located in multiple tissues such as adipose and bone marrow. Its utility in cell therapy and regenerative medicine has been widely demonstrated. One of the most promising alternatives in this field is the use of paracrine factors secreted by stem cells, known as secretome, which stimulate cell regeneration, angiogenesis and decrease inflammation and other mechanisms of the body such as apoptosis. Primary cultures of mesenchymal cells are delimited mainly by limited lifespan, donor-dependent phenotype variability, development of senescence after 20-30 population doublings and changes in gene expression with decrease in the rate of proliferation as the subcultures are increased, so that the secretoma obtained can present variability and involve constant collection of samples and periodic renewal of the primary culture. An used strategy for solve these troubles is the generation of cell lines of A-MSCs. In this research an exogenous expression of human telomerase (hTERT) was generated from a lentiviral transduction as a strategy to prolong the cellular lifespan and establish cell lines, however it is seem that wasn’t possible to immortalize the cells with this process and that additional its cell cycle is affected by the expression of hTERT, causing the stop of proliferation even in early passages, then the use of oncogenes for immortalization is proposed, which allows regulation of the cell cycle, in order to mitigate the deleterious effect of telomerase in this cells.Maestrí

Human multipotent mesenchymal stromal cells - bone differentiation and hematopoietic support

Lidské mezenchymové stromální buňky (hMSC) jsou dospělé kmenové či progenitorové buňky, jejichž fyziologickou úlohou je napomáhat reparaci poškozených tkání. To se děje především sekrecí trofických, angiopoetických a imunomodulačních faktorů. Kromě toho mají hMSC potenciál diferencovat se in vitro do různých specializovaných buněčných typů, převážně mezodermové linie. Lidské MSC rovněž významně podporují krvetvorbu v rámci hematopoetické niche. Tyto poznatky vzbudily velké naděje na terapeutické využití hMSC, zejména v oblasti regenerativní medicíny a léčby autoimunních onemocnění, včetně reakce štěpu proti hostiteli (GvHD). Jako důkaz správnosti tohoto konceptu posloužily zpočátku hrubé preparáty mononukleárních buněk kostní dřeně (BMMC), které malá množství hMSC buněk obsahují. Na našem pracovišti byly provedeny pilotní klinické studie s BMMC v léčbě akutního infarktu myokardu (předčasně ukončená neúspěšná studie) a v léčbě ischemické choroby dolních končetin (studie se slibnými výsledky). Další výzkum probíhal s cílem optimalizace metodiku kultivace hMSC pro klinické užití, tedy dosažení co největších výtěžků a zbavení postupu xenogenních bílkovin. Lidské MSC byly totiž klasicky kultivovány v research grade médiích (např. alfa-MEM) s fetálním telecím sérem (FCS), které může vést k imunizaci...Human mesenchymal stromal cells (hMSC) are adult stem or progenitor cells, which physiological role is reparation of damaged tissues. This is achieved mostly by secretion of trophic, angiopoietic and immunomodulatory factors. Beside this, hMSC have potential to differentiate in vitro into specialized cells, especially of the mesodermal lineages. Human MSC also significantly support hematopoiesis in hematopoietic niche. This knowledge raised high hopes for therapeutic use of hMSC, especially in regenerative medicine and treatment of autoimmune diseases, including graft versus host disease (GvHD). As a proof of concept served initially crude preparations of bone marrow mononuclear cells (BMMC), which contain small numbers of hMSC. In our hospital, two pilot clinical studies with BMMC were performed: study of treatment of acute myocardial infarction (negative, prematurely terminated) and study of treatment of peripheral leg arthery disease (promising results). Further research was aimed on optimalisation of hMSC cultivation method for clinical use to obtain highest possible yield and get free from animal proteins. Human MSC were traditionally cultivated in research-grade media with fetal calf serum (FCS), which can lead to immunization of patients after repeated application of hMSC. We achieved...1st Department of Medicine - Clinical Department of Haematology First Faculty of MedicineI. interní klinika-klinika hematologie 1. LF UK a VFNFirst Faculty of Medicine1. lékařská fakult