Chromatinfaktoren und Mechanismen der Interleukin-1-abhängigen Genregulation

Das Zytokin Interleukin (IL)-1 ist ein wichtiger Botenstoff des angeborenen Immunsystems und kann das komplette Spektrum der klinischen Symptome lokaler und systemischer Entzündungsreaktionen auslösen. Auf zellulärer Ebene reprogrammiert IL-1 über ein Netz an Signalkaskaden die inflammatorische Genexpression im Zellkern. Im Vergleich zu den zytoplasmatischen Signalwegen ist die nukleäre Signalvermittlung allerdings weniger gut verstanden. Neben der Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-kB werden weitere Transkriptionsfaktoren, wie z.B. AP-1 Proteine, und Ko-Regulatoren aktiviert und an IL-1-induzierte Zielgene, z.B. an die Loci von Chemokingenen rekrutiert, sodass offenbar eine kooperative Regulation der Genexpression stattfindet. Im Verlauf dieser Arbeit wurde die Rolle von NF-kB p65 an IL-1-induzierten Promotoren und regulatorischen Enhancern näher charakterisiert. Mittels einer Kombination aus knockdown Ansätzen, ChIP-PCR und CHIP-seq Experimenten konnte p65 lokal und genomweit eine Funktion als Masterregulator zugeordnet werden. Hierbei fördert p65 nicht nur die H3K27 Acetylierung an bereits vormarkierten Enhancern, wodurch diese weiter aktiviert werden, sondern es ist auch für alle nachfolgenden IL-1-regulierten Bindungsereignisse an Promotoren und Enhancern essentiell. Diese Funktionen von p65 erfordern die katalytische Aktivierung der apikalen zytoplasmatischen Proteinkinasen TAK1 und IKK2 und lassen sich durch niedermolekulare Inhibitoren dieser Enzyme blockieren. Des Weiteren wurden durch einen gezielten RNAi-Screen sechzehn neue nukleäre Ko-Regulatoren des IL-1 Signalwegs identifiziert. Dabei zeigten nur die Histonacetyltransferase Ep300 und der Transkriptionsregulator Sin3a eine IL-1-abhängige Rekrutierung an die prototypischen IL-1 Zielgene IL8 und CXCL2. Sin3a stellt eine bisher unbekannte Komponente im nukleären IL-1 Signalweg dar. Dieses Protein besitzt selbst kein bekanntes DNA-Bindemotiv oder enzymatische Aktivität und wurde bisher vor allem als Gerüstprotein von Ko-Repressor-Komplexen charakterisiert. Die hier erhobenen Locus-spezifischen ChIP-PCRs und genomweiten ChIP-seq Daten zeigten dagegen, dass Sin3a vor allem mit der Ser5-phosphorylierten Form von RNA Polymerase II an transkribierte Gene ko-rekrutiert wird. Die Chromatinassoziation von Sin3a an IL-1-abhängige NF-kB Zielgene in humanen Epithelzellen und murinen embryonalen Fibroblasten ist ebenfalls durch den TAK1/IKK2/p65 Signalweg reguliert. Funktionelle Daten wiesen Sin3a eine gen- und zelltypspezifische Rolle als eine Art shaping factor zu, der die Transkription von Chemokinen modulieren kann. Die Befunde sind vereinbar mit der Formierung eines Stimulus-abhängigen und Sin3a-assoziierten RNA-Pol II Komplexes, dessen Funktion es sein könnte, eine überschießende Expression inflammatorischer mRNAs zu verhindern oder eine De-Regulation des basalen Expressionsniveaus zu kontrollieren. Diese Mechanismen und die dabei beteiligten Faktoren bieten neue Ansatzpunkte, um die molekulare Regulation von Chemokinen oder weiteren IL-1 Zielgenen auf Chromatinebene besser zu verstehen. Da eine Dysregulation der Transkription von IL-1- und NF-kB p65-abhängigen Genen zu schweren chronischen Entzündungen und Autoimmunerkrankungen führen kann, tragen diese Erkenntnisse nicht nur zu einem verfeinerten Verständnis der komplexen entzündlichen Genregulation im Zellkern bei, sondern helfen auch, neue Zielstrukturen für zukünftige Therapiemöglichkeiten zu definieren

Molekulare Determinanten des Melanomwachstums, der Invasion und der Metastasierung: Eine Analyse basierend auf RNA-Fingerprinting und cDNA-Arrays

Ein essentieller Mangel im klinischen Management des malignen Melanoms, einem Tumor der Haut, ist das Fehlen verlässlicher molekularer Marker für die Diagnostik und Prognostik. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war daher die Erstellung einer expressionsgenetischen Studie am malignen Melanom um a) einen Überblick über das Ausmaß der Veränderungen der Genexpression während der Melanomprogression zu erhalten und b) differentiell regulierte Gene zu identifizieren, die als molekulare Marker die diagnostisch-prognostische Abgrenzung unterschiedlich progressiver Phänotypen des Melanoms erleichtern und so eine effizientere Therapieplanung ermöglichen sollen. Für diese Studie wurden in erster Linie drei humane Zellkulturmodelle ausgewählt, deren Zellinien hinsichtlich variierender Tumorigenität, Invasivität und Metastasierungspotenz selektiert wurden. Expressionsgenetische Veränderungen wurden zunächst mittels der RNA arbitrarily primed PCR erfasst, später wurde die aufstrebende cDNA-Array-Technologie hinzugezogen. Bei beiden Methoden ergaben die Daten übereinstimmend, dass in den untersuchten Progressionsmodellen etwa 2 der erfassten Gene Expressionsunterschiede aufwiesen, die sich im Rahmen der Selektion zunehmend aggressiver Phänotypen ereignet haben. Mithilfe der RAP-PCR wurden dabei u.a. 22 neue, zu diesem Zeitpunkt unbekannte Sequenzen entdeckt. In den Mikroarray-Experimenten wurden weitere 41 differentiell exprimierte cDNAs gefunden. Aus dieser Sammlung potentieller Progressionsmarker wurden sechs Transkripte, die wahrscheinlich bei der Tumorentwicklung eine essentielle Rolle spielen, in Northern Blot Experimenten überprüft und bestätigt. Bei vier dieser Gene wurde in dieser Arbeit erstmals eine Überexpression im Melanom nachgewiesen. Die Ergebnisse dieser Studie eröffnen somit neue vielversprechende Ansätze in der Melanomforschung und leisten darüber hinaus einen wichtigen Beitrag zur Entwicklung eines Diagnostik- und Prognostikarrays für das Melanom

Evaluation eines retroviralen Transfektionssystems zur Hemmung der Telomerase mittels DN-hTERT in Neuroblastomzellen

Die Telomerase spielt eine Schlüsselrolle bei der Proliferation, bei Alterungsprozessen und der Krebsentstehung. Die klinische Anwendung der Telomeraseforschung zur Diagnose, Prognose und Therapieplanung verspricht insbesondere für das Neuroblastom eine Verbesserung der Behandlungsoptionen. Deshalb wurde in dieser Studie ein Transfektionssystem an Neuroblastomzelllinien entwickelt und evaluiert, welches eine Telomeraseinhibition mittels retroviralen Gentransfers einer dominant-negativen Mutante von hTERT bezweckt. Trotz erfolgreicher Genübertragung war in den verschiedenen Zelllinien nur eine inkonstante Expression von WT-hTERT und DN-hTERT nachweisbar. Dementsprechend fehlten funktionelle Konsequenzen einer Telomeraseinhibition wie Telomerenverkürzung, verändertes Wachstumsverhalten und Zelltod. Für eine effektive Telomerasehemmung bieten sich also in nachfolgenden Arbeiten alternative Vektorsysteme an, um neue Erkenntnisse über die Telomerenbiologie des Neuroblastoms zu gewinnen

Molekulare Mechanismen der pharmakologischen Resistenz kolorektaler Karzinomzelllinien gegen das Chemotherapieregime FOLFIRI

Metastasierung und Therapieresistenz stellen die wesentlichen Hindernisse bei der kurativen Behandlung des Kolorektalkarzinoms (KRK) dar und sind Hauptursache für die krebsbedingte Sterblichkeit. Bei etwa einem Viertel der KRK-Patient*innen liegen bei Erstdiagnose Fernmetastasen vor, bei ca. der Hälfte der Erkrankten treten im Verlauf Fernmetastasen auf (Kumbrink et al., 2021; Van Cutsem & Oliveira, 2009; Vatandoust et al., 2015). Fluoropyrimidin-basierte Chemotherapieregime sind das Grundgerüst der systemischen KRK-Therapie, welche durch weitere klassische Zytostatika sowie Antikörper-basierte Wirkstoffe erweitert werden kann. Das Kombinationsschema bestehend aus 5-Fluoruracil, Irinotecan und Leucovorin – syn. FOLFIRI – wird bei metastasiertem KRK (mKRK) als Erst- oder Zweitlinientherapie eingesetzt (Leitlinienprogramm Onkologie (Deutsche Krebsgesellschaft, 2019). Trotz der Wirksamkeit dieser Kombinationsbehandlung, durch die die Überlebensrate deutlich verbessert werden konnte, führen intrinsische und erworbene Resistenzmechanismen zur Progression der Krankheit (Jensen et al., 2015; Lyskjær et al., 2019). Um molekularen Mechanismen und Biomarker der FOLFIRI-Resistenz auf Transkriptomebene zu identifizieren, wurden aus den KRK -Zelllinien Colo205, HT29 und SW480 drei FOLFIRI-resistente Subzelllinien durch kontinuierliche Behandlung mit steigenden FOLFIRI-Konzentrationen hergestellt. Als biologische Effekte der FOLFIRI-Resistenz konnten Änderungen in der Genexpression, morphologische Veränderungen sowie Anpassung des Zellzyklus und Zelltod-Resistenz beobachtet werden. Zur Identifikation von resistenz-assoziierten Expressionssignaturen oder potentiell prognostischen Biomarkern wurde eine RNA-Sequenzierung der parentalen sowie der resistenten Zelllinien durchgeführt. Insgesamt 284 differentiell exprimierte Gene (DEGs) wurden nach der bioinformatischen Analyse der RNA-Sequenzierung von 24 Proben ermittelt (Colo205: 222 Gene, HT29: 47 Gene, SW480: 30 Gene). Anschließend wurden diese DEGs miteinander abgeglichen und 12 DEGs identifiziert, die in zwei oder allen drei Zelllinien konsistent dysreguliert waren. Mittels Kaplan-Meier (KM-) Überlebenszeitanalyse des Kolon-Adenokarzinom-Datensatz (COAD) des Krebsgenomatlas (The Cancer Genome Atlas, TCGA, PanCancer Atlas Datenset ) wurden hieraus drei prognostisch relevante Gene (TACSTD2, PERP und CAV2) identifiziert, die sich signifikant mit kürzerem Überleben bei KRK assoziiert zeigten. Diese Ergebnisse wurden mit den Ergebnissen einer klinischen Studie (GSE62322) abgeglichen. In dieser Studie wurden von 21 Chemotherapie-naiven KRK-Patient*innen Tumorproben entnommen, worauf eine postoperative Chemotherapie mit FOLFIRI folgte. Um eine Gensignatur zu identifizieren, die das Ansprechen auf FOLFIRI vorhersagen soll, wurden im nächsten Schritt die Expressionsdaten der auf FOLFIRI ansprechenden Patient*innen mit denen der nicht auf FOLFIRI ansprechenden Patient*innen verglichen. Im Abgleich mit diesen Expressionsdaten konnten die drei Gene TACSTD2, PERP und CAV2 nicht als signifikant dysreguliert bzw. als Teil der Gensignatur nachgewiesen werden. Jedoch konnten die Gene SERPINE2 und TNC aus der Liste aller 284 DEGs in den klinischen Tumorproben ebenfalls als signifikant differentiell exprimiert nachgewiesen werden und mittels KM-Überlebenszeitanalyse als prognostisch relevant eingestuft werden. Diese drei bzw. fünf identifizierten Gene können nun Grundlage für weitere experimentelle Schritte sein, um neue diagnostische und prognostische Biomarker für die klinische Praxis zu etablieren

Next-Generation-Sequencing –is the detection of tumor-specific SNPs key for understanding the pathobiology of gastric cancer?

Next Generation Sequencing (NGS) ist eine Methode, die mittlerweile einen hohen Stellenwert bei der Suche tumorspezifischer SNPs erlangt hat. In dieser Studie werden NGS-gestützte, tumorspezifische Mutationsfunde beim Magenkarzinom mittels konventioneller Sequenziertechnik validiert. Darüber hinaus findet eine Validierung auf posttranslationeller und posttranskriptioneller Ebene statt.Next generation sequencing (NGS) is a method which has reached great importance at identifying tumor-specific SNPs. In this study, NGS-detected mutations in gastric cancer are validated using conventional sequencing techniques. Further, posttranslational und posttranscriotional Aspects are being validated