L’inhibition des cytochromes P450 dans les cas d’insuffisance rénale chronique : rôle de l’hormone parathyroïdienne

L’insuffisance rénale chronique (IRC) est associée à une réduction du métabolisme de plusieurs médicaments, due à une diminution du cytochrome P450 (CYP450) hépatique. Nos études précédentes ont montré que l’IRC affecte l’activité in vivo et in vitro, de même que l’expression protéique et génique des différents isoformes du CYP450, via la présence du sérum urémique et de l’hormone parathyroïdienne (PTH). Ce projet de doctorat se divise en quatre parties. Premièrement, nous avons développé une méthode d’analyse de l’activité du CYP450, à l’aide de la production du 3-hydroxy-5,5-dimethyl-4-[4-(methylsulfonyl)phenyl] furan-2(5H)-one (DFH) à partir du 3-[(3,4-difluorobenzyl)oxy]-5,5-dimethyl-4-[4-methylsulfonyl)phenyl] furan-2(5H)-one (DFB). Cette méthode nous a permis de mieux quantifier l’activité dans les études subséquentes. Deuxièmement, l’activité du CYP450 3A est diminuée chez les patients atteints d’IRC. De plus, il a déjà été démontré que des toxines urémiques dialysables seraient impliquées puisque l’hémodialyse prévient cette inhibition du CYP450. Par contre, le mécanisme expliquant l’amélioration transitoire la composition du sérum de patients atteints d’IRC par l’hémodialyse n’est pas connu. L’objectif du projet est d’évaluer l’effet de l’hémodialyse sur l’expression protéique et génique, de même que sur l’activité du CYP450 3A2 dans un modèle d’hépatocytes de rat en culture. Troisièmement, la déficience en calcidiol est fréquente dans les cas d’IRC et l’étiologie est peu connue. Nous avons récemment montré que l’IRC est associée à une diminution du métabolisme des médicaments par le foie suite à une réduction des différents isoformes du CYP450 en partie médiée par l’hormone parathyroïdienne (PTH). La 25-hydroxylation de la vitamine D, au niveau du foie, permet la formation du calcidiol par différents isoformes du CYP450 (CYP2C11, 27A1, 2R1, 3A2 et 2J3) et pourrait être ainsi altérée en présence d’IRC. Les objectifs de cette étude sont de a) confirmer la diminution de synthèse de calcidiol en présence d’IRC et b) évaluer le rôle de la PTH dans la déficience en calcidiol. Finalement, afin de mieux comprendre les inhibitions du CYP450, nous avons étudié les voies de signalisation impliquées dans la régulation du CYP450 en présence d’IRC et avec la PTH puisque les mécanismes d’action demeurent imprécis. La contribution des facteurs de transcription et des récepteurs nucléaires suivants est étudiée ; le récepteur pregnane X (PXR), le récepteur constitutif androstane (CAR) et le facteur nucléaire kappa B (NF-κB), puisqu’ils sont potentiellement activés par le récepteur de la PTH et ces molécules ont été précédemment impliqués dans la régulation du CYP450. Les résultats obtenus montrent que l’hémodialyse des patients atteints d’IRC améliore transitoirement l’expression du CYP450 lorsque des hépatocytes sont mis en culture avec du sérum provenant de ces patients. Aussi, la 25-hydroxylation de la vitamine D est affectée par l’IRC. Les voies de signalisation du NF-κB et les facteurs nucléaires PXR et CAR sont impliqués dans l’inhibition du CYP450. En conclusion, l’IRC affecte, non seulement le métabolisme des médicaments mais aussi l’hydroxylation de la vitamine D, un des rôles endogènes effectués par le CYP450. Ces études nous permettent de mieux comprendre les effets de l’IRC afin de mieux cibler les traitements de choix pour les patients qui en sont atteints.Chronic renal failure (CRF) is associated with a decrease in drug metabolism, due to a down-regulation of hepatic cytochrome P450 (CYP450). Previous studies indicated that CRF modifies activity, protein and mRNA expression of different CYP450 isoforms in vivo and in vitro via circulating mediators and parathyroid hormone (PTH). This PhD project is divided in four parts. First, we have developed an assay in order to measure the CYP3A’s activity, using the production of 3-[(3,4-difluorobenzyl)oxy]-5,5-dimethyl-4-[4-methylsulfonyl)phenyl] furan-2(5H)-one (DFB). This method will be used in the next studies. Secondly, CYP450 activity and expression are decreased in patients with end-stage renal disease (ESRD). It has been shown that dialyzable uremic toxins could be implicated in these decreases. Recent studies indicated that hemodialysis can prevent the inhibition of P450 although the mechanism remains to be defined. The aim of this study was to evaluate the effect of hemodialysis on P450 expression and activity using a rat hepatocytes culture model. Thirdly, calcidiol insufficiency is highly prevalent in CRF and the pathophysiology of this phenomenon is poorly understood. Recently, we have demonstrated that CRF is associated with a decrease in hepatic drug metabolism due to a reduction in liver CYP450, which is in part mediated by PTH. The formation of calcidiol, through hepatic 25-hydroxylation, is also mediated by several CYP450 isoforms (CYP2C11, 27A1, 2R1, 3A2 and 2J3) and could thus be altered in CRF. The objectives of the present study in rats presenting a CRF were a) to confirm the role of CRF on calcidiol levels and b) to evaluate the role of PTH in calcidiol apparent deficiency. Finally, in order to understand all the CYP450 inhibitions, we evaluated the mechanisms of action of CYP450. CRF and PTH cause an inhibition of CYP450 although the mechanisms remain to be defined. The aim of this study was to evaluate the contribution of different nuclear receptors or transcription factors like; pregnane X receptor (PXR), constitutive androstane receptor (CAR) and nuclear factor kappa B (NF-κB). The results obtained show that the hemodialysis of CRF patients improves the CYP450’s expression in the cultured hepatocytes, with the serum from these patients. Also, the vitamin D 25-hydroxylation is affected by CRF. The activation of NF-κB and nuclear factors PXR and CAR are implicated in the CYP450’s inhibition. In conclusion, CRF affects not only drug metabolism but also vitamin D hydroxylation, one of the endogenous roles performed by CYP450. This study will enable us to understand the effect of CRFon CYP450 regulation in order to improve the treatment of CRF patients

Phase I and II enzyme induction and inhibition by secoisolariciresinol diglucoside and it's aglycone

The flaxseed lignan, secoisolariciresinol diglucoside (SDG), and its aglycone, secoisolariciresinol (SECO), have demonstrated benefits in the treatment and/or prevention of cancer, diabetes and cardiovascular disease. In order for the lignans to be used therapeutically, the safety of administration alone and in conjunction with other drugs must be determined. The primary cause of drug interactions is induction and inhibition of cytochrome P450 (CYP) and phase II enzymes. A preliminary screen was conducted to assess the potential for SECO and SDG to cause CYP inhibition. A method was established to assess for CYP, glutathione-S-transferase (GST) and uridine diphosphate-glucuronosyltransferase (UGT) induction in rat primary hepatocytes by real-time reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR).Preliminary assessments of inhibition measured the metabolism of testosterone to 6β-, 16α- and 2α-hydroxytestosterone, which corresponds to CYP3A, 2B/2C11 and 2C11 enzyme activity in rat hepatic microsomes by a validated high performance liquid chromatography (HPLC) method. Irreversible inhibition studies found that SDG is not an inhibitor of these isoforms up to 1000 μM. Secoisolariciresinol caused reversible inhibition of 6β-hydroxytestosterone at all testosterone concentrations, with an IC50 (inhibitor concentration causing 50% inhibition of enzyme) between 400 and 800 μM. Over the range of SECO concentrations tested, 10 – 1600 μM, 6β-hydroxytestosterone formation was reduced to 95 – 29% of control levels at 50 μM testosterone.Secoisolariciresinol caused a concentration-dependent increase in 16α-hydroxytestosterone formation at 50 μM testosterone. At 10 μM SECO, there was 90% of control activity, but at 1600 μM metabolite formation was 172% of control. The formation of 2α-hydroxytestosterone was not affected at any testosterone or inhibitor concentration. Thus, SECO appears to be a CYP3A inhibitor and a CYP2B activator at testosterone KM levels. The mechanism of reversible inhibition could not be determined due to the possibility of non-Michaelis-Menten kinetics observed with CYP3A inhibition and CYP2B activation. The gold standard in vitro model to assess induction is primary hepatocytes. A method was established that allowed for the isolation and culture of these cells. Positive controls caused induction of CYP mRNA levels after 24 hours treatment, demonstrating the ability of enzyme induction in the test system. Primers for real-time RT-PCR were designed that amplified CYP1A1, 1A2, 2B1, 2C11, 2C13, 2D1, 2D2, 3A1 and 3A2, GSTA2, A5 and P1, and UGT1A1, 1A7, 1A8, 2B1 and 2B12 genes. A preliminary assessment of transcriptional upregulation of drug metabolizing enzymes by SECO and SDG can be assessed in isolated and cultured rat primary hepatocytes

Investigating the chemical space and metabolic bioactivation of natural products and cross-reactivity of chemical inhibitors in CYP450 phenotyping

Includes bibliographical references.Natural products have been exploited by humans as the most consistently reliable source of medicines for hundreds of years. Owing to the great diversity in chemical scaffolds they encompass, these compounds provide an almost limitless starting point for the discovery and development of novel semi-synthetic or wholly synthetic drugs. In Africa, and many other parts of the world, natural products in the form of herbal remedies are still used as primary therapeutic interventions by populations far removed from conventional healthcare facilities. However, unlike conventional drugs that typically undergo extensive safety studies during development, traditional remedies are often not subjected to similar evaluation and could therefore harbour unforeseen risks alongside their established efficacy. A comparison of the ‘drug-like properties’ of 335 natural products from medicinal plants reported in the African Herbal Pharmacopoeia with those of 608 compounds from the British Pharmacopoeia 2009 was performed using in silico tools. The data obtained showed that the natural products differed significantly from conventional drugs with regard to molecular weight, rotatable bonds and H-bond donor distributions but not with regard to lipophilicity (cLogP) and H-bond acceptor distributions. In general, the natural products were found to exhibit a higher degree of deviation from Lipinski’s ‘Rule-of-Five’. Additionally, these compounds possessed a slightly greater number of structural alerts per molecule compared to conventional drugs, suggesting a higher likelihood of undergoing metabolic bioactivation

Rôle de l'hormone parathyroïdienne dans l'inhibition du cytochrome P450 hépatique chez le rat souffrant d'insuffisance rénale chronique

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal

Study on herb-drug interactions

Herbal medicines, such as St John's wort, garlic, gingko, and ginseng, are commonly used complementary therapies. The human CYP enzymes are a superfamily which consists of at least 57 functional CYP genes. Among them, CYP1A2, 2C9, 2C19, 2D6 and 3A4/5 are the most important enzymes responsible for the Phase I metabolism of therapeutic drugs. When different compounds (e.g., a drug and herbal compound) are co-administered, they may compete at the same active site of CYPs, resulting in potential inhibition. We hypothesize that the atom-atom interactions between the ligands and the residues at the active site of CYPs determine the substrate and inhibitor specificity of individual CYPs. To test our hypothesis, we conducted a series of experiments including in vitro assays to determine inhibitory actions of a variety of natural compounds on human CYPs, pharmacokinetic-based predication of in vivo situation using the in vitro data; and in silico studies to explore the ligand-CYP interactions using docking and pharmacophore modeling methods. We first determined the inhibitory effects (IC50) of 56 herbal compounds on activities of five human drug metabolising CYPs (CYP1A2, 2C9, 2C19, 2D6 and 3A4) in vitro using a high throughput approach. The tested herbal components included a variety of structurally distinct compounds such as triterpenoids of danshen (Salvia miltiorrhiza), flavonoids and their glycoside derivatives, saponine, other glucosides, lactones, alkaloids, and acids. A small number of them are found to significantly inhibit human CYP1A2, 2C9, 2C19, 2D6 and 3A4 with differential potency, including tanshinone I, tanshinone IIA, cryptotanshinone, baicalein, quercetin, silybin, osthole and ч-schisandrin. Based on the in vitro data obtained, we predicted metabolic herb-drug interactions of these compounds in vivo with the application of appropriate pharmacokinetic principles. Some predicting results were consistent with published clinical reports. For example, the prediction of S. miltiorrhiza increasing the AUC value of warfarin is consistent with the results from clinical case reports. However, a marked disparity has been observed when some predictions are compared with results from clinical studies. For example, the prediction of S. mariani (containing silybin) increasing the AUC of indinavir (a CYP3A4 substrate) is not in agreement with the result of a clinical report where the plasma concentration of indinavir was not altered by co-administered silymarin in healthy volunteers. Finally, we studied the interactions of a series of ligands including substrates and inhibitors with CYP1A2 using docking and pharmacophore modeling approaches. We have identified 6 residues at the active site of CYP1A2 which are essential for ligand recognition. Furthermore, the relative potency of potential inhibitors could be predicted through analysis of hydrophobic interactions between the ligand and the 6 essential residues at the active site of CYP1A2. Moreover, we developed a pharmacophore model on the basis of the common features of known CYP1A2 inhibitors. In combination with the docking results, the established pharmacophore model could be applied for screening novel CYP1A2 inhibitors

Les protéines de blé d'hiver : nouveaux agents cryoprotecteurs pour les hépatocytes de rat

Plusieurs domaines de recherche, tels que la toxicologie, la pharmacologie, la recherche et développement de nouveaux médicaments et la médecine, exige l'utilisation d'une grande quantité d'hépatocytes. Les hépatocytes de rats sont un modèle physiologique important pour étudier in vitro les composés au niveau de leur hépatotoxicité, l'induction des enzymes du métabolisme telles que les isoformes du cytochrome P450 et leurs interactions médicamenteuses, ainsi que pour établir la pertinence du modèle par rapport à l'homme. La cryoconservation permet de préserver une grande quantité d'hépatocytes fonctionnels. Cependant, les hépatocytes sont des cellules extrêmement sensibles aux dommages induits par le gel et le dégel, même après l'addition des cryoprotectants classiques tel que le DMSO. La cryoconservation réduit la viabilité et certaines fonctions hépatospécifiques. Le changement le plus prononcé est la diminution de leur efficacité d'attachement. L'adhésion des cellules à la matrice extracellulaire et les contacts cellules-cellules sont cruciaux pour plusieurs fonctions cellulaires. Ces processus sont en partie régulés par les molécules d'adhésion cellulaire. Les mécanismes responsables de la réduction de l'efficacité d'attachement des hépatocytes cryoconservés ne sont pas bien élucidés. Ainsi, l'amélioration des techniques de cryoconservation est nécessaire afin d'améliorer les fonctions et de réduire les dommages cellulaires. Dans cette thèse, nous décrivons une nouvelle méthode efficace pour la cryoconservation de cellules de mammifères basée sur l'utilisation d'un extrait de protéines de blé (WPE) ou d'un extrait partiellement purifié avec le sulfate d'ammonium ou l'acétone (SuIWPE ou AcWPE) ou de protéines recombinantes associées à la tolérance au gel chez le blé. Ces méthodes permettent l'entreposage à long terme et la récupération d'une grande quantité de cellules viables et dont les fonctions sont maintenues. Pour tester l'efficacité de cette nouvelle méthode, nous avons mesuré plusieurs paramètres, tels que la viabilité immédiatement après dégel, la viabilité en culture, l'efficacité d'adhésion et l'évaluation des fonctions hépatospécifiques (sécrétion d'albumine, biotransformation de l'ammonium en urée, activité basale et inductibilité du cytochrome P450). En culture, la morphologie des hépatocytes cryoconservés avec l'extrait de protéines de blé (WPE), l'extrait partiellement purifié (SuIWPE ou AcWPE) et les protéines recombinantes associées à la tolérance au gel chez le blé (WCS120, WSC19, WCOR410, TaTIL et TaIRl-2), est semblable à celle des cellules fraîches. De plus, la stabilité des trois principales molécules d'adhésion, soit l'intégrine β1, la E-cadhérine et la β-caténine fut étudiée. L'expression des molécules d'adhésion est généralement inférieure chez les hépatocytes cryoconservés avec le diméthylsulfoxyde (DMSO), comparativement au WPE. L'intégrine β1 et la β-caténine sont les plus touchées par la cryoconservation. Les molécules d'adhésion sont préservées chez les hépatocytes cryoconservés avec les SuIWPE, AcWPE ou les protéines recombinantes; l'expression étant faiblement diminuée comparativement aux hépatocytes frais. Par le fait même, l'adhérence cellulaire des cellules cryopréservées avec les SuIWPE, AcWPE ou les protéines recombinantes est supérieure (70%) à celle des cellules cryopréservées avec le WPE ou le DMSO (50%).\ud Les fonctions hépatospécifiques telles que la sécrétion d'albumine et la biotransformation de l'ammonium en urée sont maintenues durant 4 jours de culture, pour les cellules cryoconservées aves les WPEs. Nous avons également déterminé que les WPE, SuIWPE, AcWPE ou les protéines recombinantes peuvent améliorer les activités des principaux isoformes du cytochrome P450, chez les hépatocytes en suspension et en culture après cryoconservation. Ceci a été réalisé en comparant les activités basales et inductibles des isoformes CYP1A1/2, 2C6, 2D2 et 3A1/2 dans les hépatocytes de rat cryoconservés avec les WPE, SulWPE, AcWPE ou les protéines recombinantes comparativement aux cellules fraîches et les cellules cryoconservées au DMSO. Nous démontrons d'une manière concluante que les hépatocytes de rat cryoconservés avec les WPE, SuIWPE, AcWPE ou les protéines recombinantes maintiennent le même niveau de compétence métabolique et de capacité à répondre aux inducteurs classiques du CYP, que les hépatocytes fraîchement isolés. Ces résultats démontrent clairement que le WPE, et plus particulièrement, les SuIWPE, AcWPE et les protéines recombinantes, sont plus efficaces que la technique classique de cryoconservation au DMSO pour les hépatocytes de rat, tant pour le maintien de l'expression des molécules d'adhésion que pour leurs fonctions hépatospécifiques. Les extraits WPE, SuIWPE, AcWPE et protéines recombinantes contiennent des agents cryoprotecteurs potentiellement universels pour les cellules de mammifères, tout en étant économiques et non-toxiques. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Foie, Hépatocytes, Cryoconservation, Protéines de blé, Viabilité, Activité métabolique, Cyrochrome p450, Molécules d'adhésion

Coumarin and Its Derivatives

Coumarins are widely distributed in nature and can be found in a large number of naturally occurring and synthetic bioactive molecules. The unique and versatile oxygen-containing heterocyclic structure makes them a privileged scaffold in Medicinal Chemistry. Many coumarin derivatives have been extracted from natural sources, designed, synthetized, and evaluated on different pharmacological targets. In addition, coumarin-based ion receptors, fluorescent probes, and biological stains are growing quickly and have extensive applications to monitor timely enzyme activity, complex biological events, as well as accurate pharmacological and pharmacokinetic properties in living cells. The extraction, synthesis, and biological evaluation of coumarins have become extremely attractive and rapidly developing topics. A large number of research and review papers have compiled information on this important family of compounds in 2020. Research articles, reviews, communications, and concept papers focused on the multidisciplinary profile of coumarins, highlighting natural sources, most recent synthetic pathways, along with the main biological applications and theoretical studies, were the main focus of this book. The huge and growing range of applications of coumarins described in this book is a demonstration of the potential of this family of compounds in Organic Chemistry, Medicinal Chemistry, and different sciences related to the study of natural products. This book includes 23 articles: 17 original papers and six review papers