Molecular dynamics studies on the NMR and X-ray structures of rabbit prion protein wild-type and mutants

Prion diseases are invariably fatal and highly infectious neurodegenerative diseases that affect a wide variety of mammalian species such as sheep, goats, mice, humans, chimpanzees, hamsters, cattle, elks, deer, minks, cats, chicken, pigs, turtles, etc. These neurodegenerative diseases are caused by the conversion from a soluble normal cellular protein into insoluble abnormally folded infectious prions and the conversion is believed to involve conformational change from a predominantly alpha-helical protein to one rich in beta-sheet structure. Such conformational changes may be amenable to study by molecular dynamics (MD) techniques. For rabbits, classical studies show they have a low susceptibility to be infected, but in 2012 it was reported that rabbit prion can be generated (though not directly) and the rabbit prion is infectious and transmissible (Proceedings of the National Academy of Sciences USA 109(13): 5080-5). This paper studies the NMR and X-ray molecular structures of rabbit prion protein wild-type and mutants by MD techniques, in order to understand the specific mechanism of rabbit prion protein and rabbit prions.Comment: (The 2nd version of arXiv1304.7633

Investigation Of The Misfolding Pathway Of Different Prion Variants Via Molecular Dynamics Simulations

Tez (Yüksek Lisans) -- İstanbul Teknik Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, 2015Thesis (M.Sc.) -- İstanbul Technical University, Institute of Science and Technology, 2015Bulaşıcı süngerimsi ensefalopatiler (TSE) ölümcül nörodejeneratif hastalıklardır. İnsanda; Creutzfeldt Jakob hastalığı (CJD), Fatal Familial İnsomnia (FFI), hayvanlarda; Bovine Spongiform Encephalopathy (BSE), skrapi, Transmissible Mink Encephalopathy (TME) gibi hastalıklara prion adı verilen bir proteinin yanlış katlanması neden olur.  Creutzfeldt Jakob Disease (CJD): Tedavi edilmeyen ölümcül bir hastalıktır. Kendini bunama, hafıza kaybı, halüsinasyonlar ve anksiyete ile gösterir. Deli dana olarak bilinen Bovine Spongiform Encephalopathy’nin insanlardaki formudur.  Fatal Familial Insomnia (FFI): Dünyada 40 ailede bulunan bir hastalıktır. Hastalar uyuyamama, hızlı kilo kaybının yanı sıra halüsinasyon ve bunama gösterir, hastayı ölüme doğru götürür.  Gerstmann- Straussler-Scheinker sendromu çok az görülen bir hastalıktır. Konuşma zorluğu, cerebellar ataksi ve bunama gibi semptomları vardır.  Bovine Spongiform Encephalopathy (BSE): İneklerde gözüken ve CJD’nin oluşumuna neden olan formdur. İlerleyici semptomlar öncelikle davranışsal olarak sonra nörolojik olarak kendini gösterir. En önemli semptomlardan biri ışığa, dokunmaya ve sese karşı duyarlılığın ve tepkinin artması ile ataksi meydana gelir. Enfekte hayvanlar hastalığın son aşamasında ayakta duramaz hale gelirler.  Transmissible Mink Encephalopahty (TME): Faralerde görülen formudur.  Önceklikle şaşkınlık, temizlik alışkanlığının kaybedilmesi, amaçsızca etrafında dönme gibi davranışsal değişiklikler gözlemlenir. Sürekli uyuklama durumu, ağırlaşma hali ve tepkisizlik hasatlığın son safhasında dikkat çeker.  Skrapi: Koyun ve keçilerde görülen paraliz ve ölümle sonuçlanan TSE formudur. Hastalığın başlangıcında aşırı telaş, sinirlilik, agresiv hareketler, sese karşı aşırı hassasiyet görülür. Kaşınma, tüy dökülmesi, uyuşukluk, düşünme ve davranışlarda belirgin yavaşlama hali,hipermetri gibi klinik bulguları en son aşamada ayağa kalkamama, pareliz, genel kas titremeleri takip eder. En yaygın TSE’lerden biri Skrapi’dir.  Skrapi ilk olarak İngiltere’de rapor edilmiş ve sonrasında Fransa, Almanya Polonya ve Avrupa’nın genelinde görülmüş sonra bütün dünyaya yayılmıştır. 2014’ün ikinci yarısında alınan raporlara göre Avrupa’da yaygın olarak bulunmaktadır.  Hastalığın ilk evrelerinde davranışsal bozukluklar gözlemlenir. Klinik bulgular hastalığın son safhasında kendini gösterdiği için hastalığın tanısı geç olmaktadır.  TSE’ler hayvanlardan insanlara geçebildiği için toplum sağlığını tehdit etmekte, hayvancılığı ise ekonomik olarak etkilemektedir. Bulaşma çevredeki uzun yıllar yaşayan etkenin alınması ile, yeme içme ile, anneden yavrusuna plasenta ile alınabilir. Bu hastalıkları oluşturan infeksiyöz etken bakteri ya da virus değildir. Normalde hücre yüzeyinde bulunan bir proteinin yanlış katlanması ile oluşmaktadır. Yaklaşık 250 kalıntıdan oluşan bu protein PRNP adı verilen bir gen tarafından kodlanmaktadır. İlk 22 kalıntı sinyal sekansını içermektedir. Bunu şekilsiz, glisin bakımından zengin olan, Cu2+ bağlayan  N-ucu takip etmektedir. C-ucu 121-231 rezidülerini içerir. Bu bölge düzenlidir; üç sarmal ve iki β-ipliğinden oluşmaktadır. Doğru katlanmış protein (PrPc) α-sarmal bakımından zengindir. Düzenli kısmı % 45 oranında sarmal,  %3-8 β-yaprağı yapısındadır. Yanlış katlanma sonucu oluşan proteinin (PrPSc) α-sarmal içeriği azalır ve çoğunlukla β-yapraklarından (neredeyse %50 oranında) oluşur. PrPc’nin PrPSc ile karşılaşması yanlış katlanmayı katalize eder. Böylece hastalık ilerler ve hastalıklı bir canlının proteininin diğer canlıya geçmesi ile hastalık bulaşır. PrPSc’ler oligomerler ya da fibriller oluşturabilirler. Oluşan bu fibriller doku ve organlarda ölüm sonrası görülen plakları oluşturur. Beyinde ise süngerimsi boşluklu yapıların oluşmasına neden olduğu için ismi ‘süngerimsi’ olarak adlandırılmaktadır. Literatür hastalık yapan bölgenin neresi olduğuna dair tartışmalıdır. Bir kısım araştırmacılar hastalığı C terminustaki yanlış katlanmadan dolayı meydana geldiğini kabul etse de N terminustaki rezidülerin yanlış katlanmasıyla oluştuğunu düşünenler de vardır. Yanlış katlanmış yapı ve buna giden yollar bilinmemektedir.  Ağırlıklı olarak kabul gören kısım C terminustaki sarmal 2 (H2) ve sarmal 3’ün (H3) yanlış katlanarak β-yaprağı oluşturmasıdır. Birden fazla yanlış katlanmış yapı ve buna giden farklı yolların olması da mümkündür.  Ancak yine de tam olarak yanlış katlanmış üç boyutlu yapı bilinmemekte ve bu konu araştırmaya ihtiyaç duymaktadır. Bu çalışmada moleküler dinamik simulasyonları ile bu yanlış katlanmaya giden yolların aydınlatılmasına katkıda bulunulacaktır. En yaygın TSE türlerinden biri olan skrapide 136, 154 ve 171. rezidülerin hastalık oluşumunda önemli olduğu bulunmaktadır. Bu çalışmada üç varyant ele alınmıştır. Bunlardan biri düşük dirençli olduğu bilinen yabanıl tiptir (ARQ: A136, R154, Q171). Diğer ikisi, en dirençsiz mutant (VRQ: V136, R154, Q171) ve en dirençli mutanttır (ARR: A136, R154, R171). Bu üç varyant birbirinden 136. ve 171. konumdaki rezidüler ile ayrılmaktadır. Simulasyonlar Amber ff10 kuvvet alanı ve generalized Born sürekli ortam çözücü yöntemi ile 310 ve 330 K sıcaklıklarda gerçekleştrildi. Simulasyon süreleri 400 - 700 ns’dir.  310 K’deki her üç simulasyonda da proteinin hareketli bölgeleri (terminaller hariç) şunlardır: 1) Sarmal 1 ve sarmal 1 ile β-ipliği 1 arasındaki döngü (kalıntı 135-149); 2) β-iplik 2 ile α-sarmal 2 arasındaki döngü (168-177); 3) α-sarmal 2’nin C ucu ve sarmal 2 ile 3 arasındaki döngüdür (186-204). 168-177 numaralı rezidülerinin arasındaki bölgenin hareketi her üç varyantta da benzerdir. Diğer iki bölgedeki hareketliliklerin miktarı ve yönü her üç varyantta farklı bulunmuştur. En dirençli olan ARR, diğer yapılardan daha durağandır. En dirençsiz olan VRQ’da hareketlilik en yüksektir. Dolayısıyla hareketlilik ile direnç arasında bağıntı görülmektedir. Bu varyantta özellikle sarmal 1 sarmal 3’e göre konumunu büyük oranda değiştirmektedir. Diğer iki varyantta ise kristaldeki konumundan çok uzak olmayan bir yerde kalmaktadır. Dolayısıyla sarmal 1’in hareketi 136.  konumdaki valinden kaynaklandığı gözükmektedir. Diğer iki varyantta burada alanin (A) yer almaktadır. Konformasyon değişimlerini hızlandırmak için 330 K’de yapılan ek simulasyonlarda tüm varyantlarda heliks 1’in konumunu değiştirdiği görülmüştür. VRQ’da buna ek olarak kristalde görülen beta yaprağı da bozulmuştur. Bu sonuçlar sarmal 1’in açılmasının ardından sarmal 2 ve 3’ün β-yaprağına dönüşeceğini öngören ‘Banana peeling’ modeli ile uyumludur.Transmissible Spongiform Encephalopathies(TSE) are fatal neurodegenerative diseases. Examples are: bovine spongiform encephalopathy (BSE) in cow, scrapie in sheep and Creutzfeldt Jakob disease (CJD) in humans. A misfolded version of a protein named prion causes these diseases. Properly folded protein(PrPC) is rich of α-helix. The misfolded protein (PrPSc) contains less α-helix and is mostly comprised of β-sheets. Encounter of PrPC and PrPSc catalyzes the misfolding and disease propagation. The disease is transferred between individuals via transfer of these proteins. PrPSc can create oligomers or fibrils. The N-terminus of this protein is disordered and it is believed that it binds Cu2+. The ordered part at the C-terminus is comprised of 3 α-helices and 2 β-strands in the correctly folded state. In the literature, the part of the protein which causes the disease is controversial. Also, the misfolded shape and misfoling pathways are unknown. The predominantly accepted idea is that helices 2 and 3 (H2 and H3) at the C-terminus create a β-sheet by misfolding. Existance of more than one misfolded shape and pathway is also possible. However, the 3-dimensional PrPSc shape is still unknown and there is a need for researches on this subject. This study will contribute to enlighting of these misfolding pathways by using molecular dynamic simulations. One of the most common form of TSE is scrapie. For scrapie development, the 136th, 154th and 171st residues are important. This study focuses on 3 variants. First of these variants is weakly resistant wild type (ARQ: A136, R154, Q171), the second one is the most susceptible mutant (VRQ: V136, R154, Q171) and the other one is the most resistant mutant (ARR: A136, R154, R171). Simulations have been made with generalized Born continuum solvation method and Amber ff10 force field at 310 and 330 Kelvin. Simulation durations are 400-700ns. Fluctuated regions (except termini) of the proteins in all 3 simulations at 310K are: 1) H1 and the loop between H1 and β-strand 1(residues 135-149); 2) the loop between β-strand 2 and H2 (residues 168-177); 3) C-terminus of H2 and the loop between H2 and H3 (residues 186-204). Movement of the region between 168-177 is similiar in all 3 variants. In the other two regions, the magnitude and direction of the movements are found to be different in all 3 variants. ARR which is the most resistant variant has the lowest mobility. VRQ, the most susceptible variant, is the most mobile variant in the simulations. Therefore, it is seen that there is a relation between susceptibility and mobility. Especially, in VRQ, H1 is relocated with respect to H3.  Position of H1 in the other two variants (ARR, ARQ) is not too far from crystal structures. Hence it is seen that valine as the 136th residue has an effect regarding the reposition of H1. The other two variants have alanine instead of valine as the 136th residue. In order to accelerate the conformational changes, simulations have been performed at 330 K and H1 has changed its position in all these simulations, including ARR and ARQ. In addition, VRQ has deformed its β-sheet in the 330 K simulations. These results are compatible with the ‘banana peeling model’ which suggests that relocation of H1 is necessary for the conversion of H2 and H3 to β-sheet.Yüksek LisansM.Sc

Two Misfolding Routes for the Prion Protein around pH 4.5

Using molecular dynamics simulations, we show that the prion protein (PrP) exhibits a dual behavior, with two possible transition routes, upon protonation of H187 around pH 4.5, which mimics specific conditions encountered in endosomes. Our results suggest a picture in which the protonated imidazole ring of H187 experiences an electrostatic repulsion with the nearby guanidinium group of R136, to which the system responds by pushing either H187 or R136 sidechains away from their native cavities. The regions to which H187 and R136 are linked, namely the C-terminal part of H2 and the loop connecting S1 to H1, respectively, are affected in a different manner depending on which pathway is taken. Specific in vivo or in vitro conditions, such as the presence of molecular chaperones or a particular experimental setup, may favor one transition pathway over the other, which can result in very different PrPSc monomers. This has some possible connections with the observation of various fibril morphologies and the outcome of prion strains. In addition, the finding that the interaction of H187 with R136 is a weak point in mammalian PrP is supported by the absence of the {H187, R136g} residue pair in non-mammalian species that are known to be resistant to prion diseases

Systematic mutagenesis of the mouse prion protein to identify critical regions for the efficient propagation of prions

The aim of this study was to systematically investigate the contributions of various amino acids within the prion protein, on prion propagation. To test this in a cellular system, we used a sub-cloned population of N2a cells (PK1) that are highly susceptible to RML mouse prions. A library of stable PK1 cells was generated, which expressed the full length mouse prion protein (moPrP) bearing either point, double, or triple alanine replacements. The effects these changes in the prion protein sequence had on the ability of PK1 cells to propagate RML was tested using a previously established cell based assay. We found that: (i) in the unstructured region of the protein, alanine replacements in CC2 region 90-111 of the prion protein severely diminish, but do not abrogate the ability of cells to propagate prions whilst substitutions K23A.K24A.R25A and Q41A exerted a moderate inhibitory effect on propagation; (ii) alanine replacements in CC2 displayed a dominant negative effect by imposing their propagation inhibition phenotype in the presence of the wild-type protein; (iii) the diminished propagation abilities of cells expressing CC2 alanine mutants were a result of these cells being less susceptible to infection than their wild-type counterparts (iv) all alanine replacements tested in the structured region of the protein appeared to hamper prion propagation, regardless of their positioning within this globular domain. Taken together, these results suggest that integrity of the structured region is vital for successful prion propagation, and that although the flexible region of the prion protein alone (residues 23-111), does not exclusively confer infectivity and/or propagative capacity, charge interactions in this region govern the efficacy with which propagation ensues