Recréer et comprendre les mécanismes de liaison des biomolécules à l'aide d'un modèle d'ADN

La reconnaissance moléculaire joue un rôle central dans tous les processus biologiques ainsi que dans le développement de nouvelles biotechnologies. Depuis les 60 dernières années, deux mécanismes de reconnaissance moléculaire ont permis de décrire le couplage entre la liaison et le changement conformationnel observé chez les biomolécules. Le mécanisme par ajustement induit a lieu lorsque le ligand se lie à l'état inactif de la biomolécule et induit un changement de conformation vers la forme active. Le mécanisme par sélection conformationnelle, quant à lui, a lieu lorsque le ligand se lie directement à l'état spontanément actif de plus faible population et le stabilise, déplaçant ainsi la population de biomolécule vers cet état. Bien que nous connaissons des exemples de protéines qui fonctionnent selon chacun de ces mécanismes, nous ne comprenons pas encore les différences entre les performances de ces mécanismes ni les déterminants moléculaires qui leur donnent lieu. Une compréhension approfondie de ces mécanismes nous permettrait de mieux comprendre pourquoi certaines protéines ont évolué selon un mécanisme en particulier ainsi que de s'inspirer de ces mécanismes pour le développement de biotechnologies finement régulées. Jusqu'à aujourd'hui, ces deux mécanismes ont exclusivement été étudiés dans le contexte des biomolécules naturelles, principalement des protéines, dont la complexité dynamique et structurale rend difficile la comparaison et la manipulation individuelle des différents paramètres thermodynamiques. Il est donc particulièrement ardu de caractériser le rôle de chacun de ces paramètres quant à la sélection et la performance de ces mécanismes. Pour contourner ces limitations expérimentales, nos travaux de recherche se sont intéressés à recréer ces mécanismes à l'aide d'interrupteurs d'ADN fluorescents pour lesquels il est possible de prédire et de modifier la structure et les propriétés thermodynamiques ainsi que d'en mesurer l'activation en temps réel. Ce faisant, il a été possible d'observer que le mécanisme par ajustement induit est obtenu lorsque le site de liaison est partiellement accessible dans l'état inactif. Nous avons aussi observé que ce mécanisme permet une activation et une désactivation jusqu'à 10 000 fois plus rapide que la sélection conformationnelle, qui par contraste, donne lieu à une activation plus lente ainsi qu'à un maintien prolongé de l'activation. Ces différences cinétiques suggèrent ainsi un rôle évolutif distinct pour chacun et laissent envisager des applications en biotechnologies pour l'optimisation de la cinétique.Molecular recognition plays a central role in almost every biological and biotechnological process. Over the last 60 years, two molecular recognition mechanisms have been used to appropriately describe the coupling between binding and conformational change in biomolecules. The induced fit mechanism takes place when ligand binding to the inactive state of the biomolecule induces the conformational change leading to the active state. On the other hand, in the conformational selection mechanism, where active and inactive states exist in equilibrium, the ligand binds selectively to the active state of the biomolecule and shifts the equilibrium towards this state by stabilizing it. Even though these mechanisms have been widely studied, it is still unclear if they differ in performance or how each mechanism can be modulated. Such a fundamental understanding of the differences between these mechanisms would shed light on the reasons for an apparent selective pressure driving the use of a specific mechanism for a given biomolecule and would also allow us to engineer new biomolecules which would benefit from the strengths of these mechanisms. To date, both mechanisms have been exclusively studied in the context of naturally occurring biomolecules, mainly proteins, whose structural and dynamic complexity as well as diversity seem to prevent comparison and manipulation of specific and individual thermodynamic parameters. Consequently, only little progress has been made towards characterizing the role of certain key thermodynamic parameters on the selection and performance of the mechanism. To circumvent this limitation, we have reproduced these mechanisms using simple fluorescent DNA constructs allowing for reliable prediction and variation of both structure and thermodynamics as well as real time monitoring of the activation process in presence of a DNA target. These DNA "switches" allowed us to determine that an induced fit mechanism occurs when the binding site is partially available in the inactive state and that this mechanism allows for a faster activation and deactivation (up to four orders of magnitude) compared to a conformational selection mechanism, which in contrast corresponds to a slower activation and deactivation, leading to a longer activation period. The observed kinetic differences between these mechanisms points towards potential uses for both in different areas of biotechnology as well as some rationale behind evolution favoring one mechanism over the other for a given protein

La méthode "SCAM" pour déterminer la topologie de l'enclave de liaison du récepteur AT1

La méthode SCAM (substituded-cysteine accessibility method) a été utilisée pour identifier les acides aminés (a.a.) du VIIe domaine transmembranaire du récepteur AT[indice inférieur 1] formant l'enclave de liaison de l'AngII. Les résidus 286 à 295 ont été substitués un à la fois pour des cystéines (Cys) par mutagenèse dirigée. Les récepteurs AT[indice inférieur 1] (natif ou mutants) furent exprimés dans des cellules COS-7. Des études de liaison ont permis de déterminer que tous les mutants possédaient une affinité pour le [indice supérieur 125]I[Sar [indice supérieur 1] , Ile [indice supérieur 8 ]]AngII et un taux d'expression similaires [i.e. similaire] à ceux du récepteur AT[indice inférieur 1] natif (K[indice inférieur d] = 0.9 nM, B [indice inférieur max] = 1.1 pmol/mg) sauf le mutant I288C qui est exprimé à 0.2 pmol/mg. Pour déterminer la présence d'un a.a. dans l'enclave, les récepteurs natif [i.e. natifs] ou mutants ont été exposés aux méthanethiosulfonates (MTSEA, MTSET, MTSES, MTSBn)."--Résumé abrégé par UM

Synthèse et évaluation pharmacologique d'une nouvelle famille de transporteurs riches en guanidiniums

Vectoriser les médicaments, c’est-à-dire les associer à un vecteur pour les amener là où ils doivent agir, présente un intérêt majeur. En effet, si la dose administrée va sélectivement à la cible, elle peut être diminuée : cela présente un intérêt économique et réduit les chances d’effets secondaires des suites d’une action ailleurs que là où elle est souhaitée. Pour les cibles intracellulaires, les peptides perméants sont prometteurs en raison de leur production aisée, de leur faible toxicité et de leur efficacité pour entrer dans les cellules. Cependant, leur sélectivité a été peu étudiée et leur internalisation est encore mal comprise et maîtrisée, ce qui limite l’efficacité de leurs applications. Ce projet visait à générer des analogues de peptides perméants cationiques pour étudier leur internalisation dans la cellule. Un autre objectif était de voir si une contrainte stérique pouvait créer une discrimination entre types cellulaires et générer des pistes pour un trans- port sélectif. Enfin, le dernier objectif était de créer des composés ayant de bons profils pharmacologiques. La thèse est divisée en trois parties entrecoupées de transitions : A. A partir de designs semi-rationnels, une série de composés analogues de peptides perméants cationiques a été produite. Ces résultats, publiés dans un premier article, ont permis de valider les méthodes de synthèse, le profil de toxicité et le mécanisme primaire d’internalisation des composés, ainsi que d’identifier le composé le plus efficace de la série. B. Par la suite, l’approche synthétique a été optimisée et plusieurs analogues structu- raux de la première série ont été produits. D’autres lignées cellulaires ont aussi été testées, dans le but d’observer une sélectivité dans l’internalisation. Ces résultats ainsi qu’une étude de la stabilité plasmatique de ces composés, bien que préliminaires, sont présentés. C. Enfin, d’autres structures de molécules relativement différentes ont été conceptua- lisées. Les synthèses finalisées ou les plus avancées sont présentées dans la dernière partie du document et incluent notamment des composés visant à évaluer l’évasion endosomale

Reconnaissance de surfaces protéiques par des foldamères d'oligoamides aromatiques

Protein-protein interactions are a central issue in biological processes and represent relevant therapeutic targets for the treatment of diseases. The design of antagonistic molecules directed towards the disruption of these interactions requires the specific recognition of protein surfaces. Quinoline oligoamide foldamers present all the properties to reach that point. They are easily synthesized and fold into helices (similar to α helices) which can be decorated. Thanks to biophysical studies (CD, SPR, RX diffraction), we demonstrate that these molecules are able to recognize protein surfaces. Two proteins have been studied: the human interleukin 4 and the human carbonic anhydrase II.The applied strategy (keeping the foldamer close to the protein surface via a linker) allowed us to gather structural information about foldamer protein interactions before any strong binding is established. The first crystal structure between a protein and an aromatic amide foldamer is reported.Les interactions protéine - protéine sont au centre de nombreux processus biologiques, et représentent des cibles thérapeutiques pertinentes pour le traitement de certaines maladies. La conception de molécules antagonistes visant à inhiber ces interactions requiert la reconnaissance spécifique d’une des surfaces protéiques impliquées. Les foldamères de type oligoamides de quinoline constituent de bons candidats. Leur production et leur fonctionnalisation sont relativement aisées. Ils adoptent des structures hélicoïdales semblables à celles rencontrées dans les protéines. Grâce à différentes techniques biophysiques (CD, SPR, diffraction des rayons X), nous montrons que ces molécules sont aptes à reconnaître une surface protéique. Deux protéines cibles ont été choisies : l’interleukine 4 et l’anhydrase carbonique humaine II.La stratégie retenue dans ce travail (ancrage du foldamère à la protéine via un bras espaceur) nous a permis d’obtenir des informations structurales sur les interactions foldamère – protéine avant toute optimisation de ces interactions. La première structure 3D d’un complexe foldamère de quinoline complexée à une protéine est décrite

Caractérisation moléculaire du récepteur à l'angiotensine II de type 1 par mutagenèse dirigée

Le clonage du récepteur à l'angiotensine II (AngII) de type 1, au début des années 1990, nous donnait l'opportunité de caractériser les déterminants moléculaires impliqués dans la liaison de cette hormone ainsi que les mécanismes de désensibilisation. À l'aide de la mutagenèse dirigée, il nous a été possible de modifier la Tyr[indice supérieur 302] du motif NPXnY reconnu comme responsable de l'internalisation des récepteurs de facteurs de croissance. Nous avons remplacé cette Tyr de la séquence NPLFY du récepteur hAT[indice inférieur 1] pour Ala ou Phe et évalué les nouvelles propriétés biochimiques et pharmacologiques de ces récepteurs. Les récepteurs mutants ont été exprimés dans les cellules COS-7. Leur niveau d'expression et leur affinité étaient comparables à ceux du récepteur de type sauvage. Nous avons marqué spécifiquement ces récepteurs à l'aide de l'analogue photosensible [indice supérieur 125]I-AngII/N[indice inférieur 3]. L'analyse des complexes covalents par SDS-PAGE a révélé que le récepteur de type sauvage et les récepteurs mutants se comportaient comme des glycoprotéines de masse moléculaire apparente élevée. Les récepteurs mutants étaient capables d'internaliser l'AngII, mais ne produisaient pas de réponse biologique (production d'InsP[indice inférieur 3]) comparativement au récepteur de type sauvage. Avec cette même approche de mutagenèse, nous avons modifié l'environnement basique de la région N-terminale de la troisième boucle intracellulaire du récepteur hAT[indice inférieur 1]. Les acides aminés Ala[indice supérieur 221] et Leu[indice supérieur 222] ont été remplacés respectivement par Glu/Gln et Arg/Gln. Les récepteurs mutants furent exprimés à différents niveaux dans les cellules COS-7 ou CHO, mais possédaient tous une forte affinité pour le [Sar[indice supérieur 1],Ile[indice supérieur 8]] AngII. Par contre, le mutant AT[indice inférieur 1]Arg[indice supérieur 222] possédait une plus faible affinité pour l'AngII comparativement au récepteur de type sauvage et au récepteur mutant AT[indice inférieur 1]Glu[indice supérieur 221]. Cette perte d'affinité du récepteur AT[indice inférieur 1]Arg[indice supérieur 222] était due à l'absence de couplage avec sa protéine G comme en témoignait son insensibilité au GTP[gamma]S et son incapacité à produire de l'InsP[indice inférieur 3] en réponse à l'AngII. Finalement, pour déterminer certains points de contact de l'AngII sur le récepteur AT[indice inférieur 1], nous avons développé deux analogues photosensibles et ce en substituant les positions 1 et 8 de l'AngII par un résidu p-benzoyl-phenyalanine (Bpa). Les deux analogues AngII-Bpa[indice supérieur 1] et AngII-Bpa[indice supérieur 8] reconnaissaient le récepteur hAT[indice inférieur 1] exprimés dans les cellules COS-7 avec une forte affinité. Suite à différentes digestions enzymatiques et chimiques des complexes covalents, nous avons déterminé la taille des fragments et retracé leurs positions dans le récepteur. Nos résultats montrent que les positions 1 et 8 de l'AngII interagissent respectivement avec la deuxième boucle extracellulaire (résidus 174-199) et le septième domaine transmembranaire (résidus 228-357). L'ensemble de ces résultats montre que la Tyr[indice supérieur 302] du motif NPXnY n'est pas essentiel pour l'internalisation du récepteur hAT[indice inférieur 1] induit par l'AngII. Par contre cette tyrosine semble jouer un rôle important dans le mécanisme de transduction du signal tout comme la Leu[indice supérieur 222]. Enfin, nous avons démontré que des domaines extracellulaires et transmembranaires du récepteur hAT[indice inférieur 1] participent dans la liaison de l'Ang II

Synthèse d’agonistes sélectifs du récepteur opioïde delta. Évaluation de leur profils pharmacologiques pour le traitement de la douleur

La douleur est un phénomène touchant tout en chacun, et son traitement relève une importance sociétale considérable. La plupart des traitements existants sont associés à de nombreux effets secondaires nocifs. Ainsi, cet ouvrage relate le développement, la synthèse et l’évaluation biologique de nouveaux composés peptidiques et peptidomimétiques visant sélectivement le récepteur opioïdergique Delta pour le traitement de la douleur chronique. Les ligands opioïdes endogènes, dont ces composés sont dérivés, bien qu’efficaces, possèdent de mauvais profils pharmacocinétiques. Afin de remédier à ce problème, plusieurs modifications ont été effectuées sur le squelette de la Leu-enképhaline. Ce travail est issu d’une collaboration entre le laboratoire du professeur Yves Dory pour la partie chimie et le laboratoire du professeur Louis Gendron pour la patie pharmacologie. Outre l’amélioration des propriétés pharmacocinétiques, l’amélioration de la sélectivité pour le récepteur DOPr et la compréhension des mécanismes régissant la reconnaissance moléculaire des ligands DOPr ont été des objectifs explorés lors de cette recherche. Dans un premier temps, une introduction générale portant sur la douleur, les mécanismes la régissant, son traitement en clinique, les récepteurs opioïdes, et les pistes de recherches à l’étude, est présentée. Le premier chapitre porte sur le remplacement des fonctions à chaque extrémité de la chaîne principale de la Leu-enképhaline par des fonctions isostères, et l’influence de celles-ci sur les propriétés biologiques. Le deuxième chapitre s’attache à l’influence de l’introduction de substituants sur le cycle aromatique du résidu Phe4 de la Leu-enképhaline. Le troisième chapitre s’intéresse au remplacement du pont disulfure de peptides cycliques dérivés de la Leu-Enképhaline, sélectifs au récepteur DOPr, par un pont triazole. Finalement, le chapitre 4 explore de nouvelles modifications en position 2 et décrit le développement de radiotraceurs peptidiques pour l’étude des mécanismes de la douleur associés à la Leu-enképhaline

Études d'ingénierie du ribozyme VS de Neurospora

Les ribozymes sont des ARN catalytiques fréquemment exploités pour le développement d’outils biochimiques et d’agents thérapeutiques. Ils sont particulièrement intéressants pour effectuer l’inactivation de gènes, en permettant la dégradation d’ARNm ou d’ARN viraux associés à des maladies. Les ribozymes les plus utilisés en ce moment pour le développement d’agents thérapeutiques sont les ribozymes hammerhead et hairpin, qui permettent la reconnaissance spécifique d’ARN simple brin par la formation de structures secondaires stables. In vivo, la majorité des ARN adoptent des structures secondaires et tertiaires complexes et les régions simples brins sont parfois difficiles d’accès. Il serait intéressant de pouvoir cibler des ARN repliés et un motif d’ARN intéressant à cibler est la tige-boucle d’ARN qui peut être importante dans le repliement global des ARN et pour accomplir des fonctions biologiques. Le ribozyme VS de Neurospora fait la reconnaissance de son substrat replié en tigeboucle de façon spécifique par une interaction kissing-loop, mais il n’a jamais été exploité pour faire la reconnaissance d’un ARN cible très différent de son substrat naturel. Le but des travaux présentés dans cette thèse est de déterminer si le ribozyme VS possède l’adaptabilité nécessaire pour l’ingénierie de ribozymes qui clivent des ARN cibles différents du substrat naturel. Dans le cadre de cette thèse, le ribozyme VS a été modifié pour l’adapter à différents substrats et des études de cinétiques ont été réalisées pour évaluer l’impact de ces modifications sur l’activité de clivage du ribozyme. Dans un premier temps, le ribozyme a été modifié pour faire la reconnaissance et le clivage de substrats possédant différentes longueurs de tiges Ib. Le ribozyme a été adapté avec succès à ces substrats de différentes longueurs de tige Ib, avec une activité qui est similaire à celle du ribozyme avec un substrat sans modification. Dans un deuxième temps, c’est l’interaction kissing-loop I/V du ribozyme qui a été substituée de façon rationnelle, dans le but de savoir si un ribozyme VS mutant peut reconnaitre et cliver un substrat ayant une boucle différente de celle de son substrat naturel. L’interaction kissing-loop I/V a été substituée pour les interactions kissing-loop TAR/TAR* de l’ARN du VIH-1 et L22/L88 de l’ARN 23S de Deinococcus radiodurans. La réaction de iii clivage des ribozymes comportant ces nouvelles interactions kissing-loop est toujours observée, mais avec une activité diminuée. Finalement, la sélection in vitro (SELEX) de ribozymes a été effectuée pour permettre un clivage plus efficace d’un substrat mutant avec une nouvelle boucle. Le SELEX a permis la sélection d’un ribozyme qui clive un substrat avec une boucle terminale mutée pour celle de l’ARN TAR du VIH-1 et cela avec une activité de clivage très efficace. L’ensemble de ces études démontre que le ribozyme VS peut être modifié de diverses façons pour la reconnaissance spécifique de différents substrats, tout en conservant une bonne activité de clivage. Ces résultats montrent le grand potentiel d’ingénierie du ribozyme VS et sont prometteurs pour la poursuite d’études d’ingénierie du ribozyme VS, en vue du clivage d’ARN cibles repliés en tige-boucle complètement différents du substrat naturel du ribozyme VS.Ribozymes are catalytic RNAs frequently exploited for the development of biochemistry tools and therapeutic agents. They are particularly interesting in gene inactivation strategies for the degradation of mRNA and viral RNA genome. Currently, the most common ribozymes used in the development of therapeutic agents are the hammerhead and hairpin ribozymes, which can specifically recognize and cleave target single-stranded RNAs through the formation of stable secondary structures. In vivo, single-stranded RNAs can be difficult to target because most RNA adopt complex secondary and tertiary structures. It could be worthwhile to target folded RNA motifs, and an interesting target is the stem-loop structure because stem-loops are important for the overall folding of RNA molecules and they can perform important biological functions. The Neurospora VS ribozyme recognizes its stem-loop folded substrate via a specific kissing-loop interaction, but it has never been exploited for the recognition of target RNA very different from its natural substrate. The goal of the work presented in this thesis is to determine whether the VS ribozyme possesses the necessary adaptability for engineering ribozymes that target RNAs different from its natural substrate. For this thesis, the VS ribozyme was adapted for the recognition of different substrates and kinetic studies were performed to evaluate the effect of these modifications on the cleavage activity. In a first study, the VS ribozyme was modified to recognize and cleave substrates with different stem Ib lengths. The VS ribozyme was successfully adapted to theses substrates of different lengths with a cleavage activity similar to the unmodified ribozyme and substrate. In a second study, the I/V kissing-loop interaction was substituted by rational design, in order to establish if the VS ribozyme variants could recognize and cleave a substrate with a different loop than its natural substrate. The I/V kissing-loop interaction was substituted for the HIV-1 TAR/TAR* and the Deinococcus radiodurans RNA large rRNA subunit L22/L88 kissing-loop interactions. The cleavage reaction was observed for the ribozymes with these new interactions, but with reduced activity. Finally, in vitro selection (SELEX) was used to enable more efficient cleavage of a mutant substrate with a new loop. SELEX experiments enabled v the selection of ribozyme variants that cleave a substrate with a terminal loop mutated to that of the HIV-1 TAR RNA with a very efficient cleavage activity. All of the studies presented in this thesis show that the VS ribozyme can be modified in various ways for the specific recognition of different substrates, while maintaining efficient cleavage activity. These results demonstrate the great potential of VS ribozyme engineering and are very promising for further engineering studies of VS-derived ribozymes for the cleavage of stem-loop folded target RNA completely different from its natural VS ribozyme substrate

Développement de stratégies d’immobilisation du facteur de croissance endothélial vasculaire : contrôle de l’activité biologique pour le génie tissulaire

Un effort majeur de recherche est aujourd’hui porté sur le développement de nouvelles stratégies à base de matériaux synthétiques pour réparer ou remplacer des tissus endommagés, notamment pour le traitement des maladies cardiovasculaires – première cause de mortalité à l’échelle mondiale. Le défi majeur dans ce domaine est l’établissement d’un réseau vasculaire fonctionnel pour alimenter les cellules en oxygène et nutriments et éliminer les déchets métaboliques, condition sine qua non d’un tissu viable. Le réseau vasculaire chez l’Homme naît en effet d’un processus hautement complexe et finement régulé, et est sans cesse remodelé : sa conception in vitro en est d’autant plus ardue. Parmi les nombreux effecteurs biologiques responsables de l’angiogenèse, le facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF) apparaît comme un acteur primordial. Il est en effet le principal médiateur du comportement des cellules endothéliales – ces dernières étant au coeur du développement primaire des vaisseaux et assurant le rôle critique d’interface entre le tissu et le sang. Des études de longue haleine menées sur l’angiogenèse ont ainsi mis en évidence l’ubiquité de VEGF dans ces processus, une présence incontournable mais surtout contrôlée, en termes de concentration, de présentation et même de forme. Afin de permettre au génie tissulaire de progresser, une hypothèse biologique a été formulée dans le cadre de cette thèse : le développement de l’angiogenèse thérapeutique requiert l’imitation des processus physiologiques pour contrôler la présentation de VEGF, en particulier vis-à-vis de sa stabilité sur le support et de sa capacité à être internalisé. La validation de cette hypothèse nécessite quant à elle une plateforme adéquate pour mener les essais, et parmi les technologies existantes, notre attention s’est portée sur les interactions superhélices, soit un système moléculaire d’attache très documenté qui comprend deux peptides complémentaires capables de s’auto-assembler. Une seconde hypothèse, d’ordre technologique cette fois, a ainsi été formulée : le système superhélice permet d’immobiliser VEGF sur un substrat solide et de contrôler sa présentation et sa stabilité. Plus précisément, un objectif a été défini quant à la gamme d’affinités à couvrir, soit entre 107 et 1011 M-1. Nous avons, dans un premier temps, validé l’emploi d’un premier système superhélice basé sur les peptides (EVSALEK)5 et (KVSALKE) 5, ou E5 et K5, pour immobiliser VEGF. Pour ce faire, une chimère E5-VEGF a été produite et caractérisée : son immobilisation a été confirmée par test ELISA et son activité biologique démontrée via la promotion de la survie de cellules endothéliales modèles. Ces résultats, rapportés dans le Chapitre 4, constituent notre premier manuscrit, publié dans le journal Acta Biomaterialia. De façon intéressante, l’immobilisation d’E5-VEGF sur des surfaces présentant le peptide complémentaire K5 a été confirmée au moyen de tests avec un biocapteur à résonance plasmonique de surface (SPR). Au cours de ces derniers, la stabilité de la protéine immobilisée est apparue très haute : aucune dissociation du complexe n’a été observée, et il n’a pas été possible de régénérer les surfaces. La régulation que nous souhaitions mettre en place touche majoritairement à la libération contrôlée du facteur de croissance, c’est pourquoi d’autres couples de peptides formant des interactions superhélices ont été étudiés. En collaboration avec le professeur Hodges de l’Université du Colorado, trois peptides analogues du peptide K5 ont été conçus et caractérisés finement avec un biocapteur SPR. La capacité des trois nouveaux peptides à capturer E5-VEGF a été confirmée, et les substitutions de résidus – choisies pour déstabiliser le coeur hydrophobe des superhélices – ont permis de diminuer la stabilité de la protéine immobilisée. Plusieurs essais menés avec d’autres molécules porteuses d’une ou plusieurs étiquettes E5 ont permis d’identifier les couples couvrant la gamme d’affinités voulue. Ces résultats constituent le second manuscrit, présenté dans le Chapitre 5 et publié dans le journal Biomacromolecules. Les essais SPR et les tests ELISA réalisés ont mené à une découverte fortuite : la protéine chimère E5-VEGF présente une propension forte à s’adsorber sur certains substrats ne présentant pas le peptide complémentaire K5. Une étude approfondie, présentée dans le Chapitre 6 et publiée dans le journal Biomacromolecules, a permis de déterminer les forces sous-jacentes à ce phénomène. La caractérisation et l’optimisation de cette adsorption spécifique par l’étiquette E5 a de plus rendu possible un contrôle relatif de la vitesse de la libération contrôlée, sans affecter la bioactivité du facteur de croissance (démontrée dans des essais de prolifération de cellules endothéliales). Il en ressort une nouvelle stratégie d’immobilisation de VEGF, simplifiée, accélérée et relativement stable, qui présente un fort potentiel pour de nombreuses applications en médecine régénératrice. Les travaux présentés dans les manuscrits associés à cette thèse valident l’hypothèse technologique formulée sur les interactions superhélices. En outre, de nombreux résultats complémentaires, réalisés en collaboration directe avec plusieurs collègues au sein du groupe de recherche, ont permis de développer une plateforme qui permet d’immobiliser E5-VEGF avec un contrôle fin, tant sur la densité surfacique que sur la spécificité du greffage par interactions superhélices (l’adsorption directe étant fortement inhibée). Ce substrat adéquat pourra être mis à profit pour étudier la réponse de cellules endothéliales à E5-VEGF immobilisé via les 4 peptides analogues – un plan d’expériences détaillé est suggéré dans le Chapitre 7 de cette thèse. Succinctement, la validation de l’hypothèse biologique nécessitera de caractériser l’internalisation de VEGF et de ses récepteurs et de l’associer à la réponse cellulaire – tant au niveau des voies de signalisation activées que vis-à-vis du comportement macroscopique (migratoire, prolifératif, etc.). En outre, les technologies développées pourront être mises à profit pour d’autres applications dans le domaine de la médecine régénératrice et du génie tissulaire, ou en combinaison avec d’autres facteurs de croissances et biomolécules, pour l’encapsulation de médicaments ou encore la thérapie génique.----------ABSTRACT In order to repair or replace damaged tissues, notably for the treatment of cardiovascular diseases – the world-leading cause of death, great effort is currently spent on the development of new strategies that are based on synthetic materials. The major challenge in that endeavour is to establish a functional vasculature that provides oxygen and nutrients to the cells while removing metabolic waste. Although this is a prerequisite to obtain a sustainable tissue, its conception in vitro has proven to be arduous. The human vascular network indeed expands via a highly complex and finely tuned process, after which it keeps being remodeled. Endothelial cells play a major role in this expansion: they drive blood vessel formation and ensure the integrity of the blood-tissue interface. Their behaviour being predominantly controlled by the vascular endothelial growth factor (VEGF), this growth factor stands out as the main biological effector of angiogenesis. Numerous studies of the angiogenic process have demonstrated the ubiquitous role of VEGF as well as the importance of its spatiotemporal control, be it in terms of concentration, presentation or form. So as to foster advances in tissue engineering, we first formulated a biological hypothesis: the physiological processes that regulate VEGF presentation need to be mimicked for therapeutic angiogenesis to advance, in particular regarding the stability of immobilized VEGF and its capacity to be internalized. The validation of this hypothesis requires the development of an adequate test platform and, among existing technologies, our attention was drawn to coiled-coil interactions. The coiled-coil motif is indeed a well-documented molecular structure obtained by auto-assembly of two complementary peptides. A second hypothesis, of technological nature, was thus formulated: coiled-coil interactions enable the surface immobilization of VEGF that can be controlled in terms of presentation and stability. More precisely, an affinity range spanning from 107 to 1011 M-1, was determined to be of prime interest. To begin with, we have chosen a first coiled-coil motif based on the interaction between the two peptides (EVSALEK)5 and (KVSALKE) 5, or E5 et K5, and confirmed that it enabled VEGF immobilization. This was achieved by producing an E5-tagged VEGF chimera (E5-VEGF) and characterizing its grafting by immunosorbent assays (ELISA). Its biological activity was also demonstrated via model endothelial cell survival assays. The results, which are presented in Chapitre 4, were compiled into the first manuscript, published in Acta Biomaterialia. It is here worth noticing that E5-VEGF capture on K5-decorated surfaces was further supported using a surface plasmon resonance (SPR)-based biosensor and was shown to be highly stable: there was no detectable dissociation of the complex and the surfaces could not be regenerated. The level of stability we sought for VEGF being closer to controlled release than immutable immobilization, new coiled-coil-forming peptide couples were developed. In partnership with Prof. Hodges at University of Colorado, three peptides were designed as analogues to the peptide K5 and thoroughly characterized using an SPR-based biosensor. Their ability to capture E5-VEGF was confirmed. Moreover, the residue substitutions, which were designed to destabilize the hydrophobic core of the coiled-coil, successfully diminished the stability of immobilized VEGF. A series of assays were carried out with other biomolecules bearing one or more E5 tags, and several peptide couples were identified that enable the coverage of the desired affinity range. The results comprise the second manuscript of the thesis that is presented in Chapitre 5 and was published in Biomacromolecules. The various ELISA and SPR assays led to a fortuitous discovery: the chimeric E5-VEGF protein presented a strong propensity to adsorb on certain substrates that were not decorated with the complementary K5. The driving forces of the E5-tag-mediated adsorption process were thoroughly characterized, and the biological activity of adsorbed E5-VEGF was confirmed via endothelial cell proliferation assays. Moreover, a relative control on the release rate of the growth factor was achieved. The data are presented in Chapitre 6 and were compiled in an article that was published in Biomacromolecules. Altogether, this study has unveiled a new immobilization strategy for VEGF that is fast, readily implemented and quite stable, thus bearing strong potential for numerous applications in regenerative medicine. The work that was performed during the thesis validates the technological hypothesis that we formulated regarding coiled-coil interactions. Moreover, an adequate test platform for the subsequent study – featuring fine control over surface density and capture specificity of E5-VEGF – was developed through a number of complementary experiments that were carried out in partnership with several colleagues. The substrate in question will prove beneficial to investigate endothelial cell response to E5-VEGF when immobilized via K5 and its three analogues. A detailed design of experiments is suggested in Chapitre 7 so as to validate the biological hypothesis of the thesis. Briefly, this will require a refined characterization of the internalization of VEGF and its cognate receptors, in correlation with cell response, regarding both the activation of signaling pathways and the macroscopic behaviour (migration, proliferation, etc.). Furthermore, the technological tools we here present could be utilized for a number of other applications in the tissue engineering and regenerative medicine field, be it in conjunction with other growth factors or biomolecules, for drug encapsulation or even gene therapy