Predicting Flavonoid UGT Regioselectivity

Machine learning was applied to a challenging and biologically significant protein classification problem: the prediction of avonoid UGT acceptor regioselectivity from primary sequence. Novel indices characterizing graphical models of residues were proposed and found to be widely distributed among existing amino acid indices and to cluster residues appropriately. UGT subsequences biochemically linked to regioselectivity were modeled as sets of index sequences. Several learning techniques incorporating these UGT models were compared with classifications based on standard sequence alignment scores. These techniques included an application of time series distance functions to protein classification. Time series distances defined on the index sequences were used in nearest neighbor and support vector machine classifiers. Additionally, Bayesian neural network classifiers were applied to the index sequences. The experiments identified improvements over the nearest neighbor and support vector machine classifications relying on standard alignment similarity scores, as well as strong correlations between specific subsequences and regioselectivities

Predicting Flavonoid UGT Regioselectivity with Graphical Residue Models and Machine Learning.

Machine learning is applied to a challenging and biologically significant protein classification problem: the prediction of flavonoid UGT acceptor regioselectivity from primary protein sequence. Novel indices characterizing graphical models of protein residues are introduced. The indices are compared with existing amino acid indices and found to cluster residues appropriately. A variety of models employing the indices are then investigated by examining their performance when analyzed using nearest neighbor, support vector machine, and Bayesian neural network classifiers. Improvements over nearest neighbor classifications relying on standard alignment similarity scores are reported

Microbial production of next-generation stevia sweeteners

BACKGROUND: The glucosyltransferase UGT76G1 from Stevia rebaudiana is a chameleon enzyme in the targeted biosynthesis of the next-generation premium stevia sweeteners, rebaudioside D (Reb D) and rebaudioside M (Reb M). These steviol glucosides carry five and six glucose units, respectively, and have low sweetness thresholds, high maximum sweet intensities and exhibit a greatly reduced lingering bitter taste compared to stevioside and rebaudioside A, the most abundant steviol glucosides in the leaves of Stevia rebaudiana. RESULTS: In the metabolic glycosylation grid leading to production of Reb D and Reb M, UGT76G1 was found to catalyze eight different reactions all involving 1,3-glucosylation of steviol C (13)- and C (19)-bound glucoses. Four of these reactions lead to Reb D and Reb M while the other four result in formation of side-products unwanted for production. In this work, side-product formation was reduced by targeted optimization of UGT76G1 towards 1,3 glucosylation of steviol glucosides that are already 1,2-diglucosylated. The optimization of UGT76G1 was based on homology modelling, which enabled identification of key target amino acids present in the substrate-binding pocket. These residues were then subjected to site-saturation mutagenesis and a mutant library containing a total of 1748 UGT76G1 variants was screened for increased accumulation of Reb D or M, as well as for decreased accumulation of side-products. This screen was performed in a Saccharomyces cerevisiae strain expressing all enzymes in the rebaudioside biosynthesis pathway except for UGT76G1. CONCLUSIONS: Screening of the mutant library identified mutations with positive impact on the accumulation of Reb D and Reb M. The effect of the introduced mutations on other reactions in the metabolic grid was characterized. This screen made it possible to identify variants, such as UGT76G1(Thr146Gly) and UGT76G1(His155Leu), which diminished accumulation of unwanted side-products and gave increased specific accumulation of the desired Reb D or Reb M sweeteners. This improvement in a key enzyme of the Stevia sweetener biosynthesis pathway represents a significant step towards the commercial production of next-generation stevia sweeteners. ELECTRONIC SUPPLEMENTARY MATERIAL: The online version of this article (doi:10.1186/s12934-016-0609-1) contains supplementary material, which is available to authorized users

Structural and Functional Analysis of Grapefruit Flavonol-Specific-3-O-GT Mutant P145T

This research is focused on the study of the effect of mutating proline 145 to threonine on the substrate and regiospecificity of flavonol specific 3-O-glucosyltransferase (Cp3GT). While the mutant P145T enzyme did not glucosylate anthocyanidins, it did glucosylate flavanones and flavones in addition to retaining activity with flavonols. HPLC was used for product identification and showed mutant P145T glucosylated naringenin at the 7-OH position forming naringenin-7-O-glucoside and flavonols at the 3-OH position. Homology modeling and docking was done to predict the acceptor substrate recognition pattern and models were validated by experimental results. In other related work, a thrombin cleavage site was inserted into wild type Cp3GT and recombinant P145T enzyme between the enzyme and the C-myc tags in order to be able to cleave off tags. This provides the tool needed for future efforts to crystallize these proteins for structural determination

Preparation of a Flavonol Specific Glucosyltransferase found in Grapefruit and Site-Directed Mutants for Protein Crystallization

This research was designed to determine the conditions necessary to remove c-myc and 6x-His tags from a flavonol specific glucosyltransferase found in grapefruit (CP3GT) using thrombin in preparation for crystallization. X-ray crystallography of CP3GT crystals may elucidate structural features that account for flavonol specificity in some glucosyltransferase enzymes. A thrombin cleavage site was inserted into WT CP3GT and one mutant. Recombinant CP3GT was expressed in yeast and purified. Optimal conditions for thrombin digestion were explored. Digestion with 100U of thrombin for 2 hours at 4o C was optimal for removing tags from CP3GT. Storage at 4o C for 2 hours resulted in approximately 70% retention of activity. The effect of thrombin treatment on CP3GT activity was tested. Purified CP3GT protein with and without tags was tested for activity with the flavonol quercetin. Data showed no significant difference in overall activity between tagged and native protein

Caracterización de la glicosiltransferasa de tomate Twi1 y su papel en defensa frente a una infección viral

Con el fin de hacer frente a ataques patogénicos de diversa naturaleza, las plantas presentan barreras físicas naturales y acumulan compuestos defensivos. Además, han desarrollado una serie de mecanismos inducibles, que se activan tras la entrada del patógeno, que conllevan la inducción o represión de ciertos genes, así como la producción de metabolitos implicados en defensa. Concretamente, los metabolitos secundarios de naturaleza fenólica juegan un papel muy importante en la respuesta defensiva (Dixon et al., 2002). Éstos pueden clasificarse en tres grupos: moléculas señal, capaces de activar dicha respuesta; fitoanticipinas, presentes en la planta de manera constitutiva o preformados y fitoalexinas, que se sintetizan de novo o ven incrementada su síntesis en respuesta a un ataque microbiano. En el laboratorio donde realizaré mi TFM, se estudia la función que desempeñan el ácido salicílico (SA) y el ácido gentísico (GA), compuestos fenólicos pertenecientes al grupo de moléculas señal, en la respuesta defensiva de las plantas (Bellés et al., 1999; Bellés et al., 2006; Zacarés et al., 2007; López-Gresa et al., 2011). Tanto el SA como el GA se acumulan en las plantas en respuesta a infecciones patogénicas, e inducen genes y proteínas de defensa PR (Pathogenesis-Related). Además, recientemente se ha observado que aplicaciones de estos compuestos en plantas de tomate inducen resistencia frente a infecciones virales y viroidales (Campos et al., 2014a). Para estudiar el papel del SA y del GA en la respuesta defensiva, una posible estrategia es la obtención y caracterización de plantas transgénicas que presenten niveles alterados de estos compuestos. Tanto SA como GA se acumulan en plantas en forma de glicósidos, es decir, conjugados a una molécula de azúcar, reacción catalizada por las proteínas glicosiltransferasas (GTs). Muchas de estas GTs se inducen tras la aplicación de SA. Concretamente, el gen de tomate Twi1 (Tomato wound induced 1), que codifica una posible GT de acuerdo con la homología que presenta con proteínas de esta familia, mostró inducción por herida, tratamientos con SA y otros fenólicos, así como por infecciones patogénicas (O Donnell et al., 1998). La caracterización de la función de Twi1 se está llevando a cabo en nuestro laboratorio. La sobreexpresión de la proteína en Nicotiana benthamiana y su purificación permitió el análisis de su actividad enzimática in vitro, mostrando actividad glucosiltransferasa frente a los ácidos 2,4-dihidroxibenzoico (2,4-DHBA) y 2,4,6-trihidroxibenzoico (2,4,6-THBA). Aplicaciones de estos polifenoles a plantas transgénicas de tomate que silencian Twi1 (RNAi Twi1) corroboraron su actividad in vivo, pues estas plantas mostraron un menor porcentaje de conjugación de 2,4-DHBA y 2,4,6-THBA y, por consiguiente, una mayor acumulación de ambos metabolitos en su forma libre (Campos L, 2014). El objetivo principal de mi Trabajo consiste en caracterizar la respuesta de plantas transgénicas RNAi Twi1 frente a la infección con el virus del bronceado del tomate (Tomato Spotted Wilt Virus, TSWV). Para ello, se estudiará la posible resistencia o susceptibilidad frente a la infección atendiendo a la sintomatología, se cuantificará la acumulación de las formas libres y conjugadas de los metabolitos sustrato de Twi1, y/o de otros compuestos que participen en su ruta de biosíntesis, y se analizará la expresión de diferentes genes implicados en defensa. Los metabolitos secundarios juegan un papel muy importante en el sistema defensivo de las plantas, no sólo formando parte de la respuesta final frente al patógeno, sino actuando como moléculas señal y/o compuestos intermediarios. Por ello, la generación de plantas transgénicas que presenten niveles alterados de metabolitos constituye una herramienta muy útil a la hora de profundizar en el estudio de la función que desempeñan en el complejo sistema defensivo de las plantas[ES] Con el fin de hacer frente a ataques patogénicos de diversa naturaleza, las plantas presentan barreras físicas naturales y acumulan compuestos defensivos. Además, han desarrollado una serie de mecanismos inducibles, que se activan tras la entrada del patógeno, que conllevan la inducción o represión de ciertos genes, así como la producción de metabolitos implicados en defensa. Concretamente, los metabolitos secundarios de naturaleza fenólica juegan un papel muy importante en la respuesta defensiva (Dixon et al., 2002). Éstos pueden clasificarse en tres grupos: moléculas señal, capaces de activar dicha respuesta; fitoanticipinas, presentes en la planta de manera constitutiva o preformados y fitoalexinas, que se sintetizan de novo o ven incrementada su síntesis en respuesta a un ataque microbiano. En el laboratorio donde realizaré mi TFM, se estudia la función que desempeñan el ácido salicílico (SA) y el ácido gentísico (GA), compuestos fenólicos pertenecientes al grupo de moléculas señal, en la respuesta defensiva de las plantas (Bellés et al., 1999; Bellés et al., 2006; Zacarés et al., 2007; López-Gresa et al., 2011). Tanto el SA como el GA se acumulan en las plantas en respuesta a infecciones patogénicas, e inducen genes y proteínas de defensa PR (Pathogenesis-Related). Además, recientemente se ha observado que aplicaciones de estos compuestos en plantas de tomate inducen resistencia frente a infecciones virales y viroidales (Campos et al., 2014a). Para estudiar el papel del SA y del GA en la respuesta defensiva, una posible estrategia es la obtención y caracterización de plantas transgénicas que presenten niveles alterados de estos compuestos. Tanto SA como GA se acumulan en plantas en forma de glicósidos, es decir, conjugados a una molécula de azúcar, reacción catalizada por las proteínas glicosiltransferasas (GTs). Muchas de estas GTs se inducen tras la aplicación de SA. Concretamente, el gen de tomate Twi1 (Tomato wound induced 1), que codifica una posible GT de acuerdo con la homología que presenta con proteínas de esta familia, mostró inducción por herida, tratamientos con SA y otros fenólicos, así como por infecciones patogénicas (O Donnell et al., 1998). La caracterización de la función de Twi1 se está llevando a cabo en nuestro laboratorio. La sobreexpresión de la proteína en Nicotiana benthamiana y su purificación permitió el análisis de su actividad enzimática in vitro, mostrando actividad glucosiltransferasa frente a los ácidos 2,4-dihidroxibenzoico (2,4-DHBA) y 2,4,6-trihidroxibenzoico (2,4,6-THBA). Aplicaciones de estos polifenoles a plantas transgénicas de tomate que silencian Twi1 (RNAi Twi1) corroboraron su actividad in vivo, pues estas plantas mostraron un menor porcentaje de conjugación de 2,4-DHBA y 2,4,6-THBA y, por consiguiente, una mayor acumulación de ambos metabolitos en su forma libre (Campos L, 2014). El objetivo principal de mi Trabajo consiste en caracterizar la respuesta de plantas transgénicas RNAi Twi1 frente a la infección con el virus del bronceado del tomate (Tomato Spotted Wilt Virus, TSWV). Para ello, se estudiará la posible resistencia o susceptibilidad frente a la infección atendiendo a la sintomatología, se cuantificará la acumulación de las formas libres y conjugadas de los metabolitos sustrato de Twi1, y/o de otros compuestos que participen en su ruta de biosíntesis, y se analizará la expresión de diferentes genes implicados en defensa. Los metabolitos secundarios juegan un papel muy importante en el sistema defensivo de las plantas, no sólo formando parte de la respuesta final frente al patógeno, sino actuando como moléculas señal y/o compuestos intermediarios. Por ello, la generación de plantas transgénicas que presenten niveles alterados de metabolitos constituye una herramienta muy útil a la hora de profundizar en el estudio de la función que desempeñan en el complejo sistema defensivo de las plantasFuertes Bailón, D. (2017). Caracterización de la glicosiltransferasa de tomate Twi1 y su papel en defensa frente a una infección viral. http://hdl.handle.net/10251/78114TFG

Dietary polyphenols display zinc ionophore activity and modulate zinc signaling in hepatocarcinoma cells

El zinc és el metall de transició més abundant després del ferro a totes les cèl·lules, i un micronutrient essencial, presentant diverses funcions en sistemes biològics. D'altra banda, els polifenols de la dieta són micronutrients bioactius que mostren nombrosos beneficis per a la salut, com ara activitat antitumoral i neuroprotectora. Anteriors treballs del nostre grup d'investigació han demostrat que els polifenols interaccionen amb cations de zinc i tenen la capacitat de modular l'expressió de diferents gens implicats en l'homeòstasi d'aquest. En aquest treball van ser usats els flavonoides gal·lat d’Epigalocatequina i Quercetina com a models per polifenols hidrofílics i lipofílics respectivament, observant-se que, un cop combinats amb el zinc, presenten activitat ionófora per aquest metall en un sistema liposomal, similar a l'efecte del Clioquinol, fàrmac utilitzat en teràpies anti-càncer i anti-Alzheimer. A través d'aquest mecanisme, s'augmenten el pool de zinc làbil citoplasmàtic, intercanviable i de senyalització en el model de carcinoma hepatocel·lular Hepa 1-6. Per tant, els polifenols de la dieta es poden afegir a l'arsenal de fàrmacs que modulen l'homeòstasi del zinc i regulen les vies biològiques dependents d'aquest. Com a prova d'aquest principi, hem demostrat aquí, que en concentracions molt baixes, el gal·lat d’Epigalocatequina i la Quercetina quan es combinen amb el zinc, poden activar o inhibir la fosforilació d'Akt en cèl·lules Hepa 1-6. A més, vam demostrar que la Quercetina desencadena l’apoptosi en el carcinoma hepatocel·lular Hepa 1-6 de manera dependent de zinc.El zinc es el metal de transición más abundante después del hierro en todas las células, y un micronutriente esencial, presentando diversas funciones en sistemas biológicos. Por otra parte, los polifenoles de la dieta son micronutrientes bioactivos que muestran numerosos beneficios para la salud, tales como actividad antitumoral y neuroprotectora. Anteriores trabajos de nuestro grupo de investigación han demostrado que los polifenoles interaccionan con cationes de zinc y tienen la capacidad de modular la expresión de diferentes genes implicados en la homeostasis de éste. En este trabajo fueron usados los flavonoides galato de Epigalocatequina y Quercetina como modelos para polifenoles hidrofílicos y lipofílicos respectivamente, observándose que, una vez combinados con zinc, presentan actividad ionófora para este metal en un sistema liposomal, similar al efecto del Clioquinol, fármaco utilizado en terapias anti-cáncer y anti-Alzheimer. A través de este mecanismo, se aumentan el pool de zinc lábil citoplasmático, intercambiable y de señalización en el modelo de carcinoma hepatocelular Hepa 1-6. Por lo tanto, los polifenoles de la dieta se pueden añadir al arsenal de fármacos que modulan la homeostasis del zinc y regulan las vías biológicas dependientes de éste. Como prueba de este principio, hemos demostrado aquí, que en concentraciones muy bajas, el galato de Epigalocatequina y la Quercetina cuando se combinan con zinc, pueden activar o inhibir la fosforilación de Akt en células Hepa 1-6. Además, demostramos que la Quercetina desencadena apoptosis en el carcinoma hepatocelular Hepa 1-6 de manera dependiente de zinc.Zinc is the most abundant transition metal after iron in all cells and an essential micronutrient, displaying many functions in biological systems. On the other hand, dietary polyphenols are bioactive micronutrients that display many health benefits, such as antitumor and neuroprotective activity. Previous work by our research group has shown that polyphenols interact with zinc cations and have the ability to modulate the expression of different genes involved in zinc homeostasis. In this work, using the flavonoids Epigallocatechin-gallate and Quercetin as a model for hydrophilic and lipophilic polyphenols respectively, we show that, once polyphenols are combined with zinc, they display a zinc ionophore activity in a liposomal system, similar to the anti-cancer and anti-Alzheimer drug Clioquinol. Through this mechanism, they increase the labile, interchangeable and signaling pool of cytoplasmic zinc in the hepatocellular carcinoma cells Hepa 1-6 model. Thus, natural dietary polyphenols can be added to the arsenal of drugs that may be used to modulate zinc homeostasis and regulate zinc-dependent biological pathways. As a probe of this principle, we have shown here that at remarkably low concentrations, Epigallocatechin-gallate and Quercetin when combined with zinc, may activate or inhibit Akt-phosphorylation in Hepa 1-6 cells. In addition, we demonstrate that Quercetin triggers apoptosis in the hepatocellular carcinoma Hepa 1-6 cell line in a zinc-dependent way