RALFL34 regulates formative cell divisions in Arabidopsis pericycle during lateral root initiation

We describe the role of RALFL34 during early events in lateral root development, and demonstrate its specific importance in orchestrating formative cell divisions in the pericycle.In plants, many signalling molecules, such as phytohormones, miRNAs, transcription factors, and small signalling peptides, drive growth and development. However, very few small signalling peptides have been shown to be necessary for lateral root development. Here, we describe the role of the peptide RALFL34 during early events in lateral root development, and demonstrate its specific importance in orchestrating formative cell divisions in the pericycle. Our results further suggest that this small signalling peptide acts on the transcriptional cascade leading to a new lateral root upstream of GATA23, an important player in lateral root formation. In addition, we describe a role for ETHYLENE RESPONSE FACTORs (ERFs) in regulatingRALFL34 expression. Taken together, we put forward RALFL34 as a new, important player in lateral root initiation

Induced expression of the Fragaria × ananassa Rapid alkalinization factor-33-like gene decreases anthracnose ontogenic resistance of unripe strawberry fruit stages

Rapid alkalinization factor (RALF) genes encode for ubiquitous small peptides that stimulate apoplastic alkalinization through interaction with malectin-like receptor kinase. RALF peptides may act as negative regulators of plant immune response, inhibiting the formation of the signal receptor complex for immune activation. Recently RALF homologues were identified in different fungal pathogen genomes contributing to host infection ability. Here, FaRALF-33-like gene expression was evaluated in strawberry fruits inoculated with Colletotrichum acutatum, Botrytis cinerea, or Penicillium expansum after 24 and 48 h post-infection. To investigate the role of FaRALF-33-like in strawberry susceptibility, transient transformation was used to overexpress it in white unripe fruits and silence it in red ripe fruits. Agroinfiltrated fruits were inoculated with C. acutatum and expression, and histological analysis of infection were performed. Silencing of FaRALF-33-like expression in C. acutatum-inoculated red fruits led to a delay in fruit colonization by the fungal pathogen, and infected tissues showed less penetrated infective hyphae than in wild-type fruits. In contrast, C. acutatum-inoculated white unripe fruits overexpressing the FaRALF-33-like gene decreased the ontogenic resistance of these fruits, leading to the appearance of disease symptoms and penetrated subcuticular hyphae, normally absent in white unripe fruits. The different response of transfected strawberry fruits to C. acutatum supports the hypothesis that the FaRALF-33-like gene plays an important role in the susceptibility of fruits to the fungal pathogen C. acutatum.Fil: Merino, Maria Cecilia. Universidad de Bologna; Italia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Guidarelli, Michela. Universidad de Bologna; ItaliaFil: Negrini, Francesca. Universidad de Bologna; ItaliaFil: De Biase, Dario. Universidad de Bologna; ItaliaFil: Pession, Annalisa. Universidad de Bologna; ItaliaFil: Baraldi, Elena. Universidad de Bologna; Itali

Signaling peptides in plants

In multicellular organisms, growth and development need to be precisely coordinated and are strongly relying on positional information. Positional control is achieved through exchanges of molecular messages between cells and tissues by means of cell-to-cell communication mechanisms. Especially in plants, accurate and well-controlled cell-to-cell communication networks are essential because of the complete absence of cell mobility and the presence of rigid cell walls. For many years, phytohormones were thought to be the main messengers exchanged between cells. Nevertheless, identification of systemin as the first plant signaling peptide in tomato hinted that peptide hormones were acting in plants as they were in animals. During the last decade, our knowledge of plant signaling peptides has progressed considerably and a number of signaling peptide families have been discovered and partially characterized. Here, we provide an overview of the current knowledge in signaling peptides in the model species Arabidopsis thaliana and discuss their proposed functions during plant growth and development

Induced expression of the Fragaria 7 ananassa Rapid alkalinization factor-33-like gene decreases anthracnose ontogenic resistance of unripe strawberry fruit stages

Rapid alkalinization factor (RALF) genes encode for ubiquitous small peptides that stimulate apoplastic alkalinization through interaction with malectin-like receptor kinase. RALF peptides may act as negative regulators of plant immune response, inhibiting the formation of the signal receptor complex for immune activation. Recently RALF homologues were identified in different fungal pathogen genomes contributing to host infection ability. Here, FaRALF-33-like gene expression was evaluated in strawberry fruits inoculated with Colletotrichum acutatum, Botrytis cinerea, or Penicillium expansum after 24 and 48 h post-infection. To investigate the role of FaRALF-33-like in strawberry susceptibility, transient transformation was used to overexpress it in white unripe fruits and silence it in red ripe fruits. Agroinfiltrated fruits were inoculated with C. acutatum and expression, and histological analysis of infection were performed. Silencing of FaRALF-33-like expression in C. acutatum-inoculated red fruits led to a delay in fruit colonization by the fungal pathogen, and infected tissues showed less penetrated infective hyphae than in wild-type fruits. In contrast, C. acutatum-inoculated white unripe fruits overexpressing the FaRALF-33-like gene decreased the ontogenic resistance of these fruits, leading to the appearance of disease symptoms and penetrated subcuticular hyphae, normally absent in white unripe fruits. The different response of transfected strawberry fruits to C. acutatum supports the hypothesis that the FaRALF-33-like gene plays an important role in the susceptibility of fruits to the fungal pathogen C. acutatum

Analysis of novel cysteine-rich peptides during reproductive processes in Zea mays

Um eine Doppelbefruchtung erfolgreich abzuschließen, benötigen blühende Pflanzen eine Batterie an Signalpeptiden, die die verschiedenen Prozesse von der Pollenkeimung über die Freisetzung der Spermazellen bis hin zur Verschmelzung der Gameten präzise regulieren. Kleine sekretierte cysteinreiche Peptide oder Proteine (CRPs) spielen eine Schlüsselrolle für die Zell-Zell-Kommunikation während der verschiedenen Reproduktionsprozesse. In dieser Arbeit werden in Kapitel 1 die Gametophytenentwicklung bei Angiospermen (Blütenpflanzen) und der Fortpflanzungsprozess kurz vorgestellt. Kapitel 2 beschreibt die Identifizierung und funktionelle Erforschung von Rapid Alkalinization Factor (RALF) Peptiden in Mais, die zu den am stärksten exprimierten CRP-Genen in Pollen gehören. Der Schwerpunkt von Kapitel 3 liegt auf den Interaktionen zwischen RALF-Peptiden und rezeptorähnlichen Kinasen, Co-Rezeptoren und Zellwandproteinen. Kapitel 4 beschreibt die Untersuchung von Pollen Ole e 1-like (POE) Proteinen in Mais und einem Defensin-like (DEFL) Protein, die CRP-Gruppen zugehörig sind, deren Gene spezifisch in Pollen und Pollenschläuchen exprimiert werden. Abschließend werden in Kapitel 5 die Ergebnisse aus dieser Arbeit in einem breiteren Kontext diskutiert und ein Ausblick auf weitere Studien gegeben. Die Hauptschwerpunkte der Arbeit lagen auf RALF-Signalpeptiden und deren Funktionen während des Prozesses der Pollenschlauch-Wachstumskontrolle in Mais (Zea mays L.). Die Funktion von RALF-Peptiden bei der Aufrechterhaltung der Pollenschlauchintegrität während der Reproduktion wurde zuvor in Arabidopsis thaliana beschrieben, aber wie sich RALF-Peptide im Maisgenom verteilen, inwieweit Funktionen konserviert sind und ob es spezifische Funktionen im Mais gibt, war bisher unbekannt. Um die Verteilung und die Eigenschaften der RALF-Peptide im Mais zu erforschen, wurde ein Whole Genome Blast Searcher durchgeführt. Neben den 20 zuvor identifizierten ZmRALF-Genen wurden weitere vier ZmRALF-Gene gefunden. Eine phylogenetische Analyse wurde durchgeführt, um die 24 ZmRALF- und 37 AtRALF-Peptide zu vergleichen. Basierend auf Sequenzähnlichkeit und Strukturmerkmalen konnten die RALF-Peptide der beiden Arten in vier Kladen eingeteilt werden. Klade I und II sind typische RALF-Peptide, die ein Propeptid und YISY- sowie YY-Interaktionsdomänen enthalten. Klade III enthält nur RALF-Peptide aus Arabidopsis, die ein YISY enthalten, denen aber eine YY-Interaktionsdomäne fehlt. Klade IV RALF-Peptide sind kurz und haben keine der oben beschriebenen typischen Merkmale. Ihre Funktion(en) sind unbekannt. In dieser Arbeit wurden daher zwei Typen von RALF-Peptiden untersucht: ZmRALF2/3 aus Clade II und ZmRALF1/5 aus Clade IV. Sie sind die am häufigsten vorkommenden RALF-Gene in Mais, da ihr Transkript etwa 97% aller im Pollenschlauch exprimierten RALF-Gene ausmacht. Um die subzelluläre Lokalisation der ZmRALF-Peptide zu untersuchen, wurden eGFP-Fusionsproteine, getrieben durch den pollen-spezifischen AtRALF4-Promotor, in Arabidopsis thaliana transformiert. Nach der mikroskopischen Analyse des in vitro gekeimten Pollenschlauchs wurden ZmRALF2/3 hauptsächlich in der Zellwand nachgewiesen, während ZmRALF1/5 in Vesikeln/Granula im Zytoplasma lokalisiert waren, aber in vitro nicht sezerniert wurden. Um die Funktion der ZmRALF-Peptide weiter zu untersuchen, wurden RNA-Interferenz-Mutanten (RNAi-RALFs) erzeugt, um ZmRALF1/2/3 herunterzuregulieren. In RNAi-RALFs-Mutantenlinien wurde die Expression von ZmRALFs im Vergleich zu Wildtyp-Pollen auf etwa die Hälfte herunterreguliert. Die phänotypische Analyse der RNAi-RALFs-Mutanten zeigte, dass die in vitro gekeimten Pollenschläuche instabil waren und dazu neigten, in der subapikalen Region des Schlauchs zu platzen; die Übertragung der männlichen Gametophyten, aber nicht die Effizienz der weiblichen Übertragung waren signifikant verringert. Von Catharanthus roseus receptor like kinase 1-like proteins (CrRLK1Ls), LORELEI-like-GPI-anchored proteins (LLGs) und Leucine-riche repeat extensins (LRXs) wurde berichtet, dass sie mit typischen RALF-Peptiden in Arabidopsis thaliana und der Tomate interagieren. Um die Funktion dieser Interaktoren im RALF-Signalweg zu untersuchen, wurden Genom-Blasts durchgeführt. Es wurden 17 CrRLK1L-Protein-Gene, vier für LLGs und 17 für LRXs gefunden. Putative Mais-Homologe von Arabidopsis FERONIA (FER), ANXURE 1/2 (ANX1/2), Buddha's Paper Seal 1/2 (BUPS1/2), LLGs und LRXs wurden als ZmFERL1, ZmFERL4, ZmFERL7/9, ZmLLGs bzw. ZmPEXs bezeichnet. Abgesehen von ZmFERL1, das in männlichen gametophytischen Zellen nicht exprimiert wird, werden die anderen homologen Gene ausschließlich in Pollen und Pollenschläuchen exprimiert. Multiple Pull-Down-Assays bestätigten die Interaktion zwischen den Clade II RALF Peptiden ZmRALF2/3 und ihren putativen Interaktoren, während die Clade IV Peptide ZmRALF1/5 keine Interaktion mit diesen Proteinen zeigten. Die Bindungsaffinitäten zwischen ZmRALFs und ZmCrRLK1Ls und ZmPEX2 wurden mit Microscale Thermophoresis (MST) getestet. Demnach binden ZmRALF2/3 stark mit ZmPEX2, weniger stark mit ZmFERL4/7/9 und nur schwach mit ZmFERL1. Clade II RALF Peptide ZmRALF2/3 interagierten auch mit Arabidopsis ANXs/BUPSs/LRXs und umgekehrt, während Clade IV RALF Peptide ZmRALF1/5 dies nicht taten. Verschiedene CRISPR/sCas9-Mutanten wurden generiert und genotypisiert, um die Funktionen von ZmFERLs in zukünftigen Studien zu untersuchen. Neben den RALFs, POE und DEFL wurden zwei weitere CRPs untersucht. In Mais gibt es 27 POE-Gene, die in drei Gruppen eingeteilt werden können. Diese Arbeit konzentrierte sich auf die POE-Gene der Gruppe I-A mit den Namen ZmPOE1.1 und ZmPOE1.2, die sich in Bezug auf Proteinsequenzen und Expressionsmuster sehr ähnlich sind. Um die Funktionen der ZmPOEs zu untersuchen, wurden RNA-Interferenz- und CRISPR/Cas9-Mutanten erzeugt. In den RNAi-POEs wurden ZmPOE1.1/1.2 im Vergleich zum Wildtyp auf etwa 20% herunterreguliert, aber es konnten keine offensichtlichen phänotypischen Defekte bei in vitro gekeimten Pollenschläuchen beobachtet werden. In Cas9-POEs-Linien wurden Fragmentdeletionen gefunden. Pollenschläuche von Cas9-POEs-Mutanten waren etwa 90 Minuten nach der Keimung in vitro instabil. ZmDEFL1 wird hoch und ausschließlich in Pollen exprimiert. Eine RNA-Interferenz-Mutante wurde generiert, um die Funktion von ZmDEFL1 zu untersuchen. In der RNAi-DEFL1-Mutante war das Expressionsniveau von ZmDEFL1 im Vergleich zum Wildtyp auf 5% herunterreguliert. Allerdings konnte ich weder einen Effekt auf die Pollenkeimung und das Wachstum in vitro noch einen Defekt bei der Übertragung der männlichen Gametophyten feststellen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der RALF-Signalweg, der die Zellwandintegrität während des Pollenschlauchwachstums reguliert, zwischen Mais und Arabidopsis konserviert ist. ZmPOEs werden für das in vitro Pollenschlauchwachstum benötigt, aber es sind weitere Tests zum Funktionsmechanismus erforderlich. ZmDEFL1 erwies sich während der doppelten Befruchtung von Mais nicht als essentiell

Receptor-like kinases and pathogen-associated molecular patterns perception in Arabidopsis

Comparable to the innate immune response in mammals and insects, plants possess highly specific and sensitive recognition systems for pathogen-associated molecular patterns (PAMPs), such as bacterial flagellin. In Arabidopsis, perception of flagellin occurs via recognition of the most conserved domain in its N-terminus, represented by the peptide flg22. Perception of this elicitor-active domain depends on the LRR receptor kinase FLS2. Here, using transcriptome analysis in Arabidopsis, we first present evidences that treatment with flg22, bacteria or avirulence proteins are similar, and that virulent bacteria are likely to suppress flg22-induced responses (Chapter 1). Second, we demonstrated that flagellin perception contributes to the basal resistance against bacteria, as fls2 mutants are more susceptible to bacterial infection, proving for the first time that perception of a single PAMP is sufficient to restrict bacterial growth (Chapter 2). This study also showed that PAMPs other than flagellin trigger resistance against virulent bacteria. Wild-type and fls2 mutants both display enhanced resistance when treated with crude bacterial extracts, even devoid of elicitor-active flagellin, indicating the existence of functional perception systems for PAMPs other than flagellin. One of these novel PAMPs was just identified as the elongation factor EF-Tu, and the corresponding active peptidic epitope identified (Appendix 1). FLS2 constituted so far the only PAMP receptor identified in Arabidopsis. Using ATH1 Affymetrix arrays, we identified about 1000 genes whose expression was induced 30 minutes after flg22 treatment (Chapter 2). Strikingly, among these induced genes there were 106 RLK out of the 610 RLK genes present in Arabidopsis. We hypothesize that the perception of a single PAMP (e.g. flg22) could enhance the sensitivity of the plant to microbial stimuli sensing the presence of invading microorganisms. In particular, some of the induced RLKs might be involved in the recognition of other PAMPs. We generated a collection of mutants for the induced LRR-RLKs to test the implication of the corresponding proteins in innate immune responses (Chapter 3.1). This approach led to the discovery of the EF-Tu receptor (Chapter 3.2) and suggested a new role for the previously described BAK1 gene in flg22- and probably elf18-signaling (Chapter 3.3)

The beginning of a seed: regulatory mechanisms of double fertilization

Weather conditions are widely acknowledged to contribute to the occurrence of congestion on motorway traffic by influencing both traffic supply and traffic demand. To the best of our knowledge, this is the first paper that explicitly integrates supply and demand effects in predicting the influence of adverse weather conditions on the probability of occurrence of congestion. Traffic demand is examined by conducting a stated adaptation experiment, in which changes in travel choices are observed under adverse weather scenarios. Based on these choices, a Panel Mixed Logit model is estimated. Supply effects are taken into account by examining the influence of precipitation on motorway capacity. Based on the Product Limit Method, capacity distribution functions are estimated for dry weather, light rain and heavy rain. With the developed model to integrate the supply and demand effects breakdown probabilities can be calculated for any given traffic demand and capacity. The results show that rainfall leads to a significant increase in the probability of traffic breakdown at bottleneck locations. Interestingly the probability of a breakdown at these bottleneck locations is predicted to be slightly higher in light rain (98.7%) than in heavy rain (95.7%) conditions, which is the result of the higher traffic demand in light rain conditions. Based on the results presented in this paper, it can be recommended to always incorporate both supply and demand effects in the predictions of motorway breakdown probabilities due to adverse weather conditions to improve the validity of the predictions. © 2015 Editorial Board EJTIR. All rights reserved