PPD v1.0—an integrated, web-accessible database of experimentally determined protein pK(a) values

The Protein pK(a) Database (PPD) v1.0 provides a compendium of protein residue-specific ionization equilibria (pK(a) values), as collated from the primary literature, in the form of a web-accessible postgreSQL relational database. Ionizable residues play key roles in the molecular mechanisms that underlie many biological phenomena, including protein folding and enzyme catalysis. The PPD serves as a general protein pK(a) archive and as a source of data that allows for the development and improvement of pK(a) prediction systems. The database is accessed through an HTML interface, which offers two fast, efficient search methods: an amino acid-based query and a Basic Local Alignment Search Tool search. Entries also give details of experimental techniques and links to other key databases, such as National Center for Biotechnology Information and the Protein Data Bank, providing the user with considerable background information. The database can be found at the following URL:

PIP-DB:the protein isoelectric point database

A protein's isoelectric point or pI corresponds to the solution pH at which its net surface charge is zero. Since the early days of solution biochemistry, the pI has been recorded and reported, and thus literature reports of pI abound. The Protein Isoelectric Point database (PIP-DB) has collected and collated these data to provide an increasingly comprehensive database for comparison and benchmarking purposes. A web application has been developed to warehouse this database and provide public access to this unique resource. PIP-DB is a web-enabled SQL database with an HTML GUI front-end. PIP-DB is fully searchable across a range of properties

Capturing, sharing and analysing biophysical data from protein engineering and protein characterization studies

Large amounts of data are being generated annually on the connection between the sequence, structure and function of proteins using site-directed mutagenesis, protein design and directed evolution techniques. These data provide the fundamental building blocks for our understanding of protein function, molecular biology and living organisms in general. However, much experimental data are never deposited in databases and is thus ‘lost’ in journal publications or in PhD theses. At the same time theoretical scientists are in need of large amounts of experimental data for benchmarking and calibrating novel predictive algorithms, and theoretical progress is therefore often hampered by the lack of suitable data to validate or disprove a theoretical assumption. We present PEAT (Protein Engineering Analysis Tool), an application that integrates data deposition, storage and analysis for researchers carrying out protein engineering projects or biophysical characterization of proteins. PEAT contains modules for DNA sequence manipulation, primer design, fitting of biophysical characterization data (enzyme kinetics, circular dichroism spectroscopy, NMR titration data, etc.), and facilitates sharing of experimental data and analyses for a typical university-based research group. PEAT is freely available to academic researchers at http://enzyme.ucd.ie/PEAT

Highly Perturbed pKa Values in the Unfolded State of Hen Egg White Lysozyme

AbstractThe majority of pKa values in protein unfolded states are close to the amino acid model pKa values, thus reflecting the weak intramolecular interactions present in the unfolded ensemble of most proteins. We have carried out thermal denaturation measurements on the WT and eight mutants of HEWL from pH 1.5 to pH 11.0 to examine the unfolded state pKa values and the pH dependence of protein stability for this enzyme. The availability of accurate pKa values for the folded state of HEWL and separate measurements of mutant-induced effects on the folded state pKa values, allows us to estimate the pKa values of seven acidic residues in the unfolded state of HEWL. Asp-48 and Asp-66 display pKa values of 2.9 and 3.1 in our analysis, thus representing the most depressed unfolded state pKa values observed to date. We observe a strong correlation between the folded state pKa values and the unfolded state pKa values of HEWL, thus suggesting that the unfolded state of HEWL possesses a large degree of native state characteristics

Prediction of protonation states in ligand-protein complexes upon ligand binding

Die ständige Weiterentwicklung der Computer-Hardware und die daraus resultierende Steigerung der Rechenleistung ermöglicht heutzutage eine erfolgreiche Modellierung von chemischen und biologischen Prozessen, die vor 20 Jahren noch undenkbar war. Als Beispiele sind Molekulardynamik-Simulationen grosser Biomoleküle, die Berechnung freier Bindungsenergien von Protein-Ligand-Komplexen oder auch Untersuchungen von Reaktionswegen in Enzymen zu nennen. In einem Bereich mangelt es jedoch weiterhin an akkuraten Methoden: die Abschätzung von Protonierungszuständen in Protein-Ligand-Komplexen. In der vorliegenden Arbeit zeigen wir die Entwicklung einer neuen Methode der Ladungszuweisung, genannt PEOE_PB (Partial Equalisation of Orbital Electronegativities - optimiert für Poisson-Boltzmann Rechnungen). Diese Methode stellt eine konsistente Ladungszuweisung sowohl für Proteine als auch für kleine organische Moleküle dar. Die Ladungen sind entscheidende Parameter bei Poisson-Boltzmann (PB)- Rechnungen. PB-Rechnungen stellen eine etablierte Methode bei der Bestimmung von pKa-Werten in Proteinen dar. Die Entwicklung von PEOE_PB-Ladungen ist notwendig geworden, da es keine generische Methode gibt, PB-basierte pKa-Berechnungen in Protein-Ligand-Komplexen durchzufÃ�hren. Der PEOE-Ansatz wurde gewählt, um zunächst die freien Solvatationsenergien kleiner organischer Moleküle bestmöglich vorherzusagen. Modifikationen wurden heuristisch, d.h. ergebnisorientiert vorgenommen, wobei Änderungen lediglich den Parameter a des PEOE-Polynoms betreffen. Bei unserer Optimierung versuchten wir zunächst, die experimentell bestimmten freien Solvatationsenergien polarer AminosÃ�uren (r2 = 0.94, RMSD = 0.84) und anschliessend eines Datensatzes von 80 kleinen organischen MolekÃ�ulen (r2 = 0.78, RMSD = 1.57) zu reproduzieren. Die Verwendung des letztgenannten Datensatzes zeigt den generischen Charakter unserer PEOE_PB-Ladungen. Abschliessend führten wir Rechnungen an einem Datensatz von neun (apo-)Proteinen mit 132 experimentell bestimmten pKa-Werten durch und erzielten einen RMSD von 0.88. Die Dielektrizitätskonstante im Protein war hierbei auf 20 gesetzt. Aminosäurereste in Bindetaschen mit stark verschobenen pKa-Werten lagen bei zwei Enzymen des Datensatzes vor, in diesen FÃ�llen wurden folgende Beobachtungen gemacht: * Die Dielektrizitätskonstante wurde von 20 auf 4 gesenkt, was teilweise durch die Vergrabenheit der Bindetasche erklärt werden kann. * Die Orientierung der Hydroxylgruppe des Tyrosins hatte einen beachtlichen Einfluss auf den pKa-Wert eines Aminosäurerestes in der Bindetasche (ein Glutamat mit einem stark erhöhten pKa-Wert). Diese Tatsache unterstreicht den entscheidenden Einfluss der Orientierung polarer Wasserstoffatome. Im letzten Schritt unserer PEOE_PB-Validierung führten wir pKa-Berechnungen für drei Protein-Ligand-Komplexe (die im Experiment einen Protonentransfer zeigten) durch: in allen Fällen stimmten unsere Berechnungen mit dem Experiment überein. In einer folgenden reinen Anwendungstudie führten wir pKa-Berechnungen für eine Serie von Liganden, die an die Serin-Proteasen Trypsin und Thrombin binden, durch. An diesen Komplexen waren bereits ausführliche ITC- und Kristallographie-Studien gemacht worden und für vier dieser Komplexe konnten Ã�nderungen in den ProtonierungszustÃ�nden detektiert werden [Dullweber et al., J. Mol. Biol. 313 (2001), 593] . Da ITC-Experimente jedoch nur gesamtheitliche Ã�nderungen in der Protonierung messen, konnten diese Experimente keinen Aufschluss darüber geben, welche funktionellen Gruppen tatsächlich am Protonentransfer beteiligt sind. Um diese Gruppen identifizieren zu können, führten wir Poisson-Boltzmann-Rechnungen, basierend auf unseren PEOE_PB-Ladungen, durch. Die resultierenden pKa-Werte zeigen, dass His57 (einer der drei katalytisch aktiven Reste) für die wichtigsten pKa-Änderungen, die sich im Experiment als Ã�nderungen im Protonierungszustand zeigen, verantwortlich ist. Dies steht im Widerspruch zu unserer frÃ�heren Annahme, dass die Ã�nderungen im Protonierugszustand an der Carboxylgruppe der Liganden ablaufen. Der neuentdeckte Protonenakzeptor wurde für die Refaktorisierung der ITC-Daten eingesetzt; dies ist wichtig für Fälle, in denen sich die Protonierung während der Komplexbildung ändert. Die pKa-Werte von Komplexen, die im ITC-Experiment keine Änderung im Protonierungszustand zeigen, werden in den meisten Fällen verlässlich vorhergesagt, während dies in Fällen stark koppelnder Systeme schwierig bleibt. Solche Fälle treten auf, wenn zwei (oder mehr) interagierende titrierbare Gruppen räumlich nahe beiander liegen. Die HIV-Protease (HIVP) ist ein bekanntes Beispiel für erfolgreiches strukturbasiertes Wirkstoffdesign und ist ein gut untersuchtes System, bei dem Änderungen des Protonierungszustandes während der Ligandenbindung auftreten, wie im Experiment gezeigt wurde. Das System der HIVP stellt einen Ausgangspunkt für eine weitere Anwendungsstudie unserer PEOE_PB-Ladungen dar. Bei dem Apo-Enzym befindet sich die zwei katalytisch aktiven Reste (Aspartate) im monoprotonierten Zustand. Dieser kann sich ändern, wenn Liganden binden, die eine cylische Harnstoff-Gruppe enthalten. Unser PEOE_PB-Modell reproduziert den experimentell bestimmten Protonierungszustand. Ferner führten wir pKa-Berechnungen für zwei HIVP-Komplexe mit neuartigen Inhibitoren, die unserer Gruppe entwickelt und synthetisiert wurden [Specket et al, J. Med. Chem., 48 (2005) 6607], durch. In diesen Fällen gibt es keinerlei experimentelle Daten für die Protonierungszustände. Einer der Inhibitoren enthält ein Pyrrolidin-Ring: hier sagten die Berechnungen voraus, dass beide katalytisch aktiven Aspartate nach Ligandenbindung deprotoniert vorliegen. Solch ein Protonierungsmuster wurde bisher in keinem HIVP-Komplex beobachtet, weder experimentell noch mittels einer Berechnungsmethode. Neben den experimentellen Trypsin/Thrombin-Studien wurden auch kombinierte kristallographische und thermodynamische Untersuchungen der Ligandenbindung an humaner Aldose-Reduktase (hAR) in unserer Gruppe vorgenommen [Steuber, Doktorarbeit in Vorbereitung]. Die ITC-Messungen zeigten einen durch die Ligandenbindung induzierten Protonentransfer. Unsere Berechnungen lassen darauf schliessen, dass ein Tyrosin-Rest der Bindetasche (Tyr48) als Protonenakzeptor fungiert, was bedeutet, dass das Tyrosin im Holo-Enzym deprotoniert vorliegt. Dies ist im Einklang mit den Ergebnissen von ITC-Messungen an Tyr48Phe-Mutanten. Während bei hAR-Komplexen von Inhibitoren mit einer Carboxyl-Kopfgruppe die Berechnungen gut im Einklang mit den ITC-Experimenten waren, zeigten sich Ungenauigkeiten bei der Vorhersage von Inhibitoren mit einer cyclischen Hydantoin-Gruppe. Eine mögliche Erklärung hierfür ist die starke elektrostatische Wechselwirkung zwischen Ligand und den Tyrosin bzw. Lysin-Resten der Bindetasche. Ferner liegen die pKa-Werte in wässriger LÃ�sung nahe dem physiologischen pH-Bereich, was das System sehr anfälig für kleine Ã�nderungen des pKa-Wertes macht. Ein limitierender Faktor für die breite Anwendung unserer PEOE_PB Ladungsmethode bei pKa-Rechnungen stellt die vorangehende Prozessierung der Liganden dar. Zu diesem Zweck implementierten wir den PEOE_PB-Algorithmus in das PDB2PQR-Programm (dieses erzeugt Input-Dateien für das Poisson-Boltzmann-Programm APBS). Liganden wurden in der PDB2PQR-Umgebung als voll flexibel betrachtet, und es wurde eine Suchprozedur für gemeinsame Substrukturen eingeführt. Mit dieser Technik ist es möglich, titrierbare Gruppen des Liganden automatisch zu erkennen und ihnen pKa-Werte zuzuweisen. Diese pKa-Werte stammen aus einer Datenbank, die momentan 348 Moleküle mit experimentell bestimmten pKa-Werten enthält

Antioxidant and DPPH-Scavenging Activities of Compounds and Ethanolic Extract of the Leaf and Twigs of Caesalpinia bonduc L. Roxb.

Antioxidant effects of ethanolic extract of Caesalpinia bonduc and its isolated bioactive compounds were evaluated in vitro. The compounds included two new cassanediterpenes, 1α,7α-diacetoxy-5α,6β-dihydroxyl-cass-14(15)-epoxy-16,12-olide (1)and 12α-ethoxyl-1α,14β-diacetoxy-2α,5α-dihydroxyl cass-13(15)-en-16,12-olide(2); and others, bonducellin (3), 7,4’-dihydroxy-3,11-dehydrohomoisoflavanone (4), daucosterol (5), luteolin (6), quercetin-3-methyl ether (7) and kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1Ç2)-β-D-xylopyranoside (8). The antioxidant properties of the extract and compounds were assessed by the measurement of the total phenolic content, ascorbic acid content, total antioxidant capacity and 1-1-diphenyl-2-picryl hydrazyl (DPPH) and hydrogen peroxide radicals scavenging activities.Compounds 3, 6, 7 and ethanolic extract had DPPH scavenging activities with IC50 values of 186, 75, 17 and 102 μg/ml respectively when compared to vitamin C with 15 μg/ml. On the other hand, no significant results were obtained for hydrogen peroxide radical. In addition, compound 7 has the highest phenolic content of 0.81±0.01 mg/ml of gallic acid equivalent while compound 8 showed the highest total antioxidant capacity with 254.31±3.54 and 199.82±2.78 μg/ml gallic and ascorbic acid equivalent respectively. Compound 4 and ethanolic extract showed a high ascorbic acid content of 2.26±0.01 and 6.78±0.03 mg/ml respectively.The results obtained showed the antioxidant activity of the ethanolic extract of C. bonduc and deduced that this activity was mediated by its isolated bioactive compounds