Protein-targeted corona phase molecular recognition

Corona phase molecular recognition (CoPhMoRe) uses a heteropolymer adsorbed onto and templated by a nanoparticle surface to recognize a specific target analyte. This method has not yet been extended to macromolecular analytes, including proteins. Herein we develop a variant of a CoPhMoRe screening procedure of single-walled carbon nanotubes (SWCNT) and use it against a panel of human blood proteins, revealing a specific corona phase that recognizes fibrinogen with high selectivity. In response to fibrinogen binding, SWCNT fluorescence decreases by \u3e80% at saturation. Sequential binding of the three fibrinogen nodules is suggested by selective fluorescence quenching by isolated sub-domains and validated by the quenching kinetics. The fibrinogen recognition also occurs in serum environment, at the clinically relevant fibrinogen concentrations in the human blood. These results open new avenues for synthetic, non-biological antibody analogues that recognize biological macromolecules, and hold great promise for medical and clinical applications

DNA-origami-pohjaiset in vitro -kuljettimet

The field of DNA nanotechnology aims to construct artificial nanoscale structures and functionalized materials from DNA. The rapid development of DNA nanotechnology has inspired researchers to develop various DNA-based drug delivery vehicles. One approach to build complex DNA nanostructures is to use the method of DNA origami, which is discussed in more detail in this thesis. This thesis examines the use of a tubular DNA origami as a cellular delivery vehicle for the transport of Streptavidin-Lucia luciferase enzymes into HEK293 cells in vitro. The correct folding of the origamis was evaluated using agarose gel electrophoresis and transmission electron microscopy. The transfection was studied using confocal microscopy and the activity of the delivered enzymes was detected in the cell lysates using a bioluminescence assay. These DNA origami-enzyme complexes were also coated with varying amounts of different cationic block-copolymers, and the effect of these coatings on the enzyme activity was investigated using the bioluminescence assay. According to the results, the DNA origami delivered the enzymes into cells and the enzymes remained active after transfection. The results also suggest that it is possible to control the enzyme kinetics of the complexes by varying the amount of cationic polymers that coat the DNA origamis. However, the enzymes were found to bind nonspecifically to the origamis, and it remains unclear whether the shape of the origami contributed to the transfection. The stability and integrity of the complexes should be studied more carefully.DNA-nanoteknologia tarkoittaa keinotekoisten nanomittakaavan rakenteiden ja funktionaalisten materiaalien muodostamista DNA:sta. DNA-nanorakenteiden nopea kehitys on innostanut tutkijoita kehittämään niistä erilaisia lääkeainekuljettimia kohdennettuun lääkeannosteluun. Monimutkaisia DNA-rakenteita voidaan muodostaa muun muuassa DNA-origami-tekniikalla, jota käsitellään tässä diplomityössä tarkemmin. Tässä diplomityössä tutkitaan putkimaisen DNA-origamin soveltuvuutta kuljettaa Streptavidin-Lucia luciferase -entsyymejä HEK293-solujen sisään in vitro. Transfektiota tutkittiin konfokaalimikroskoopilla, ja entsyymien aktiivisuutta solujen lysaateissa tarkasteltiin mittaamalla bioluminesenssia. Nämä DNA-origami-entsyymi-kompleksit päällystettiin myös kolmella erilaisella kationisella blokkipolymeerilla. Polymeeripeitteiden vaikutusta entsyymin aktiivisuuteen tutkittiin mittaamalla bioluminesenssia. Tulosten perusteella DNA-origamia voidaan käyttää kuljettamaan entsyymit solun sisään, ja entsyymit säilyttivät aktiivisuutensa transfektion jälkeen. Lisäksi kompleksin entsyymikinetiikkaa voidaan mahdollisesti kontrolloida säätämällä polymeerien määrää päällysteessä. Entsyymi ei kuitenkaan sitoutunut spesifisesti origamiin, ja origamin muoto ei näyttänyt vaikuttavan transfektion tehokkuuteen. Kompleksin stabiilisuutta ja eheyttä on tutkittava tarkemmin

Oberflächenplasmonenresonanz-basierte DNA-Chips und Nucleobasen-Sequenzentwurf

Die vorliegende Dissertation beschreibt die Erarbeitung anwendbarer Methoden zum Aufbau Oberflächenplasmonenresonanz (SPR)-basierter DNA-Mikroarrays. Es werden die Beziehungen zwischen allen Teilschritten der Entwicklung eines DNA-Biosensors aufgezeigt. Die Sondendichte auf der Sensoroberfläche ist entscheidend für die Leistungsfähigkeit eines DNA-Chips. In dieser Arbeit werden thiolmodifizierte Sonden und solche mit Phosphorothioatgruppen verwendet und verglichen. Der Aufbau selbstorganisierender Monoschichten, bestehend aus Mercaptoalkoholen und thiolmodifizierten DNA-Einzelsträngen, wird mittels Röntgenphotoelektronenspektroskopie untersucht. Es werden bis zu 180 Spots auf einem SPR-Chip aufgetragen. Eine weitere Erhöhung der Anzahl an Sondenorten pro Chip wird mit einer hydrophil/hydrophoben Strukturierung der Arrayoberfläche erreicht. Dies erfolgt durch das Mikrokontaktdrucken mit Alkanthiolen. Die selektiven Hybridisierungen der Produkte der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) werden bei SPR-Messungen auf DNA-Mikroarrays detektiert. Eine schnelle markierungsfreie Echtzeitanalyse wird bei Hybridisierungen im mikrofluidischen Kanal innerhalb weniger Minuten erzielt. Die Anwendbarkeit dieser Methoden wurde anhand der Mutationsanalyse der Fusionsgene AML1-ETO und CBFB-MYH11 bei der akuten myeloischen Leukämie bestätigt. Die Hybridisierungseffizienz auf DNA-Mikroarrays hängt stark von der Sodensequenz ab. SPR-Experimente zeigen, dass die Ausbildung der Haarnadelstrukturen die Ursache dafür ist. Ein Computerprogramm (EGNAS) auf Grundlage eines neu entwickelten Nucleobasen-Sequenzentwurf-Algorithmus, ermöglicht die Generierung vollständiger Sequenzsätze. Die Intra- und Interstrangeigenschaften dieser Sequenzen können kontrolliert werden, um Haarnadelstrukturen und Kreuzhybridisierungen zu vermeiden. Dadurch können optimierte Sequenzen für Anwendungen auf DNA-Chips oder in der DNA-Nanobiotechnologie entworfen werden

Molecular Dynamics Simulations of the Protein Adsorption Process on Oxides

The adsorption of chymotrypsin and lysozyme on amorphous silica and titania is studied by molecular dynamics (MD) simulations in comparison to experiments. The simulations allow an atomistic view of the adsorption process including long-range interactions, multi-protein effects, contact analysis and surface-induced conformational changes. The surface contact stability is investigated by Steered MD simulations and Atomic Force Spectroscopy experiments. Surface-induced conformational changes are studied by classical and further developed free energy MD methods based on Metadynamics, Replica Exchange Solute Tempering and Umbrella sampling and are compared to circular dichroism experiments. The protein orientation is highly influenced by its dipole moment whereas protein binding motifs are formed mainly by positively charged amino acids. The comparison to the experiment shows that protein-protein interactions and the hydration shell of oxide and protein need to be considered as well