Bioinformatische Analysen zur Optimierung von Aptamerbibliotheken: Eine Studie zur Aufklärung bindungsrelevanter Charakteristika in Sequenz und Struktur am Beispiel eines Norovirus-Aptamers

Aptamere besitzen als nahezu universelle Binder ein großes Anwendungspotential in Biotechnologie und Medizin; ihre Selektion aus zufälligen Sequenzbibliotheken liefert jedoch nur suboptimale Ergebnisse. Während der Selektion schlagen sich in der Bibliothek Bindungsinformationen nieder, die zur Optimierung des Verfahrens eingesetzt werden können. Die vorliegende Arbeit widmet sich der bioinformatischen Erschließung dieser Informationen. Für die initiale Auswertung der gewonnenen Aptamersequenzdaten erwiesen sich unter Zuhilfenahme von n-Gramm-Deskriptoren und Affinitäten die Regressionsanalyse und auf statistisch-symbolischer Ebene die Mustersuche als wirkungsvolle Verfahren. Für die Aufklärung der Komplexstruktur aus Aptamer und Zielprotein wurde eine Bewertungsfunktion gefunden, die die Identifikation sogenannter nahe-nativer Bindungskonformationen unter den Ergebnissen einer Dockingsimulation erlaubt. Nach dieser methodischen Evaluation erfolgte die Selektion eines Aptamers gegen das Kapsid des humanen Norovirus. Auf Basis der erhobenen Sequenzdaten wurde die Bindegeometrie zwischen Aptamer und Zielprotein durch Anwendung der im Verfahrensprotokoll festgehaltenen Kombination der Analysemethoden aufgeklärt. Das dabei als bindungsrelevant identifizierte Sequenzmotiv kann bei der Erzeugung targetspezifisch optimierter Selektionsbibliotheken als a priori-Information einfließen.:Inhaltsverzeichnis Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis Formelverzeichnis Abkürzungsverzeichnis Vorwort 1 Thematische Einleitung 1.1 Hypothesen und Fragestellungen 1.2 Aufbau der Arbeit 2 Allgemeine Grundlagen 2.1 Protein-Nukleinsäure-Komplexe 2.1.1 Aufbau von Proteinen 2.1.2 Aufbau von Nukleinsäuren 2.1.3 Interaktionen zwischen Proteinen und Nukleinsäuren 2.2 Aptamere und deren Gewinnung 2.2.1 Aptamere als universelle Binder 2.2.2 Das Grundverfahren der Aptamerselektion 2.2.3 Methodische Modifikationen des Selektionsverfahrens 3 Auswertung der Primär- und Sekundärstruktur von Nukleinsäuren 3.1 Numerische Beschreibung von Nukleinsäuren 3.1.1 Nukleobasendeskriptoren 3.1.2 Transformationsstrategien 3.1.3 Direkt anwendbare Beschreibungskonzepte 3.2 Konzeption einer Strategie zur Evaluation der Beschreibungskonzepte 3.2.1 Beschreibung und Vorverarbeitung des Datensatzes 3.2.2 Zusammenstellung von Deskriptorensets 3.2.3 Eingesetzte Methoden 3.3 Ergebnisse der Evaluation 3.3.1 Gegenüberstellung der Beschreibungskonzepte 3.3.2 Überprüfung der Plausibilität 3.3.3 Verhältnismäßigkeit 3.3.4 Abschließende Betrachtung 4 Mustersuche in biologischen Sequenzen 4.1 Sequenzmuster 4.1.1 Definition der Sequenzmuster 4.1.2 Bewertung konkreter Musterfunde 4.1.3 Bewertung einzelner Musterinstanzen 4.1.4 Visualisierung 4.2 Algorithmus zur Mustersuche 4.2.1 Suche in Suffixbäumen 4.2.2 Durchsuchen des Musterraumes 4.2.3 Optimierung der Suchstrategie 4.2.4 Ordnung der Ergebnisse 4.2.5 Zusammenfassung 5 Auswertung der Tertiärstruktur von Protein-Nukleinsäure-Komplexen 5.1 Übersicht der Bewertungsmodelle für Protein-Nukleinsäure-Komplexe 5.1.1 Wissensbasierte Paarpotentiale 5.1.2 Molekularmechanische Bewertung 5.1.3 Auswahl der Konzepte für die weitere Betrachtung 5.2 Vorstellung und Herleitung der ausgewählten Bewertungsmodelle 5.2.1 Die SPA-PN-Potentiale 5.2.2 Die modifizierten SPA-PN Potentiale 5.2.3 Die ITScore-PR Potentiale 5.2.4 Molekularmechanische Bewertung 5.3 Konzeption des Vergleichs der Bewertungsmodelle 5.3.1 Auswahl und Vorstellung der Referenzkomplexe 5.3.2 Generierung von Decoy-Strukturen 5.3.3 Quantifizierung der strukturellen Abweichung 5.4 Ergebnisse des Vergleichs 5.4.1 Referenzkomplex 4PDB 5.4.2 Referenzkomplex 5CMX 5.4.3 Gewichtung der HADDOCK-Bewertung 5.4.4 Visualisierung der Bewertung 5.5 Zusammenfassung 6 Selektion und Analyse eines Norovirus-Aptamers 6.1 Der Norovirus als Zielstruktur der Aptamerselektion 6.1.1 Epidemiologische Aspekte 6.1.2 Aufbau des Norovirus 6.1.3 Nachweis des Norovirus 6.1.4 Eingesetzter Norovirusstamm 6.2 Experimentelle Durchführung und Auswertung 6.2.1 Aptamerselektion 6.2.2 Evaluation der Anreicherung von Aptamerkandidaten 6.2.3 Experimentelle Verifikation der Bindung 6.2.4 Entwurf eines bioinformatischen Analyseprotokolls 6.3 Bioinformatische Analysen auf Basis der Primär- und Sekundärstruktur 6.3.1 Vorhersage der Sekundärstrukturen für die Aptamerkandidaten 6.3.2 Untersuchung der Anreicherung über die Clusteranalyse 6.3.3 Untersuchung der n-Gramm-Zusammensetzung 6.3.4 Durchführung einer Mustersuche 6.3.5 Validierung der Musterfunde 6.4 Bioinformatische Analyse auf Basis der Tertiärstruktur 6.4.1 Bestimmung der Struktur des Zielproteins 6.4.2 Bestimmung der Aptamerstruktur 6.4.3 Bildung eines Komplexes aus Aptamer und Zielprotein 6.4.4 Einschätzung der Relevanz für die Epitope der Proteinoberfläche 6.5 Konzepte für die spezifische Anreicherung von Oligonukleotidbibliotheken 6.5.1 Ableitbare Unterräume des Sequenz- und Strukturraumes 6.5.2 Zusammensetzung einer Bibliothek 7 Abschließende Betrachtung 7.1 Zusammenfassung der Ergebnisse 7.2 Ausblick Literatur Versicherun

Möglichkeiten des Einsatzes von Zika-Virus-Kapsid-Antikörpern und Zika-Virus-Kapsid als diagnostische Marker für den Nachweis einer Zika-Virus-Infektion beim Menschen

Im Rahmen dieser Arbeit wurde untersucht, ob humane Antikörper gegen ZIKV-Kapsid und ZIKV-Kapsid selbst geeignete Biomarker für den Nachweis einer ZIKV-Infektion sind. Sie kann damit als erste Phase einer Studie zur Entwicklung neuer ZIKV-Diagnostika angesehen werden. Der Aufbau, das klinische Erscheinungsbild, die Epidemiologie und der Nachweis von ZIKV, bzw. einer ZIKV-Infektion, wurden erörtert. Die Möglichkeiten und Limitationen aktueller ZIKV-Diagnostika wurden beschrieben, insbesondere hinsichtlich der Spezifität. Durch Analyse des Genoms von ZIKV und anderen Flaviviren wurde gezeigt, dass die Aminoäuresequenzidentität zwischen den einzelnen Flaviviren für flavivirales Kapsid geringer ist als für andere Bestandteile und potenzielle Antigene von Flaviviren. Relevant ist insbesondere die Abgrenzung zu DENV, da eine akute oder abgelaufene DENV-Infektion eine häufige Ursache von Kreuzreaktivität beim Nachweis einer ZIKV-Infektion darstellt. Mittels webserverbasierten In-silico-Analysen konnten immunogene Regionen innerhalb des ZIKV-Kapsid-Proteins kartiert und mit den immunogenen Regionen, welche für ZIKV-Kapsid anderer Flaviviren In-silico oder experimentell ermittelt wurden, verglichen werden. Auf Basis dieser Analysen war die Erwartung, dass bei einer ZIKV-Infektion humane Antikörper gegen ZIKV-Kapsid gebildet werden, welche sich in ihren Paratopen von Antikörpern, die gegen Kapsid-Proteine anderer Flaviviren gebildet werden, unterscheiden. Der Umfang der humanen Antikörperantwort auf ZIKV-Kapsid wurde in dieser Arbeit anschließend untersucht. Dazu wurde das Antigen ZIKV-Kapsid eines ZIKV-Stamms aus der afrikanischen Linie (hier: Stamm MR766) rekombinant hergestellt. Rekombinantes ZIKV-Kapsid eines Stammes der asiatischen Linie (hier: Stamm Z1106033) wurde erworben. In 11 humanen Seren und einem Pool-Serum (WHO-Referenzserum) wurde versucht Anti-ZIKV-Kapsid-Antikörper mittels ELISAs und Western Blots nachzuweisen. Es fanden sich keine bis schwache Hinweise auf das Vorhandensein von Anti-ZIKV-Kapsid-Antikörpern in diesen Seren. Im direkten Vergleich mit 10 Seren von ZIKV-negativen Blutspendern zeigten sich für die Seren des ZIKV-Serumpanels keine höheren ELISA-Extinktionswerte. Dies galt sowohl für den Einsatz von ZIKV-Kapsid des Stammes der afrikanischen Linie als auch beim Einsatz von ZIKV-Kapsid des Stammes der asiatischen Linie. Im Sinn der Ermittlung der Paralleltestreliabilität fand sich für Anti-ZIKV-Kapsid-IgG in einer Regressionsanalyse ein schwacher linearer Zusammenhang zu Messwerten eines gut validierten Referenztests, dem ZIKV-NS1-ELISA der Firma Euroimmun. Dies ist ein schwacher Hinweis auf die postinfektiöse Bildung von humanen Anti-ZIKV-Kapsid-Antikörpern. Obwohl der lineare Zusammenhang signifikant war, ist die Aussagekraft dieses Ergebnisses eingeschränkt. Es fanden sich Hinweise auf unspezifische, im Rahmen dieser Arbeit nicht vollständig identifizierte, Einflüsse auf die Testergebnisse der eigenen Anti-ZIKV-Kapsid-Antikörper-ELISAs. Es ist vorstellbar, dass der gefundene lineare Zusammenhang zum Referenztest teilweise durch diese unspezifischen Einflüsse, im Sinn von Kovariablen, verursacht wird. Die im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Anti-ZIKV-Kapsid-Antikörper-ELISAs zeigten Hinweise für falsch-positive Messergebnisse bei der Testung von fünf DENV-positiven Seren. Mit Hilfe von Western Blots, welche verglichen mit ELISAs als spezifischer gelten, konnten in Seren des ZIKV-Serumpanels keine ZIKV-Kapsid-spezifischen Antikörper nachgewiesen werden. Auch Antikörper aus Seren von ZIKV-negativen Blutspendern und IgG-Antikörper aus gereinigten IgG-Antikörper-Lösungen verursachten positive und somit unspezifische Testergebnisse (Banden). Eine mögliche Erklärung dafür liegt in der hohen Hydrophobizität von ZIKV-Kapsid, was für die Anlagerung nichtspezifischer humaner Antikörper sorgen könnte. Es ist möglich diese Arbeit in zwei Teile zu unterteilen, wobei sich der erste Teil vor allem dem Nachweis von humanen Antikörpern gegen ZIKV-Kapsid widmet und der Nachweis von ZIKV-Kapsid in Serum von Infizierten den zweiten Teil darstellt. Für den Nachweis des Antigens wurden polyklonale und monoklonale Antikörper eingesetzt. Durch Immunisierung von Mäusen mit ZIKV-Kapsid und anschließendem Einsatz der Hybridomtechnik konnten durch Dr. Sven Reiche (Friedrich-Löffler-Institut) und Prof. Christian Jassoy vier monoklonale Antikörper gegen ZIKV-Kapsid gewonnen werden. Diese Antikörper wurden in dieser Arbeit weiter charakterisiert. Sie zeigten sich als geeignet und spezifisch beim Nachweis von ZIKV-infizierten Vero-Zellen durch Immunfluoreszenzfärbungen. Durch Kompetitionstests hatte sich zuvor bereits gezeigt, dass alle Antikörper an dasselbe, oder mindestens nahe beieinander liegende Epitope binden. Da sie sich somit bei Einsatz in einem Sandwich-ELISA zum Nachweis von ZIKV-Kapsid als Antigen verdrängen würden, wurden zwei polyklonale Anti-ZIKV-Kapsid-Antikörper erworben. Ein Sandwich-ELISA, der polyklonale Anti-ZIKV-Kapsid-Antikörper als Fängerantikörper und monoklonale Anti-ZIKV-Kapsid-Antikörper als Detektionsantikörper nutzt, konnte erfolgreich zum Nachweis von ZIKV-Kapsid in verschiedenen Lösungen, u. a. nativem ZIKV-Kapsid in Zellkulturüberstand, eingesetzt werden. Der so aufgebaute Antigen-ELISA erreichte, abhängig von der Kombination an Antikörper und Antigen, eine untere Nachweisgrenze zwischen 2 bis 345 ng/ml. Um zum Nachweis von ZIKV-Kapsid in humanem Serum eines ZIKV-infizierten Patienten eingesetzt werden zu können, müsste seine Sensitivität um etwa zwei bis drei Logstufen steigen. Möglichkeiten dazu wurden diskutiert.:1 Inhaltsverzeichnis 2 2 Abkürzungsverzeichnis 7 3 Einführung 10 4 Aufgabenstellung 47 5 Materialien und Methoden 49 6 Ergebnisse 97 7 Diskussion 131 8 Zusammenfassung 156 9 Literaturverzeichnis 158 10 Abbildungs- und Tabellenverzeichnis 182 11 Anlagen 18

Biotechnologie praxisorientiert unterrichten

In diesem Open Access Buch finden Sie Anregungen für die praktische und schülergerechte Umsetzung molekularbiologischer Methoden an ausgewählten Themenbeispielen für den Biologieunterricht. Biotechnologische Methoden wie die DNA – Analyse werden an Schulen hauptsächlich theoretisch unterrichtet und nicht experimentell erarbeitet. In einem Exkurs zu der Umsetzung eines Schüler*innen Seminars in einem S1 – Labor zeigen wir beispielhaft, wie ein längerfristiges Kooperationsmodell zwischen Schule und Universität gelingen kann. Die praktische Umsetzung kann dabei sowohl das Verständnis für komplexe Themen sowie biologische Basiskonzepte fördern, die sich mithilfe molekularbiologischer Methoden bearbeiten lassen, als auch das wissenschaftsmethodische Verständnis schulen und somit tiefere Einblicke in den Berufsalltag eine*r Laborant*in bzw. Wissenschaftler*in geben. Darüber hinaus findet man konzeptuelle Ideen für die Lehrerbildung und -fortbildung, damit sich auch (angehende) Lehrkräfte bei der Vermittlung und praktischen Umsetzung dieser Inhalte sicher fühlen bzw. Dozierende an Universitäten frühzeitig die Bedürfnisse einer modernen Lehrerbildung im Unterrichtsfach Biologie erkennen und berücksichtigen können. Alle hier vorgestellten Arbeitstechniken und Experimente sind so konzipiert, dass sie ohne zusätzliche Sicherheitsregularien außerhalb von professionellen Forschungslaboren an Schulen durchgeführt werden können

Exploration of cyber-physical systems for GPGPU computer vision-based detection of biological viruses

This work presents a method for a computer vision-based detection of biological viruses in PAMONO sensor images and, related to this, methods to explore cyber-physical systems such as those consisting of the PAMONO sensor, the detection software, and processing hardware. The focus is especially on an exploration of Graphics Processing Units (GPU) hardware for “General-Purpose computing on Graphics Processing Units” (GPGPU) software and the targeted systems are high performance servers, desktop systems, mobile systems, and hand-held systems. The first problem that is addressed and solved in this work is to automatically detect biological viruses in PAMONO sensor images. PAMONO is short for “Plasmon Assisted Microscopy Of Nano-sized Objects”. The images from the PAMONO sensor are very challenging to process. The signal magnitude and spatial extension from attaching viruses is small, and it is not visible to the human eye on raw sensor images. Compared to the signal, the noise magnitude in the images is large, resulting in a small Signal-to-Noise Ratio (SNR). With the VirusDetectionCL method for a computer vision-based detection of viruses, presented in this work, an automatic detection and counting of individual viruses in PAMONO sensor images has been made possible. A data set of 4000 images can be evaluated in less than three minutes, whereas a manual evaluation by an expert can take up to two days. As the most important result, sensor signals with a median SNR of two can be handled. This enables the detection of particles down to 100 nm. The VirusDetectionCL method has been realized as a GPGPU software. The PAMONO sensor, the detection software, and the processing hardware form a so called cyber-physical system. For different PAMONO scenarios, e.g., using the PAMONO sensor in laboratories, hospitals, airports, and in mobile scenarios, one or more cyber-physical systems need to be explored. Depending on the particular use case, the demands toward the cyber-physical system differ. This leads to the second problem for which a solution is presented in this work: how can existing software with several degrees of freedom be automatically mapped to a selection of hardware architectures with several hardware configurations to fulfill the demands to the system? Answering this question is a difficult task. Especially, when several possibly conflicting objectives, e.g., quality of the results, energy consumption, and execution time have to be optimized. An extensive exploration of different software and hardware configurations is expensive and time-consuming. Sometimes it is not even possible, e.g., if the desired architecture is not yet available on the market or the design space is too big to be explored manually in reasonable time. A Pareto optimal selection of software parameters, hardware architectures, and hardware configurations has to be found. To achieve this, three parameter and design space exploration methods have been developed. These are named SOG-PSE, SOG-DSE, and MOGEA-DSE. MOGEA-DSE is the most advanced method of these three. It enables a multi-objective, energy-aware, measurement-based or simulation-based exploration of cyber-physical systems. This can be done in a hardware/software codesign manner. In addition, offloading of tasks to a server and approximate computing can be taken into account. With the simulation-based exploration, systems that do not exist can be explored. This is useful if a system should be equipped, e.g., with the next generation of GPUs. Such an exploration can reveal bottlenecks of the existing software before new GPUs are bought. With MOGEA-DSE the overall goal—to develop a method to automatically explore suitable cyber-physical systems for different PAMONO scenarios—could be achieved. As a result, a rapid, reliable detection and counting of viruses in PAMONO sensor data using high-performance, desktop, laptop, down to hand-held systems has been made possible. The fact that this could be achieved even for a small, hand-held device is the most important result of MOGEA-DSE. With the automatic parameter and design space exploration 84% energy could be saved on the hand-held device compared to a baseline measurement. At the same time, a speedup of four and an F-1 quality score of 0.995 could be obtained. The speedup enables live processing of the sensor data on the embedded system with a very high detection quality. With this result, viruses can be detected and counted on a mobile, hand-held device in less than three minutes and with real-time visualization of results. This opens up completely new possibilities for biological virus detection that were not possible before