Regulationsmechanismen des Interferon regulatorischen Faktors IRF-4 in der chronisch myeloischen Leukämie

Zahlreiche Untersuchungen weisen darauf hin, dass die Gruppe der Interferon-regulatorischen Faktoren (IRF), darunter insbesondere ICSBP und IRF-4, in der Pathogenese der CML eine wichtige Rolle spielt. In peripherem Blut von Patienten mit CML in der chronischen Phase ist die IRF-4-Expression im Vergleich zu Normalblut signifikant herunterreguliert. Eine Therapie mit Interferon-α vermag das IRF-4-Level der Patienten wieder anzuheben und zwischen gutem Ansprechen und hohem IRF-4-Level besteht eine positive Korrelation. Diese Daten könnten auf eine mögliche antileukämische Wirkungsweise von IRF-4 bei Erkrankungen des myeloiden Systems hinweisen. In dieser Arbeit wurde der Mechanismus der deregulierten IRF-4-Expression in Leukämiezellen untersucht. Die IRF-4-Promotor-Region von hämatopoetischen Zellinien, CML-Patienten und normalen Spendern als Kontrolle wurde dabei auf genetische und epigenetische Veränderungen untersucht. Um genetische Aberrationen auszuschließen, wurde der IRF-4-Promotor sequenziert. Dabei wurden keine genetischen Läsionen gefunden, die für die inhibierte IRF-4-Transkription verantwortlich sein könnten. Die detektierten Variationen an Position -1081 (T→C-Substitution), an Position -1068 (A→C-Substitution) und Position -116 (T→C-Substitution) finden sich sowohl in IRF-4-positiven als auch in IRF-4-negativen Zelllinien; die letztgenannte Substitution taucht zudem auch bei CML-Patienten in chronischer Phase und in Normalblut von Kontrollpersonen auf. Diese Basenpaarvariationen sind folglich sehr wahrscheinlich nicht die Ursache für die Expressionsunterschiede und stellen eher Polymorphismen dar. Keine der beschriebenen Sequenzänderungen betrifft eine bekannte Transkriptionsfaktorbindungsstelle. Die bei CML-Patienten in vivo nachgewiesene Induzierbarkeit der IRF-4-Expression macht reversible Inhibitionsmechanismen ohnehin wahrscheinlicher. Deshalb wurde der IRF-4-Promotor auf aberrante Methylierung untersucht, welche bereits bei einem anderen IRF, IRF-7, nachgewiesen wurde. Um die Relevanz dieses epigenetischen Mechanismus für die IRF-4-Regulation zu untersuchen, wurden verschiedene Zellinien mit demethylierenden Substanzen behandelt. Die Inkubation mit 5-Aza-2-deoxycytidin zeigte eine konzentrations- und zeitabhängige Aktivierung der IRF-4-Expression, die auf mRNA- und Proteinebene nachgewiesen werden konnte. Um den Methylierungsstatus des IRF-4-Promotors zu bestimmen, wurden ein Restriktions-PCR-Assay sowie die Sequenzierung des Promotors nach Bisulfit-Behandlung durchgeführt. Dabei zeigte sich, dass die IRF-4-negativen Zellinien ein höheres Methylierungslevel aufwiesen als die IRF-4-positiven Zellen und dass die IRF-4-Expression zudem mit dem Methylierungsstatus spezifischer CpGs im Promotor korreliert. Von besonderem Interesse ist dabei die Hypermethylierung einer NFκB-Bindungsstelle in IRF-4-negativen Zellinien. Die Bindung von c-Rel an NFκB-Elemente des Promotors spielt eine wichtige Rolle in der Induktion von IRF-4 und die Methylierung dieses Elements blockiert die Bindung des Transkriptionsfaktors. Ein im Anschluss an diese Arbeit durchgeführter Reporter-Gen-Assay konnte schließlich den inhibierenden Effekt von Methylierung auf den IRF-4-Promotor bestätigen. Die Bisulfit-Sequenzierung von DNA aus peripherem Blut von drei Normalpersonen und drei CML-Patienten in chronischer Phase zeigte keine aberrante Methylierung. Möglicherweise wurden hier jedoch die malignen Zellen im Gesamtblut nicht ausreichend erfasst; hier muss sich die Sequenzierung von sortierten Zellen anschließen. Eine mögliche und bei verschiedenen malignen Erkrankungen nachgewiesene Ursache für aberrante Methylierung ist die Überexpression von DNA-Methyltransferasen (DNMT). Die Expressionsanalyse der DNMTs (DNMT1, DNMT3A, DNMT3B) und Methyl-CpG-Bindungsproteine (MBP) (MBD1, MBD2, MBD4, MeCP) zeigte jedoch keine konsistenten Unterschiede zwischen IRF-4-positiven und –negativen Zellinien, so dass der Hypermethylierung wahrscheinlich andere Mechanismen zugrunde liegen. Zusammenfassend lassen die erhobenen Daten die Schlussfolgerung zu, dass IRF-4-Promotor-Methylierung die IRF-4-Expression reguliert und das die aberrante Expression von IRF-4 in verschiedenen Leukämietypen eine Konsequenz einer IRF-4-Promotor-Hypermethylierung sein könnte. Inwieweit dieser Mechanismus in vivo wirksam ist, muss, beispielsweise durch Analyse von Subpopulationen aus Patientenproben, noch bestimmt werden

Hypermethylierung von E-Cadherin und HIC-1 bei zwei prognostisch verschiedenen AML-Subgruppen

In der vorliegenden Arbeit wurde der Methylierungsstatus von zwei zytogenetisch definierten Formen der akuten myeloischen Leukämie verglichen. Es wurde DNA von sieben Patienten mit t(8;21), die der Niedrigrisikogruppe zugeteilt werden und acht Patienten mit Monosomie 5 bzw.7 oder del(5q) bzw. del(7q), die eine schlechtere Prognose besitzen und der Hochrisikogruppe angehören sowie die DNA von acht nicht an einer malignen Erkrankung leidenden Kontrollpersonen untersucht. Es sollte festgestellt werden, ob sich bestimmte prognostisch divergente AML-Subgruppen bezüglich der Methylierungsfrequenzen oder des Methylierungsphänotyps unterscheiden. Eine semiquantitative Abschätzung des Methylierungsstatus durch PCR-Produkt-Sequenzierung analog Melki et al. war für diesen Zweck jedoch nicht geeignet, so dass eine erheblich arbeits- und kostenintensivere Methode (Klonierung und automatische Sequenzierung) durchgeführt werden musste. Es konnte bei allen AML-Patienten eine signifikant höhere Methylierungsfrequenz als bei den Kontrollpersonen nachgewiesen werden, was bedeutet, dass Methylierung im Sinne einer epigenetischen Alteration offenbar eine Relevanz bei der Entstehung der AML besitzt. Im Unterschied zur vorangehenden Aussage lässt eine Analyse der zytogenetischen Subgruppe jedoch keinen Unterschied in Bezug auf Topographie und Häufigkeit methylierter CpG-Dinukleotide erkennen. Anhand der untersuchten zwei Promotorregionen (E-Cadherin und HIC-1) kann also festgestellt werden, dass aberrante Methylierung bei AML eine häufige Begleiterscheinung ist, aber nach vorläufiger Erkenntnis keine Präferenz zu bestimmten zytogenetischen Risikokonstellationen aufweist. Weitere Untersuchungen zu dieser Frage wären erforderlich, um die pathogenetische Bedeutung von Promotormethylierung bei der AML einzuschätzen und darauf basierend mögliche therapeutische Substanzen, wie z.B. Demethylierungsagenzien für die Behandlung fortgeschrittener Leukämien zu entwickeln

Epigenetik in der Rheumatologie

Zusammenfassung: Die Erbsubstanz aller Lebewesen besteht aus DNA ("desoxyribonucleic acid"). Jede Zelle unseres Körpers enthält die gleiche genetische Ausstattung. In embryonalen Stammzellen ist eine gleichbleibende Anzahl Gene aktiv, und die Zellen sind identisch in ihrem Aufbau und ihrer Funktion. Sobald sich aber unterschiedlich spezialisierte Zellen entwickeln (Differenzierung), unterscheiden sie sich deutlich voneinander, wie z.B. Leber- von den Nervenzellen. Diese Unterschiede gehen nicht auf Änderungen in der Sequenz der DNA zurück, sondern darauf, dass in verschiedenen Zellen unterschiedliche Gene aktiv sind. Das bedeutet, dass ganz gezielt Informationen in der einen Zelle unterdrückt werden müssen, die in anderen wiederum aktiv sind und so verhindert wird, dass z.B. Muskelzellen Haare hervorbringen oder Gehirnzellen Leberenzyme produzieren. Wie kommt es, dass Gene in differenzierten Zellen ein gewebetypisches Set an Genen aktivieren, während sie in anderen Zellen abgeschaltet sind

Funktionelle Untersuchung von genetischen Faktoren mit prognostischer Relevanz in der Onkologie

Lungenkarzinome sind im Vergleich zu anderen Krebsarten die häufigste Todesursache weltweit. Aufgrund der späten Diagnose und einer hohen Rate an Therapieresistenzen liegt die 5-Jahres-Überlebensraten bei nur 13% und ist damit eine der niedrigsten überhaupt. Die Identifikation von potentiellen Biomarkern für eine Verbesserung der Therapieansätze rückt dabei zunehmend in den Vordergrund. Epigenetische Veränderungen spielen bei der Progression von Tumoren eine elementare Rolle, wobei diese mit der Karzinogenese und der Ausprägung einer Therapiereistenz in Verbindung stehen. Epigenetische Modifikatoren wie die H3K4-Methyltransferase KMT2D und das Chromatin-Bindeprotein (Reader) BRD4 sind häufig in verschiedenen Krebsarten wie z.B. in NSCLC mutiert. Im Rahmen dieser Doktorarbeit sollten in verschiedenen Lungenkrebszelllinien unter Verwendung von CRISPR CAS9 definierte Mutationen in den Kandidatengenen KMT2D und BRD4 induziert werden, um funktionelle Mechanismen eingehender zu untersuchen, die mit einer Tumorprogression assoziiert werden. Die Deletionen im Kandidatengen KMT2D unterscheiden sich dadurch, dass bei einer der Deletionen ein Verlust der SET-Domäne erfolgt (Zelllinie B6), wohingegen bei der anderen Deletion das Leseraster C-terminal und damit auch die SET-Domäne erhalten bleibt (Zelllinie A76). In BRD4 wird eine Deletion des gesamten Gens eingefügt. In ChIP-Seq –Analysen der Parental-Zelllinien erfolgte zunächst die Identifikation spezifisch angereicherter Signalwege, die in Prozessen der zellulären Stressantwort, dem Spleißprozess und der epigenetischen Regulation eine Rolle spielten. Zudem konnte eine starke Anreicherung im EGFR-Signalweg festgestellt werden. Um die mögliche Auswirkung der induzierten Mutationen in diesen identifizierten Signalwegen eingehender zu betrachten, wurden diese in Expressions-, Proliferations- und methylierungsspezifischen Experimenten analysiert. Des Weiteren wurde der Einfluss von KMT2D auf eine epigenetisch bedingte Therapieresistenz gegen die EGFR-wirkenden Chemotherapeutika Cetuximab und Erlotinib untersucht. Die induzierten Mutationen führten zu einer verminderten RNA- und Proteinexpression der Kandidatengene. Bei der KMT2D-Zelllinie A76 konnten deutliche morphologische Veränderungen beobachtet werden. Die Zellproliferation war in der Analyse verglichen zur Parental-Zelllinie HCC827 deutlich in den KMT2D-mutierten Zelllinien vermindert. In den Western Blot Analysen führten die induzierten KMT2D- und BRD4-Mutationen zu Veränderung der gesamten Histon-Mengen, die sich in einer differenziellen H3K4- und H3K27-Methylierung in den mutierten Zelllinien widerspiegelten. Durch einen Hitzestress konnte eine Stabilisierung der methylierten Histon-Mengen beobachtet werden. Zudem wurden Unterschiede in der Zellviabilität nach der Induktion durch einen Hitzestress ermittelt. In den BRD4-mutierten Zelllinien konnten hingegen keine Unterschiede in der Zellviabilität nach einem Hitzeschock im Vergleich zur parentalen Zelllinie Wi38 festgestellt werden. Die KMT2D-Mutationen resultierten in einer veränderten RNA-Expression von H3K4- und H3K27-relevanter Methyltransferasen und Demethylasen. Zudem konnten Veränderungen in der Expressionsanalyse von U2 snRNP Spleiß-Faktoren in den KMT2D- und BRD4-mutierten Zelllinien festgestellt werden. Bei der KMT2D-Mutante A76 konnte zudem in Zellviabilitätsassays eine erhöhte Sensitivität gegenüber Cetuximab und Erlotinib beobachtet werden

Die Gene sind nicht alleine schuld : wie wir durch unser Lebensumfeld die Gene prägen können

»Das sind meine Gene – deswegen kann ich daran nichts ändern!« Wie oft hört man solche oder ähnliche Äußerungen von Menschen mit Fettsucht oder anderen Malaisen. Aber unterliegen Fettsucht oder komplexe Erkrankungen tatsächlich weitgehend unabänderlichen Naturgesetzen, oder sind sie doch beeinfl ussbar? Vor einigen Jahren noch hätten selbst gewiefte Genetiker keine oder wenigstens keine gute Antwort auf solche Fragen geben können. Mit dem Fortschreiten der Molekularbiologie in den vergangenen drei Jahrzehnten konnte sich jedoch ein Wissenschaftszweig, die bereits in den 1940er Jahren von Conrad Waddington definierte Epigenetik, zur Blüte entwickeln, der die Genetik und ihre (Aus-)Prägung durch Lebensumstände und die Umwelt zusammenbringt

The role of Dnmts and Tets in shaping the DNA methylation landscape of mouse embryonic stem cells

DNA methylation is an important epigenetic mark, which is set and maintained by DNA methyltransferases (Dnmts) and removed via passive or active mechanisms involving Ten eleven translocation enzyme (Tet) mediated oxidation. Stable cell type specific methylation patterns can only be achieved if methylation and demethylation events are in balance. Yet, the genome wide regulation of Dnmt and Tet activity is still not fully understood. The present studies use novel hairpin sequencing techniques coupled with oxidative bisul te sequencing, which permits the simultaneous and strand speci c detection of 5- methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine. Application of HMM models then facilitates the estimation of enzyme efficiencies for Dnmts and Tets. Furthermore, spatial modelling of hairpin bisulfite data allows the investigation of how Dnmts interpret preexisting methylation patterns. Taken together, the results of the presented studies show that methylation and hydroxylation are antagonistic, but not mutual exclusive events. In this context, the data shows that Tet efficiency is highest at open and accessible chromatin. Furthermore, the absence of Tets leads to a considerable misregulation of Dnmts, resulting in an increase in both maintenance and de novo methylation efficiency. Lastly, the spatial analysis of methylation patterns reveals that the de novo methyltransferases Dnmt3a and 3b depend in their activity on pre-existing neighbouring CpG methylation.DNA Methylierung is eine epigenetische Modifikation, welche durch DNA Methyltransferasen (Dnmts) gesetzt und beibehalten wird. Entfernt wird DNA Methylierung durch aktive oder passive Mechanismen welche die Oxidation von DNA Methylierung durch Ten- Eleven Translocation Enzyme (Tets) involviert. Stabile, Zelltyp-spezifische Methylierungsmuster können nur erreicht werden, wenn Methylierungs- und Demethylierungsvorgänge im Gleichgewicht sind. Dennoch ist die genomweite Regulation von Dnmts und Tets nicht vollständig geklärt. Die hier gezeigten Studien verwenden neue Hairpin-Sequenzierungs-Verfahren, gekoppelt mit oxidativer Bisulfit-Sequenzierung, was eine simultane und strangspezifische Analyse von 5-Methylcytosin und 5-Hydroxymethylcytosin erlaubt. Die Anwendung von hid- den Markov Modellen erlaubt im Anschluss die Berechnung von Enzymeeffizienzen für Dnmts und Tets. Darüber hinaus erlaubt eine räumliche Modellierung von Methylierungsmustern die Untersuchung, wie Dnmts bereits bestehende Methylierung interpretieren. Die Ergebnisse zeigen, dass Methylierung und Hydroxylierung antagonistische, aber keinesfalls sich ausschließende Ereignisse sind. Dabei zeigen Tets ihre stärkste Aktivität an offenem und zugänglichem Chromatin. Zudem führt der Verlust von Tets zu einer deutlichen Missregulation von Dnmts, welche sich durch eine Zunahme der Maintenance und de novo-Methylierungseffizienz äußert. Schließlich zeigt die räumliche Modellierung, dass die de novo-Methyltransferasen bei ihrer Aktivität abhängig von bereits bestehender DNA Methylierung sind

Chemotherapie von Hirntumoren bei Erwachsenen

Zusammenfassung: Die Chemotherapie hat sich zu einer wesentlichen Säule der Hirntumortherapie entwickelt. Ihr Stellenwert in der Therapie der Gliome ist nicht mehr nur auf die Rezidivtherapie beschränkt. Die Chemotherapie mit Temozolomid ist heute Standard in der Primärtherapie des Glioblastoms. Zur Optimierung der Chemotherapie werden derzeit zahlreiche große Studien durchgeführt, die sich auf den Nachweis einer Methylierung der Promoterregion des MGMT-Gens und eines Verlusts genetischen Materials auf den Chromosomenabschnitten 1p und 19q stützen. Außerhalb solcher Studien wird die Chemotherapie sowohl als Zusatztherapie als auch als Alternative zur Strahlentherapie vor allem bei anaplastischen oligodendroglialen Tumoren und niedriggradigen Gliomen eingesetzt. Primäre Lymphome des Zentralnervensystems sind vermutlich die einzigen Hirntumoren, die mit alleiniger Chemotherapie kurativ behandelt werden können. Bei Hirnmetastasen folgen die Konzepte für die Chemotherapie der für den jeweiligen Primärtumor indizierten Chemotherapie. Zudem werden Strategien der kombinierten Radiochemotherapie mit Temozolomid und mit Topotecan verfolgt. Bei der Meningeosis neoplastica werden je nach Ausbreitungsmuster der Tumorerkrankung Strahlentherapie, systemische Chemotherapie und intrathekale Chemotherapie kombinier

Sequelae of early trauma from a neurobiological perspective

Childhood trauma is one of the most well-established risk factors for the development of mental disorders. Due to the availability of new technologies, we are now beginning to understand how early trauma gets under the skin and exerts a sustained influence on various domains of psychological functioning and health. In the present review we will first briefly summarize what is currently known about the neurobiological effects of childhood trauma. We will then consider genetic and epigenetic factors as possible mechanisms mediating the biological embedding of childhood trauma.Der Zusammenhang zwischen frühen Traumatisierungen in der Kindheit und einem erhöhten psychischen Erkrankungsrisiko ist in der Fachliteratur seit Langem gut belegt. Erst in den letzten Jahren beginnen wir aufgrund technologischer Fortschritte zu verstehen, wie frühe Traumatisierungen körperlich niedergeschrieben werden und sich so ein Leben lang auf verschiedene Aspekte unseres Verhaltens und Erlebens auswirken können. In der vorliegenden Übersicht wird zunächst der aktuelle Erkenntnisstand zu den neurobiologischen Auswirkungen von Kindheitstraumata kurz zusammengefasst. Danach werden genetische und epigenetische Faktoren als mögliche Mechanismen der biologischen Einbettung betrachtet

"Dexamethason und Selenige Säure als Beispiele für ultraschnell wirksame direkte Radikalfänger: Quantenpharmakologische Untersuchungen

Ziel der Arbeit ist die Darstellung einer nicht-enzymatischen, direkten und ultraschnellen Entsorgung pathophysiologisch hochreaktiver Sauerstoffradikale. Dazu wird dem klassischen Wirkstoff Dexamethason vergleichend Selenige Säure (aus Natriumselenit) gegenübergestellt. Medizinisch werden akute und konventionell kaum behan delbare Entzündungsvorgänge sowie schwere Verbrennungen, Rauchvergiftungen und Belastungen durch radioaktive Noxen akut-präventiv und therapeutisch zugänglich. Quantenpharmakologische ab initio und Dichtefunktional-Methoden erweisen sich als effektive Möglichkeit bei wissenschaftlich hoher internationaler Reputation die konventionelle Medizin um neue Arbeitsfelder zu bereichern und ferner, um erhebliche Kosten bei der Entwicklung neuartiger Therapieprinzipien einzusparen