EFEITO DAS CITOCININAS NA MULTIPLICAÇÃO DE PLANTULAS DE Epidendrum secundum Jacq. (ORCHIDACEAE) OBTIDAS in vitro

Orchidaceae Juss. é uma das maiores famílias dentre as angiospermas, com estimativa de aproximadamente 24.000 espécies. O gênero Epidendrum tem grande importância ornamental, mas produtores deste encontram problemas, como custos elevados e lenta taxa de propagação sexual e vegetativa para a produção em larga escala. O cultivo in vitro tem sido utilizado para aumentar a produção de mudas de alta qualidade genética e para redução de custo deprodução. Epidendrum secundum Jacq. representa uma das mais populares espécies de Orchidaceae que impulsionando o agronegócio florícola nacional, pois é amplamente comercializada como flor de corte e de vaso, além de ser utilizada na produção de híbridos. Ascitocininas são substâncias reguladoras do crescimento, no meio de cultura são indispensáveis para o desenvolvimento de gemas. O presente trabalho visou avaliar a germinação in vitro de sementes de E. secundum efeito das citocininas na multiplicação e a aclimatização de plântulas obtidas in vitro. Com os resultados obtidos conclui-se que o meio (A) Knudson modificado Arditti é o mais favorável no processo de germinação e desenvolvimento inicial de plântulas de E secundum; maior brotação ocorre em tratamentos com concentrações intermediárias de BAP, por volta de 5 mg/L.; a fibra de coco como substrato favorece a transferência de plântulas de E. secundum desenvolvidas in vitro

Efeito do extrato da macroalga kappaphycus alvarezii no cultivo in vitro de epidendrum secundum Jacq

Orquídeas são plantas da família Orchidaceae, que compreende diversas espécies epífitas, rupículas e terrícolas, muitas ameaçadas de extinção. Essas espécies apresentam baixas taxas de germinação na natureza devido à ausência de reservas nutritivas na semente, sendo a propagação in vitro uma alternativa aplicável para otimizar o processo germinativo e a posterior formação de plântulas. Assim, o presente trabalho buscou otimizar as condições de cultivo in vitro de plântulas de Epidendrum secundum através da suplementação com diferentes concentrações de extrato obtido a partir da macroalga Kappaphycus alvarezii. Sementes de E. secundum foram germinadas in vitro e as plântulas obtidas foram cultivadas em meio de cultura MS, com a concentração de sais reduzido pela metade (MS/2), suplementado com 3% de sacarose e diferentes concentrações do extrato: 0, 6, 12, 25, 50, 100 mg L-1. Como resultados do cultivo in vitro, observou-se que a presença do extrato de K. alvarezii estimulou de forma crescente o desenvolvimento das plântulas, proporcionalmente ao aumento da concentração, exceto na maior concentração testada (100 mg L-1), onde demonstrou um efeito deletério. Das concentrações testadas, o tratamento com 50 mg L-1 apresentou os melhores resultados, favorecendo significativamente o aumento das plântulas, número e comprimento das folhas e raízes, ganho de massa fresca e número de brotos formados.. Com isso, o uso do extrato de K. alvarezii indica potencial de aplicação como um composto natural bioativo no cultivo in vitro de E. secundum devido ao seu notório efeito bioestimulante na morfogênese in vitro desta espécieFil: Amatuzi, Julio César de Araujo. Universidad Federal de Paraná (Brasil)Fil: Hayashi, Leila. Universidad Federal de Paraná (Brasil)Fil: Vieira, Leila do Nascimento. Universidad Federal de Paraná (Brasil)Fil: Fraga, Hugo Pacheco de Freitas. Universidad Federal de Paraná (Brasil

Orchidaceae Flora of Joinville, Santa Catarina, Brazil

The objective of this work was to conduct a floristic study of Orchidaceae in the municipality of Joinville (Santa Catarina, Brazil), which occurred from 2006 to 2015. The municipality is mainly covered with Atlantic Forest between 0 and 1,335 m elevation. For the family, 211 species within 90 genera were recorded. The richest genera are Epidendrum (17 spp.), Pabstiella (15 spp.), Acianthera (14 spp.), Anathallis (8 spp.) and Octomeria (8 spp.). The majority of the species are epiphytes (82%), 11% are terrestrial, and the remaining 7% are hemi-epiphytes, rupicolous or myco-heterotrophic. Two species, Grobya guiselii and Homalopetalum joinvillense, are known only from Joinville.Keywords: Atlantic Forest; Floristic; Orchids; South Brazilian

Efeito de extratos de algas marinhas na morfogênese in vitro de Epidendrum secundum Jacq.

Orientador: Hugo Pacheco de Freitas FragaCoorientador: Leila do Nascimento VieiraDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Botânica. Defesa : Curitiba, 27/08/2018Inclui referências: p.49-53Resumo: Orquídeas compreendem uma das maiores famílias de angiospermas e são espécies de alto interesse econômico e ecológico. Muitas dessas espécies encontram-se sob ameaça de extinção por conta do extrativismo e fragmentação das suas áreas de ocorrência natural. Em geral, as sementes de orquídeas apresentam baixas taxas de germinação na natureza devido à escassez de reservas nutritivas na semente e necessidade de interação com fungos micorrízicos. A propagação in vitro é uma alternativa para otimizar o processo germinativo e a posterior formação de plântulas. Assim, o presente trabalho buscou otimizar as condições de cultivo in vitro de plântulas da orquídea Epidendrum secundum através da suplementação com diferentes concentrações de extrato aquoso das algas marinhas Kappaphycus alvarezii e Ulva fasciata. Sementes de E. secundum foram germinadas in vitro e as plântulas obtidas foram inoculadas em meio de cultura MS/2 suplementado com sacarose 30 g L- 1 e diferentes concentrações dos extratos de algas: 0, 6, 12, 25, 50, 100 mg L-1. Após 90 dias de cultivo foram realizadas análises morfoanatômicas e quantificação de poliaminas (PAs) livres nas plântulas, além verificar as taxas de sobrevivência durante a aclimatização. Além disso, foi realizada a caracterização bioquímica do extrato de K. alvarezii através de ressonância magnética nuclear (RMN). Enquanto o extrato de U. fasciata parece ter exercido um efeito inibitório sobre o desenvolvimento das plântulas de E. secundum, a presença do extrato de K. alvarezii estimulou seu desenvolvimento de forma proporcional ao aumento da concentração, exceto em 100 mg L-1, que demonstrou efeito deletério. O tratamento com 50 mg L-1 apresentou os melhores resultados, favorecendo o aumento das plântulas, comprimento das folhas e raízes, ganho de massa fresca e número de brotos formados. A anatomia dos ápices radiculares nos tratamentos 0 e 50 mg L-1 de extrato indicou características anatômicas bastante semelhantes. O tratamento 100 mg L-1 indicou alterações no grau de diferenciação celular, mostrando células com hipertrofia e menos diferenciadas. Embora a lâmina foliar dos tratamentos 0 e 100 mg L-1 apresentasse epiderme bem organizada, o mesofilo mostrou células do parênquima grandes e mal organizadas, sem feixes de fibras. Em contraste, o tratamento com 50 mg L-1 mostrou mesofilo mais compacto com células bem organizadas e diversos feixes de fibras. A quantificação de PAs livres indicou a presença de espermidina e uma diminuição da putrescina conforme o aumento na concentração do extrato. Na aclimatização, observou-se maior taxa de sobrevivência entre as plântulas que foram propagadas na presença do extrato de K. alvarezii. A análise de RMN indicou no extrato a presença dos glicosídeos digeneasídeo e floridosídeo, descritos como osmorreguladores. O uso do extrato de K. alvarezii indica potencial aplicação como um composto bioativo no cultivo in vitro de E. secundum devido ao seu efeito bioestimulante na morfogênese e podendo, assim, acelerar o desenvolvimento dessa e outras espécies ameaçadas de extinção para sua posterior reintrodução na natureza. PALAVRAS-CHAVES: micropropagação, cultura de tecidos, orquídeas, atividade bioestimulante, macroalgas.Abstract: Orchidaceae is one of the largest families of angiosperms and are species of high economic and ecological interest. Many of these species are under threat of extinction due to the extractivism and fragmentation of their naturally occurring areas. In general, orchid seeds have low germination rates in nature due to the scarcity of nutrient reserves in the seed and the need of interaction with mycorrhizal fungi. In vitro propagation is an alternative to optimize the germination process and the subsequent plantlet development. Thus, the present studty aimed to optimize the in vitro culture conditions of Epidendrum secundum plantlets through supplementation with different concentrations of aqueous extract of the seaweeds Kappaphycus alvarezii and Ulva fasciata. Seeds of E. secundum were in vitro germinated and the plantlets obtained were inoculated in MS/2 culture medium supplemented with sucrose 30 g L-1 and different concentrations of seaweed extracts: 0, 6, 12, 25, 50, 100 mg L-1. After 90 days of culture, morphohystological analysis and quantification of free polyamines (PAs) in the plantlets were performed, besides evaluating the survival rates during acclimatization. In addition, the biochemical characterization of the extract through nuclear magnetic resonance (NMR) was performed. While the extract of U. fasciata indicated an inhibitory effect on the development of E. secundum plantlets, the supplementation of K. alvarezii extract stimulated its development proportionallly to the increasing the concentration, except in 100 mg L-1 treatment, which showed deleterious effects. The treatment with 50 mg L-1 showed the best results, favoring plantlet growth, increased leaf and root length, fresh weight gain and number of buds formed. The anatomy of root apices in 0 and 50 mg L-1 treatments indicated very similar anatomical characteristics. The 100 mg L-1 treatment indicated changes in the degree of cell differentiation, showing cells with hypertrophy and less differentiated. Although the foliar leaf of treatments 0 and 100 mg L-1 presented organized epidermis, the mesophyll showed large and poorly organized parenchyma, without fiber bundles. In contrast, treatment with 50 mg L-1 showed a more compact mesophyll with well organized cells and several fiber bundles. Free PAs quantification indicated the presence of spermidine and a decrease of putrescine as the concentration of the extract increased. In acclimatization, a higher survival rate was observed among the plantlets that were propagated in the presence of K. alvarezii extract. NMR analysis indicated the presence of glycosides with osmoregulatory function in the K. alvarezii extract. The use of K. alvarezii extract indicates potential application as a bioactive compound in the in vitro culture of E. secundum due to its biostimulating effect on morphogenesis and can thus accelerate the development of this and other endangered species for later reintroduction into nature. KEYWORDS: micropropagation, tissue culture, orchids, biostimulant activity, macroalgae

Extraction and amplification of DNA from orchid exsiccates conserved for more than half a century in a herbarium in Bogotá, Colombia

Los tejidos vegetales provenientes de muestras de herbario contienen ADN que ha sufrido degradación post-mortem. Solo pequeñas cantidades de material genético eventualmente degradado, libre de químicos e impurezas, puede ser extraído de dichas muestras. El presente trabajo buscó comparar y determinar cuál de los tres protocolos de extracción seleccionados, que habían sido publicados previamente para ADN vegetal, permitía extraer ADN de buena calidad, susceptible de ser amplificado y secuenciado, a partir de exsicados de orquídeas conservadas en herbario hasta por 63 años. De los protocolos evaluados, el más eficaz permitió obtener y secuenciar productos amplificados en 6 de las 7 muestras estudiadas, con las mejores relaciones de pureza ADN / proteína.Q2121-129Plant tissue from herbarium specimens contains DNA that has undergone post-mortem degradation. Only small amounts of possibly degraded genetic material free of chemicals and impurities can be extracted from these samples. The aim of the present work was to compare and determine which one of three previously published plant DNA extraction protocols would extract good quality DNA from orchid herbarium specimens stored up to 63 years, susceptible of PCR amplification and Sanger sequencing. The most effective protocol for this type of samples allowed us to obtain and sequence amplified products in 6 of the 7 samples studied with an optimal DNA / protein purity relationship

Banco de sementes e sistemas de propagação in vitro como estratégia de conservação para Bulbophyllum peri Schlt. e Epidendrum secundum Jacq.

Resumo: Neste trabalho o objetivo principal foi estabelecer estratégias de conservação ex situ para as espécies Epidendrum secundum e Bulbophyllum peri. Sementes sem armazenamento e armazenadas a -20°C por quatro, oito e doze meses, de ambas as espécies, tiveram suas viabilidades testadas por meio de testes de germinação in vitro em quatro meios de cultura (MS, MS/2, WPM e KC). Para E. secundum também foram testadas concentrações de BAP (0,55; 1,10 e 2,20 ?M) no meio KC e para B. peri foi testado pré-resfriamento das sementes sem armazenamento por 21 dias a 8°C. Após subcultivos em meio WPM, as plântulas se desenvolveram e foram aclimatizadas em três substratos: Plantmax florestal® e vermiculita (1:2), sphagnum e fibra de coco (2:1) e carvão e fibra de coco (2:1). O melhor meio de cultura foi o WPM para ambas as espécies. As sementes sem armazenamento de E. secundum apresentaram 100% de germinação em meio WPM e à medida que as sementes foram armazenadas houve perda da viabilidade, constatada pela redução da germinação (73,8% após doze meses) e redução dos índices de crescimento e de velocidade de germinação. No melhor meio de cultura (WPM) as sementes sem armazenamento de B. peri praticamente não germinaram (7%). Quando submetidas ao pré-resfriamento, a germinação aumentou (40%), porém, a melhor porcentagem de germinação (56,5%) foi encontrada após quatro meses de armazenamento, ocorrendo diminuição da viabilidade após oito e doze meses. Foi constatado que não é necessário adicionar BAP para a germinação de E. secundum e que B. peri apresenta dormência que pode ser superada pelo tratamento de pré-resfriamento. Na fase de aclimatização o melhor substrato para ambas as espécies foi Plantmax florestal® e vermiculita (1:2), que proporcionou maior porcentagem de sobrevivência para E. secundum (100%) e B. peri (35%). Para a indução de estruturas semelhantes à protocormos destas espécies, foram utilizadas folhas jovens e mais velhas e protocormos sem o ápice foliar. Os explantes foram inoculados em meio WPM com concentrações de BAP (entre 1 e 40 ?M de BAP) e diferentes regimes de luz (escuro ou metade do tempo de cultivo no escuro seguido de fotoperíodo 16 horas). Em ambas as espécies os explantes mais responsivos foram os protocormos sem o ápice, seguidos das folhas mais jovens e folhas mais velhas. Para B. peri, após 90 dias de cultivo, as folhas foram pouco responsivas, sendo que os melhores resultados para folhas jovens (6% de explantes com formação de estruturas semelhantes a protocormos (ESPs) e uma média de 5,0 por explante) ocorreram na concentração de 5 ?M de BAP e no regime de escuro, seguido de fotoperiodo de 16h e dos protocormos (94% de explantes responsivos e 5,9 ESPs por explante) foi com a concentração de 20 ?M de BAP. Para a espécie E. secundum após 60 dias os resultados foram melhores, as folhas mais novas formaram 2,0 ESPs por explante e cerca de 70,4% dos explantes foram responsivos na concentração de 1 ?M de BAP, em regime de escuro, seguido de fotoperíodo de 16 horas. Para os protocormos a melhor concentração foi de 1 ?M de BAP com 100% de explantes responsivos e 4,4 ESPs por explante. A multiplicação in vitro foi eficiente a partir de protocormos, com a adição de BAP ao meio de cultura.A análise anatômica demonstrou a regeneração direta dos ESPs a partir de camadas epidérmicas e sub-epidérmicas. Bancos de sementes destas espécies são indicados para a conservação ex vitro, porém mais testes devem ser realizados em relação ao tempo de armazenamento superior a doze meses e temperaturas abaixo de -20°C

Mecanismos de Evolução Cariotípica em Epidendrum L. (Orchidaceae: Epidendroideae)

The genus Epidendrum L. comprises approximately 1,500 species of exclusively neotropical distribution, with frequent occurrence of hybridization, polyploidy and asexual reproduction. In addition, some species show complex taxonomy, such as E. secundum, which shows extensive chromosome number variation. This study aimed to test the hypotheses about the causes of chromosome number variability in E. secundum; to investigate the hybrid origin in representatives with intermediate floral morphology between E. flammeum x E. secundum, and between E. xanthinum x E. secundum; and to analyze the heterochromatin diversity and DNA content in species belonging to the subgenus Amphiglottium and Epidendrum. To this end, we performed the quantification of nuclear DNA content by flow cytometry, analysed the heterochromatin distribution using CMA/DAPI fluorochrome banding, and performed the analysis of floral morphology on representatives found in hybridization zones. Mitotic analyzes showed different chromosome counts ranging from 2n = 24 in E. fulgens to 2n = 224 in E. cinnabarinum, with metacentric, submetacentric and acrocentric chromosomes in all species. CMA+/DAPI¬ pericentromeric and terminal chromosome regions, and some CMA¬/DAPI+ and CMA0 terminal regions were identified, with variation in size, number and position. Pericentromeric regions generally was CMA0/DAPI¬ in most species. The leaf tissues of all specimens examined presented one or two endoreduplication cycles. To 18 populations of E. secundum analyzed, 16 presented diploid individuals, with an average of 2C = 4.08 pg DNA, and in two populations were identified tetraploid individuals, with an average of 2C = 8.24 pg DNA. In some populations were identified cytotypes with B chromosomes in variable number, sometimes entirely CMA+/DAPI¬. In relation to putative hybrid analysis, three hybrid zones were investigated. In São João do Tigre (PB), E. flammeum presented 2n = 50 and 2C = 5.04 pg DNA, E. secundum presented 2n = 62 chromosomes and 2C = 4.82 pg DNA. Hybrid individuals had 2n = 56, with 2C = 4.63 pg DNA. In Nova Friburgo (RJ), E. xanthinum presented 2n = 28 with 2C = 4.48 pg DNA. The specimens of E. secundum in this population presented 2n = 56 and 2C = 3.68 pg DNA. The putative hybrids presented 2n = 42 with 2C = 4.37 pg DNA. The Principal Component and Cluster Analysis confirmed the intermediate nature of floral morphology among putative hybrids and possible parents. Despite the occurrence of different chromosome numbers in E. secundum, populations showed no significant DNA content variation by Tukey test, suggesting that the increase in the number of acrocentric chromosomes is mainly caused by centric fissions. High levels of reproductive compatibility suggest that hybridization and introgression are important in early stages of speciation in Epidendrum. Karyological diversification observed seems related to disploid and polyploid events, whose changes in fundamental number may be the result of complex intra and intergenomic reorganizations.O gênero Epidendrum L. é composto por aproximadamente 1.500 espécies de distribuição exclusivamente neotropical, sendo frequente a ocorrência de hibridação, poliploidia e reprodução assexuada. Além disso, algumas espécies apresentam taxonomia complexa, como em E. secundum, que apresenta ampla variação cromossômica numérica. O presente trabalho objetivou testar as hipóteses sobre as causas da variabilidade cromossômica numérica em E. secundum, investigar a origem híbrida em indivíduos com morfologia floral intermediária entre E. flammeum x E. secundum, e entre E. xanthinum x E. secundum, bem como analisar a diversidade de heterocromatina e conteúdo de DNA em espécies pertencentes aos subgêneros Amphiglottium e Epidendrum. Para tanto, realizou-se a quantificação de DNA nuclear através de citometria de fluxo, análise da distribuição da heterocromatina através do bandeamento com fluorocromos CMA/DAPI, e para os representantes encontrados nas zonas de hibridação, realizou-se também a análise da morfometria floral. As análises mitóticas apresentaram diferentes contagens cromossômicas que variaram de 2n = 24 em E. fulgens até 2n = 224 em E. cinnabarinum, com cromossomos metacêntricos, submetacêntricos e acrocêntricos em todas as espécies. Foram identificadas regiões cromossômicas terminais e pericentroméricas CMA+/DAPI¬, algumas regiões terminais CMA¬/DAPI+ e CMA0, de tamanho, número e posição variáveis. As regiões pericentroméricas geralmente apresentaram-se CMA0/DAPI¬ na maioria das espécies. Os tecidos foliares de todos os espécimes analisados apresentaram um ou dois ciclos de endoreduplicação. Para as 18 populações de E. secundum analisadas, 16 apresentaram indivíduos diploides, com em média 2C = 4,08 pg DNA, e em duas populações foram identificados indivíduos tetraploides, com em média 2C = 8,24 pg DNA. Em algumas populações foram identificados citótipos com cromossomos B em número variável, algumas vezes inteiramente CMA+/DAPI¬. Em relação às análises dos possíveis híbridos, três zonas de hibridação foram investigadas. Em São João do Tigre (PB), E. flammeum apresentou 2n = 50 e conteúdo de DNA 2C = 5,04 pg DNA, E. secundum apresentou 2n = 62 cromossomos e 2C = 4,82 pg DNA. Indivíduos híbridos apresentaram 2n = 56, com 2C = 4,63 pg DNA. Em Nova Friburgo (RJ), E. xanthinum apresentou 2n = 28 com 2C = 4,48 pg DNA. Os espécimes de E. secundum nesta população apresentaram 2n = 56 e 2C = 3,68 pg DNA. O provável híbrido apresentou 2n = 42 com 2C = 4,37 pg DNA. A Análise de Componentes Principais e de Agrupamento confirmaram a natureza intermediária dos caracteres morfológicos florais entre os possíveis híbridos e os prováveis parentais. Apesar da ocorrência de números cromossômicos discrepantes em E. secundum, as populações não apresentaram conteúdos de DNA com variações significativas pelo teste de Tukey, sugerindo que o aumento no número de cromossomos acrocêntricos é principalmente originada por fissões cêntricas. Altos níveis de compatibilidade reprodutiva sugerem que a hibridação e a introgressão são importantes para os estágios iniciais de especiação em Epidendrum. A diversificação cariológica observada parece relacionada a eventos de disploidia e poliploidia, cuja alteração no número fundamental pode ser o resultado de reorganizações intra e intergenômicas complexas

An Overview: Effect of Plant Growth Regulatory on Orchid Propagation through The Thin Cell Layer technique

Thin cell layer (TCL) is a micropropagation method using thin-sized explants. A TCL can be prepared from any explant source and the thichness of explant less than 5 mm. TCL is more efficient in producing total plantlet output than conventional in vitro methods. TCL have been applied to the in vitro culture of orchids, field, vegetable crops and medicinal plants The successful in vitro orchid propagation is influenced by many factors, such as plant genotype and media composition. Additions of plant growth regulator (PGR) in media culture is essential factor. The formation of complete plant depent on concentration and type of plant growth regulator. TCL explants require growth regulators to form an embryonic callus and zygotic embryos. Explant in medium without supplemented of growth regulators resulted in browning and failed to grow. The most commonly plant growth regulator in tissue culture are thidiazuron (TDZ), 6-benzylaminopurine (BAP) 2,4 dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), α-naphthaleneacetic acid (NAA), and meta-Topolin. Recently, microalgae can also be used as an alternative source of hormones to increase plant growth through in vitro culture technique

Diversidad táxica y filogenética del género Epidendrum L. (Orchidaceae) en dos ecosistemas del Área de Conservación Privada “Pampa Del Burro”, Amazonas-Perú.

Epidendrum L. es el género más diverso de la familia Orchidaceae, con una riqueza actual de 491 especies para Perú. Se distribuye en varias regiones ecológicas, con un elevado registro de especies endémicas principalmente en las regiones de Amazonas, Apurímac, Ayacucho, Cajamarca, Cusco, Junín, Puno y San Martín. Se han abordado diversos estudios relacionados a la diversidad táxica sin embargo, ha sido poco estudiado en relación a la diversidad filogenética. En la presente investigación se evaluó la diversidad táxica y filogenética del género Epidendrum L. en dos ecosistemas diferentes; el bosque achaparrado de arena blanca y el bosque montano húmedo, en el Área de Conservación Privada Pampa del Burro, Bongará, Amazonas. La colecta de los ejemplares se realizó mediante el método de recorridos prolongados, en transectos lineales. La identificación y descripción de las especies se basaron en los registros fotográficos, flores conservadas en alcohol y muestras secas que fueron depositadas en el Herbario KUELAP. La diversidad táxica se evaluó empleando los índices de diversidad de Simpson, Alfa de Fisher, Shannon, Dominancia y Equitatividad, los que determinaron que el bosque de arena blanca es el ecosistema más diverso respecto al bosque montano húmedo. La diversidad filogenética se evaluó mediante el índice de Faith y la función de phylosor de la biblioteca Picante implementada en R. Al sumar la longitud de las ramas evolutivas de los ecosistemas se determinó que el bosque montano húmedo tiene una mayor diversidad que el bosque de arena blanca