Clonagem e expressão das enzimas heterólogas xilose redutase e xilitol desidrogenase em Saccharomyces cerevisiae e análise do consumo de xilose por linhagens recombinantes

TCC(graduação) - Universidade Federal de Santa Catarina. Centro de Ciências Biológicas. Biologia.O biocombustível tornou-se uma alternativa ao uso do petróleo. Nesse cenário o Brasil apostou no etanol. Industrialmente, sua produção acontece através do processo de fermentação alcóolica pela levedura Saccharomyces cerevisiae em matéria vegetal, como a cana-de-açucar (Saccharum spp.). Porém, a levedura não apresenta o metabolismo necessário para fermentar pentoses, como a xilose, um dos carboidratos mais abundantes em matéria lignocelulósica. Investigando leveduras que fermentam xilose, encontramos um processo de redução e oxidação mediado pelas enzimas Xilose Redutase (XR) e Xilitol Desidrogenase (XDH). Portanto, uma maneira de aumentar a produção de etanol no país, sem aumentar a área plantada de cana-de-açucar, é a criação de linhagens de S. cerevisiea transformantes com as enzimas supracitadas. Para isso, buscamos as enzimas com maior atividade entre as espécides fermentadoras de xilose, chegando as seguintes duas espécies: Spathaspora arborarie e Spathaspora passalidarum. Sendo que a enzima XR de S. arborarie, além de apresentar alta atividade, apresenta atividade com dois cosubstratos, NADPH e NADH. Já a enzima XDH de S. passalidarum apresentou a maior atividade entre as enzimas XDH já descritas, e uma dependência do cosubstrato NAD+. O uso conjunto das enzimas é interessante pela reciclagem dos cosubstratos. Portanto, nesse trabalho, buscamos criar um plasmídeo com um forte promotor constitutivo PGK para XR e TEF para XDH com a intenção de transformar o organismo S. cerevisiae para futura produção de etanol a partir de xilose. Além disso, estudos de engenharia genética demonstraram um efeito positivo da deleção do gene PHO13 de S. cerevisiae, já que essa mudança parece aumentar a expressão de enzimas da Via Glicolítica e da Via das Pentoses Fosfato. Por isso, utilizamos linhagens recombinantes pho13∆ com expressão das enzimas heterólogas supracitadas e comparamos seu perfil fermentativo com linhagens com a mesma expressão de enzimas, porém não pho13∆. Como resultado, percebemos que a expressão das enzimas permite o consumo de xilose, porém percebemos pouca produção de etanol. A linhagem pho13∆ se torna vantajosa em fermentação com alta densidade de xilose, 10%, produzindo o dobro de etanol da linhagem não pho13∆

Enzimas amilolíticas exógenas en la alimentación de rumiantes

Recientemente, las enzimas exógenas se están usando para mejorar la degradabilidad ruminal de la fibra dietaria y del almidón presente en los alimentos utilizados en la alimentación de rumiantes. Estas enzimas representan una alternativa para incrementar la productividad y reducir los costos por alimentación, ya que se podría reducir el uso de granos, debido al mayor aporte de energía que realizarían los sustratos fibrosos. La actividad amilolítica de los microorganismos ruminales se da principalmente por la acción de enzimas extracelulares, las que en cocultivo han manifestado su máximo potencial para digerir el almidón. Diversas investigaciones han demostrado que la digestión ruminal del almidón es incompleta y más para aquellos granos de tasas de digestión lenta como el sorgo. Esta digestión incompleta es el resultado de la interacción entre las características del almidón (tipo de grano), condiciones fisicoquímicas del rumen y las enzimas amilolíticas microbiales. Las enzimas exógenas, producto de la biotecnología, actúan en intervalos amplios de pH (4 - 9) y temperatura (30 - 90 C), las cuales podrían actuar sinérgicamente con las bacterias microbiales del rumen e incrementar la degradabilidad ruminal del almidón. Los avances en el uso de enzimas amilolíticas exógenas para incrementar el aprovechamiento del valor energético de los granos utilizados en la elaboración de alimentos para rumiantes, es una excelente alternativa para mejorar la producción animal

Efeito de Enzimas Fibrolíticas e do Teor de Matéria Seca em Silagens de Capim-Tanzânia sobre os Parâmetros Ruminais, o Comportamento Ingestivo e a Digestão de Nutrientes, em Bovinos.

Objetivou-se, com este trabalho, avaliar o efeito do emurchecimento e uso de enzimas fibrolíticas aplicadas durante a ensilagem de capim-tanzânia (Panicum maximum Jacq. cv. Tanzânia) ou antecedendo o fornecimento aos animais. Foram realizadas avaliações de parâmetros de fermentação e cinética ruminal, comportamento ingestivo, consumo voluntário e digestibilidade dos nutrientes em bovinos. Os tratamentos utilizados consistiram da ensilagem das forragens, conforme descrito: A - forragem emurchecida sem aplicação de enzimas; B - não-emurchecida sem aplicação de enzimas; C - emurchecida com aplicação de enzimas (2 L/t de massa verde); D - não-emurchecida com aplicação de enzimas e E - não-emurchecida com enzimas (10 L/t de massa verde) aplicadas após a abertura do silo e antes da oferta aos animais. Cinco novilhos da raça Nelore foram distribuídos ao acaso em delineamento do tipo quadrado latino 5 x 5, recebendo rações contendo 50% de silagem na MS. Os parâmetros de cinética de passagem de sólidos (2,23%/hora) e de líquidos (4,83%/hora) foram similares nos tratamentos avaliados. As médias das concentrações molares totais dos AGVs (109,62 mM) e de nitrogênio amoniacal (5,6 mg/dL) do fluido ruminal não foram alteradas. O emurchecimento da forragem determinou menor relação C2:C3 ruminal. O comportamento ingestivo dos animais não foi alterado com a adição de enzimas fibrolíticas na ensilagem, sendo observados os seguintes tempos (minutos/dia) e taxas (min/kg MSI): ingestão de MS (247 e 24), ruminação (426 e 43) e mastigação (673 e 67), respectivamente. No caso do emurchecimento, houve menor tempo de ruminação e de mastigação pelos animais. As digestibilidades médias de MS (47,5 vs. 53,6%), de FDN (45,8 vs. 55%) e de FDA (45,5 vs. 54,8%) foram reduzidas nas rações completas contendo silagens emurchecidas. O emurchecimento da forragem e o uso de aditivo enzimático resultaram em alterações marginais nos parâmetros ruminais e no comportamento ingestivo dos animais

Utilización de enzimas fibrolíticas para mejorar la digestión de forrajes tropicales. II. Efectos en la fermetación ruminal in vitro y la degradabilidad

En muchos países tropicales los sistemas productivos de animales rumiantes se basan en una amplia utilización de recursos forrajeros. Sin embargo, estos recursos suelen tener una baja calidad, por lo que cualquier mejora de su valor nutritivo tendrá una repercusión positiva en la productividad de los animales. En los últimos años se han realizado numerosos estudios para evaluar diferentes enzimas fibrolíticas como aditivos para mejorar el valor nutritivo de forrajes, pero la mayoría de ellos han utilizado forrajes de elevada calidad y apenas existen estudios con forrajes de baja calidad. Por otra parte, los resultados han sido muy variables, ya que la efectividad de las enzimas se ve afectada por numerosos factores, siendo el tipo de forraje y el método de aplicación de las enzimas dos de los más importantes (Giraldo et al., 2008). El objetivo del presente estudio fue evaluar el efecto de tres enzimas fibrolíticas exógenas en la fermentación ruminal in vitro de tres forrajes tropicales cuando las enzimas se aplicaron 24 h antes o en el momento de la incubación

Atualidades e tendências no uso de enzimas na nutrição de aves.

É incontestável a consolidação do uso de enzimas nos sistemas de produção de aves e suínos, especialmente na área de nutrição. Apesar dos intensos avanços ao longo dos últimos anos quanto ao desenvolvimento e funcionamento das enzimas (enzimologia), exitem ainda, lacunas importantes a serem elucidadas, especialmente no que refere a composição dos alimentos, no tocante ao tipo e nível de substratos presentes (bromatologia). Pontos críticos quanto ao uso de enzimas são comuns na indústria, especialmente no que diz respeito ao conhecimento do substrato contido na matéria prima, estabilidade enzimática e métodos analíticos e experimentais

Enzimas salivales y enfermedad periodontal

Objetivos: Las enfermedades que producen daño tisular producen la liberación de diferentes enzimas relacionadas con la muerte y destrucción celular, como son la aspartato y alanino aminotransferasa (AST, ALT), lactato dehidrogenasa (LDH), creatinin kinasa (CK), alcalina y ácida (ALP, ACP) y gamma glutamil transferasa (GGT). Al tratarse la enfermedad periodontal (EP) de un proceso inflamatorio con afectación de la encía y periodonto, parece lógico pensar que la actividad enzimática debe reflejar los cambios metabólicos secundarios a esta reacción inflamatoria. Diseño del estudio: En este artículo examinamos la actividad de CK, LDH, AST, ALT, GGT, ALP y ACP en la saliva de pacientes con EP, antes y después del tratamiento periodontal (grupo experimental'30 muestras) así como en la saliva de pacientes sin enfermedad periodontal (grupo control'20 muestras). La EP se diagnosticó en base a parámetros clínicos (índice gingival'GI, sangrado al sondaje-BOP y profundidad al sondaje-PD). Todos los pacientes con enfermedad periodontal recibieron tratamiento convencional de la misma. Se registró la actividad enzimática en todos los pacientes y se cuantificó por espectrofotometría Resultados: Se observó un aumento estadísticamente significativo en la actividad de CK, LDH, AST, ALT; GGT, ALP y ACP en la saliva de los pacientes con enfermedad periodontal en relación a los resultados obtenidos en el grupo control. Se detectó una correlación positiva entre la actividad de las enzimas salivales examinadas y el valor del GI. Después del tratamiento periodontal convencional la actividad de estas enzimas salivales disminuyó significativamente. Conclusiones: Basándonos en estos resultados. Podemos concluir que la actividad de estas enzimas puede ser útil en el diagnóstico y evaluación del tratamiento de la EP.Background: Host responses to periodontal disease include the production of different enzymes that are released by stromal, epithelial or inflammatory cells. There are important enzymes associated with cell injury and cell death like: aspartate and alanine aminotransferase (AST, ALT), lactate dehydrogenase (LDH), creatine cinase (CK), alkaline and acidic phosphatase (ALP, ACP), gama glutamil transferase (GGT). Changes in enzymatic activity reflect metabolic changes in the gingiva and periodontium in inflammation. Design of Study: In this paper we have examined the activity of CK, LDH, AST, ALT, GGT, ALP and ACP in saliva from patients with periodontal disease before and after periodontal treatment (experimental group ' 30 samples) and in saliva from healthy patients (control group ' 20 samples). Periodontal disease was determined based on clinical paIndexed desrameters (gingival index (GI), bleeding on probing (BOP), probing depth (PD)). Patients with periodontal disease were under conventional periodontal treatment. Results: Obtained results were shown statistically significant increases of activity of CK, LDH, AST, ALT, GGT, ALP, ACP in saliva from patients with periodontal disease in relation to control group. There is positive correlation between the activity of examined salivary enzymes and value of the gingival index. After conventional periodontal therapy the activity of all salivary enzymes was significantly decreased. Conclusions: Based on these results, it can be assume that activity of these enzymes in saliva, as biochemical markers for periodontal tissue damage, may be useful in diagnosis, prognosis and evaluation of therapy effects in periodontal disease

Efecto del estrés producido por la mezcla de sales en la concentración de aldehído malónico, proteínas y enzimas antioxidantes de Leymus chinensis de tres colores foliares diferentes

The mixed salt stress is common in nature. Salt stressalways affects plant growth. Different plant species have different adaptive capacity to salty soil. Leymus chinensis is an herbaceous plant with different leaf colors. However, little research was conducted to explore the different tolerance mechanisms to salt stress among the three different leaf colour genotypes of Leymus chinensis (grey green, transitional color, yellow green). Pot experiments for Leymus chinensis in three leaf colors were conducted under mixed salt treatments in 2010. Malondialdehyde (MDA) and protein concentrations, and the activity of various antioxidant enzymes [i.e., superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), ascorbate peroxidase (APX), glutathione reductase (GR), dehydroascorbate reductase (DHAR) and monodehydroascorbate reductase (MDHAR)] were determined and compared among the three leaf color genotypes of Leymus chinensis. The concentrations of MDA and protein, and the activity of antioxidant enzymes showed an increasing trend with increasing pHs in almost all three leaf colors, and all of them became highest when salt stress and pH values were also highest. Moreover, antioxidant enzymes were the highest in the grey-green leaf color, and the lowest in the yellow green leaf color after exposure to the same pH treatment. The results suggested that all three leaf colors of Leymus chinensis were tolerant to salt stress, and the salt-tolerance declined according to the order of grey green > transitional color > yellow green of Leymus chinensis. This study can give us a better understanding of the intra-species adaptation to mixed salt soils.El estrés causado por mezcla de sales en el suelo es común en la naturaleza. El estrés salino siempre afecta el crecimiento de las plantas. Plantas de especies diferentes difieren en su capacidad de adaptación al estrés por sales en el suelo. Leymus chinensis es una planta herbácea con diferentes colores foliares. Sin embargo, se han conducido pocos estudios tendientes a determinar los diferentes mecanismos de tolerancia al estrés salino entre los tres genotipos de color foliar diferente de L. chinensis (grisáceo verdoso, color intermedio, amarillo verdoso). En 2010, se condujeron experimentos en macetas usando genotipos de L. chinensis de tres colores diferentes de hoja expuestos o no a tratamientos conteniendo una mezcla de sales. Las concentraciones de aldehído malónico (MDA) y proteínas, y la actividad de varias enzimas antioxidantes [es decir, la superóxido dismutasa (SOD), catalasa (CAT), ascórbico peroxidasa (APX), glutatión reductasa (GR), dehidroascórbico reductasa (DHAR) y monodehidroascórbico reductasa (MDHAR)] se determinaron y compararon entre los tres genotipos de color foliar diferente de L. chinensis. Las concentraciones de MDA y proteínas, y la actividad de enzimas antioxidantes mostraron una tendencia a incrementarse a mayores pHs en casi todos los colores foliares, y las tendencias en los tres colores foliares alcanzaron su punto máximo cuando el estrés salino y los valores de pH fueron máximos. Más aún, las concentraciones de las enzimas antioxidantes fueron las más altas en el color grisáceo verdoso, intermedias en el color intermedio, y las más bajas en el color amarillo verdoso después de la exposición al mismo tratamiento de pH. Los resultados sugirieron que los genotipos de los tres colores foliares de L. chinensis fueros tolerantes al estrés salino, y la tolerancia a la sal declinó de acuerdo al orden grisáceo verdoso > color intermedio > amarillo verdoso de L. chinensis. Este estudio puede proveer un mejor entendimiento de la adaptación intraespecífica de L. chinensis a suelos salinos.Fil: Zhou, C.. Chinese Academy of Science; China. Liaoning University; ChinaFil: Busso, Carlos Alberto. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Bahía Blanca. Centro de Recursos Naturales Renovables de la Zona Semiárida. Universidad Nacional del Sur. Centro de Recursos Naturales Renovables de la Zona Semiárida; Argentina. Universidad Nacional del Sur. Departamento de Agronomía; ArgentinaFil: Yang, Y. G.. Liaoning University; ChinaFil: Zhang, Z.. Shenyang University; ChinaFil: Wang, Z. W.. Chinese Academy of Science; ChinaFil: Yang, Y. F.. Northeast Normal University; ChinaFil: Han, X. G.. Chinese Academy of Science; Chin

Pasteurização do leite-do-amapá in natura para controle do escurecimento enzimático.

O extrato do amapazeiro (Brosimum parinarioides Ducke), conhecido como leite-do-amapá, é utilizado pelas populações amazônicas como fonte alimentar e medicinal. A rápida alteração de cor do látex após extração representa a presença de enzimas como polifenoloxidase (PPO) e peroxidase (POD), escurecendo o produto in natura e desqualificando-o para comercialização. Desse modo, este trabalho objetivou a avaliação da atividade das enzimas PPO e POD em três amostras de leite-do-amapá resfriadas a 8°C, coletadas em amapazeiros em Moju (PA), e onze amostras de leite-do-amapá após o processo de pasteurização em diversos binômios tempo/temperatura e posteriormente resfriadas a 8°C, visando à otimização da conservação do produto in natura. Após resfriamento a 8°C, as amostras de leite-do-amapá in natura apresentaram diferença significativa entre os valores de atividade da enzima POD e, posteriormente observou-se elevação dessa atividade durante os períodos de tempo analisados. Como também se observou atividade da enzima PPO nas mesmas amostras, constata-se que esse tipo de conservação não foi efi ciente para as enzimas POD e PPO para leite-do-amapá. As amostras pasteurizadas de leitedo-amapá, e posteriormente resfriadas, apresentaram atividades das enzimas POD e PPO significativamente diferenciadas da respectiva amostra controle (sem pasteurização), concluindo que a pasteurização nos binômios estudados, aliada ao resfriamento, foi eficaz na diminuição da atividade das enzimas peroxidase e polifenoloxidase, alcançando-se a inativação destas, podendo ser um processo potencial para conservação desse produto