Einfluss von Vitamin D und Vitamin A auf humane T-Zellen

T-Zell-vermittelte Immunantworten schützen den Menschen einerseits vor Infektionen und Malignomen, andererseits können sie auch an der Entstehung von Erkrankungen beteiligt sein. So vermitteln T-Lymphozyten im Rahmen hämatopoetischer Stammzelltransplantationen den erwünschten Graft-versus-Leukämie-Effekt lösen jedoch auch die Therapie-limitierende GvHD aus. T-Lymphozyten werden durch DCs aktiviert, wobei die lokalen Umgebungsbedingungen entscheidenden Einfluss auf die resultierende Immunantwort nehmen. Einer verstärkten Aktivierung der DCs und in der Folge der T-Lymphozyten durch bakterielle Stimuli wie LPS stehen hier immunregulatorische Effekte von Vitamin D oder TGFβ gegenüber, die in DCs einen tolerogenen Phänotyp induzieren und folglich die T-Zell-vermittelte Immunantwort abschwächen. Der Einfluss anderer Immunmodulatoren wie Vitamin A und MDP ist noch nicht vollständig geklärt. Gerade vor dem Hintergrund, dass eine angepasste Modulation der T-Zell-vermittelten Immunantwort in der Therapie der GvHD klinisch relevant ist, war es Ziel dieser Arbeit den Einfluss der genannten Substanzen auf allogene Immunantworten genauer zu untersuchen und zwar anhand von MLRs mit DCs und allo-T-Lymphozyten. Dabei wurde insbesondere auf mögliche Effekte eines Zusammenwirkens mehrerer Substanzen sowie den Einsatz physiologischer Konzentrationen der Vitamine und deren lokale Aktivierung. LPS bewirkte eine gesteigerte allo-T-Lymphozyten-Expansion sowie eine verstärkte CD25-Expression und TH1-Polarisation bei gleichzeitig verminderter Treg Polarisation. Dies steht im Einklang mit dem Pathogenesemodell der GvHD bei dem der Translokation bakterieller Bestandteile wie LPS über geschädigte epitheliale Barrieren eine entscheidende Bedeutung in der Induktion der Erkrankung zugeschrieben werden. Obwohl für den MDP-NOD2-Signalweg ein lindernder Einfluss auf die GvHD beschrieben ist konnte der Zusatz von MDP die LPS-vermittelten Effekte nicht abschwächen. Im Gegensatz zu LPS bewirkt TGFβ in DCs die Entstehung eines unreiferen, tolerogenen Phänotyps. Passend hierzu konnten in dieser Arbeit eine deutlich verminderte allo-T-Lymphozyten-Expansion und eine verstärkte Treg Polarisation beim Einsatz von TGFβ-DCs nachgewiesen werden. Diese Daten weisen auf einen lindernden Effekt der TGFβ-DCs auf die GvHD hin. Da TGFβ jedoch auch mit einer verstärkten cGvHD und günstigen Bedingungen für die Tumorgenese und das Überleben von Krankheitserregern in Verbindung gebracht wird bleibt noch zu klären ob sich in vivo ein positiver Effekt der TGFβ-DCs auf die GvHD ohne gleichzeitig erhöhtes Infektionsrisiko und verminderten GvL-Effekt ergibt. 25VD bewirkte in den MLRs eine verminderte allo-T-Lymphozyten-Expansion, TH1-Polarisation sowie eine verstärkte Treg Polarisation. Die Ergebnisse dieser Arbeit stehen damit im Einklang mit der Annahme, dass eine Anhebung der 25VD-Serumspiegel die GvHD lindern könnte. Retinal schränkte die allo-T-Lymphozyten-Expansion ebenfalls, jedoch in geringerem Ausmaß, ein. Die Kombination von Retinal und 25VD bewirkte dagegen eine geringere allo-T-Lymphozyten-Expansion und TH1-Polarisation sowie stärkere Treg Polarisation als 25VD allein. Da Vitamin A unter verschiedenen Umgebungsbedingungen verschiedene Immunfunktionen zugeschrieben werden, kann vermutet werden, dass Vitamin D die nötigen Umgebungsbedingungen schafft um eine tolerogene Wirkung des Vitamin A zu ermöglichen. Eine kombinierte Vitamingabe könnte sich nach diesen Überlegungen günstig im Rahmen der GvHD auswirken. Die Kombination der Vitamine mit TGFβ-DCs zeigte keine zusätzlichen Effekte. Es kann vermutet werden, dass TGFβ in DCs den stärkst möglichen tolerogenen Phänotyp induziert und die Vitamine daher keinen Einfluss mehr nehmen. Da CD62L-positive T-Lymphozyten als potente Auslöser der GvHD gelten ist besonders interessant, dass Retinal eine herausragende Reduktion der CD62L-Expression bewirkte. So könnte sich über eine Veränderung der Migrationseigenschaften der T-Lymphozyten möglicherweise eine Abschwächung der GvHD ergeben. Aufgrund der Effekte des biologisch inaktiven Retinals wurde die Fähigkeit der DCs getestet Retinal in die aktive Retinsäure umzusetzen. In der Literatur wird die nötige ALDH-Aktivität nur für wenige (murine) DCs beschrieben. Hier konnte eine ALDH-Aktivität in etwa einem Viertel der eingesetzten humanen DCs nachgewiesen werden, die sich durch kurzzeitige Inkubation mit IFNγ und stärker noch mit TGFβ steigern ließ. Der Einfluss von TGFβ während der DC-Reifung hatte keinen eindeutigen Einfluss auf deren ALDH-Aktivität. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass neben dem lokalen Vitamin D Metabolismus auch der lokale Vitamin A Metabolismus entscheidenden Einfluss auf T-Zell-vermittelte Immunantwort nimmt

Tumorangiogenese und Immunsuppression: Strategische Angriffspunkte für neue Therapieansätze beim Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle (HNSCC)

Zusammenfassung: Hintergrund: Die Tumorangiogenese und tumorassoziierte Immunsuppression sind Grundvoraussetzung für eine erfolgreiche Tumorevolution. Unsere bisherigen Analysen zeigen, dass Mundhöhlenkarzinomzellen über eine Produktion von TGF-β1 ("transforming growth factor-beta1") und MCP-1 ("monocyte chemoattractant protein-1") die Makrophageninfiltration in den Tumor stimulieren. Die angelockten Makrophagen produzieren den angiogenetischen sowie immunsupprimierenden Wachstumsfaktor VEGF ("vascular endothelial growth factor") und induzieren zudem die Produktion dieses Faktors über Interleukin (IL)-1α in den Tumorzellen. Neuere In-vitro-Studien zeigen, dass Retinsäure (VitaminA) die TGF-β1- und MCP-1-Produktion der Tumorzellen hemmt. Deshalb wurde in der vorliegenden Studie der Einfluss von Retinsäure auf die Makrophageninfiltration und VEGF-Produktion im Mausmodell analysiert. Material und Methoden: Mäusen der AJ-Linie (10Mäuse pro Gruppe) wurden Polyethylenschwämme (5×2mm3) mit humanen HNSCC-Zellen (450.000-150.0000/10μl RPMI) subkutan eingepflanzt. Mäuse mit Tumoren von mindestens 0,7-1 cm3 Durchmesser wurden täglich mit Retinsäure (160µg/kg) i.p. behandelt. Nach 21Tagen wurden die Schwämme entnommen und immunhistologisch nach VEGF-A, MCP-1, CD68 und CD31 untersucht. Die Bestimmung der Serumwerte von VEGF-A und MCP-1 erfolgte mit dem ELISA. Die Organe wurden entnommen und nach Makro- und- Mikrometastasen untersucht. Ergebnisse: Bei allen mit Retinsäure behandelten Tieren kam es zur vollständigen Tumorregression. Die Mäuse wiesen keinen Metastasenbefall auf (p=0,00) und die Makrophageninfiltration in den Tumor konnte blockiert werden (p=0,007). Alle behandelten Tiere regulierten die MCP-1- (0pg/ml) und VEGF-A-Serumwerte (12pg/ml) herunter (p=0,001). Schlussfolgerung: Die Ergebnisse zeigen, dass die Blockierung der Makrophageninfiltration in den Tumor mit VitaminA ein möglicher Therapieansatz ist, um die Induktion der zwei wichtigsten Überlebensstrategien des Tumors, Immunsuppression und Angiogenese, zu hemme

Der Einfluss von Vitamin D auf das angeborene Immunsystem

Das angeborene Immunsystem dient der schnellen und wirksamen Abwehr von Pathogenen. Eine fein abgestimmte Regulation seiner Funktion ist entscheidend für die Integrität des Organismus. Verschiedene endogene Faktoren (z. B. Hormone oder Zytokine) sowie exogene Faktoren (z. B. Zigarettenrauch oder Umweltpathogene) können das komplexe Gleichgewicht beeinflussen. Zu den klassischen Funktionen von Vitamin D gehört die Regulierung des Kalzium- und Phosphatmetabolismus. Erst in den letzten Jahren wurde die Bedeutung von Vitamin D für die Physiologie des angeborenen und adaptiven Immunsystems erkannt. Die genauen molekularen Abläufe, über die Vitamin D seine Wirkung als Immunmodulator entfaltet, sind bisher nur teilweise verstanden. Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung des Einflusses von Vitamin D auf verschiedene Funktionen des angeborenen Immunsystems nach Kontakt mit bakteriellen Pathogenen. In einem weiteren Schritt sollten die Auswirkungen von Zigarettenrauch auf die beobachteten Vitamin-D-Effekte analysiert werden. Humane Makrophagen und neutrophile Granulozyten wurden mit Vitamin D in verschiedenen Konzentrationen sowie mit unterschiedlichen Toll-like-Rezeptor-Liganden inkubiert. Untersucht wurde die Expression des einzigen bisher bekannten humanen Cathelizidins hCAP-18/LL-37, die Ausschüttung proinflammatorischer Zytokine und die bakterielle Eliminationsrate unter Verwendung von quantitativer real time-PCR (qRT-PCR), Western-Blot, ELISA und eines bakteriellen Eliminationsassays. Weiter wurden häufig verwendete Modellsysteme, wie die Zelllinien MonoMac 6 und U937 sowie murine Makrophagen, unter den für primäre humane Zellen verwendeten Konditionen stimuliert und die erhobenen Befunde verglichen. Um eine mögliche Interaktion zwischen Zigarettenrauch und Vitamin D zu untersuchen, wurden primäre humane Makrophagen mit beiden Substanzen inkubiert und die Expression von hCAP-18/LL-37 Zytokinen analysiert . Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit belegen eine antimikrobielle und antiinflammatorische Wirkung von Vitamin D auf humane Makrophagen und neutrophile Granulozyten. In humanen Makrophagen und neutrophilen Granulozyten kommt es zu einer gesteigerten Synthese von LL-37, während die Ausschüttung der proinflammatorischen Zytokine TNF- und IL-1 vermindert ist. Diese Effekte gehen Zusammenfassung II mit einer Verbesserung der Eliminationsrate von lebenden Bakterien einher. Signifikante Effekte lassen sich dabei für Konzentrationen detektieren, die über den aktuellen Empfehlungen des Institute of Medicine für eine ausreichende Vitamin-D-Versorgung liegen. Bei der Analyse der Modellsysteme zeigte sich, dass Vitamin D die Synthese des murinen LL-37-Homologs mouse cathelicidin related antimicrobial peptide (mCRAMP) nicht verändert. In den untersuchten humanen Zelllinien kam es nach Vitamin D Gabe zu einer gesteigerten LL-37-Expression, jedoch blieb die Zytokinantwort unbeeinflusst. Zigarettenrauch interferierte mit der Funktion von Vitamin D als Immunmodulator, indem er die Vitamin-D-vermittelte antimikrobielle Wirkung hemmte. Ein Einfluss auf die antiinflammatorischen Effekte ließ sich nicht nachweisen. Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstreichen die Bedeutung von Vitamin D für die Physiologie des Immunsystems. Seine Wirkung auf die Synthese endogener Antibiotika und die Entzündungsreaktion bieten interessante Ansatzpunkte für die Entwicklung neuer Therapiestrategien. Die Erhebungen der Dosis-Wirkungs-Beziehung in Zusammenschau mit aktuellen epidemiologischen Daten sowie die Interaktion zwischen Zigarettenrauch und Vitamin D könnten eine wichtige Rolle für die präventive Gesundheitsmassnahmen spielen

Beeinflussung der Expression endothelialer Adhäsionsmoleküle durch Ca++-Antagonisten, NO-Donoren und Antioxidantien

Adhäsionsmoleküle spielen eine entscheidende Rolle bei der Arterioskleroseentstehung. Sie bedingen die Anheftung und nachfolgende Migration von Leukozyten in den subendothelialen Raum (siehe 2.2.2). Eine vermehrte Expression ist Ausdruck einer Aktivierung des Gefäßendothels und kann zum einen durch physikalische Faktoren, wie zum Beispiel erhöhtem shear stress, ausgelöst werden. Zum anderen setzen verschiedene Substanzen Signalkaskaden der Endothelzelle in Gang, welche in einer vermehrten Expression der Oberflächenadhäsionsmoleküle gipfelt. Neben Zytokinen (IL-1, TNFα) und Bakterientoxinen wie LPS (BEVILACQUA et al. 1985, 1987, GAMBLE et al. 1985, YU et al. 1986, LUSCINSKAS et al. 1989) können Stoffwechselprodukte die Adhäsionsmolekülexpression steigern. Hier sind Advanced Glycation End Products (AGEs) zu nennen, die aus Reaktionen von Keto- oder Aldehydgruppen von Zuckern mit Aminogruppen von Proteinen hervorgehen und vor allem bei alten Menschen und Diabetes mellitus Patienten eine Rolle spielen (KUNT et al. 1999). Auch oxidiertes LDL, welches bei Patienten mit Hypercholesterinämie erhöht ist, kann die Expression der Adhäsionsmoleküle steigern und so Monozyten binden (COMINACINI et al. 1998), während eine Inkubatio

Investigations concerning the reconstruction of the stroma biomatrix of tissue engineered corneal models for in vitro drug absorption studies and tissue replacement

Corneale Zellkulturmodelle haben in den letzten Jahren sowohl für Fragestellungen der Bioverfügbarkeit von Ophthalmika als auch in der regenerativen Augenheilkunde an Bedeutung gewonnen. Der erste Teil dieser Arbeit befasst sich mit der Weiterentwicklung eines bereits etablierten humanen Cornea-Modells für In-vitro-Arzneistoffabsorptionsuntersuchungen. Nach erfolgreicher Optimierung des Kultivierungsprotokolls hinsichtlich der Verwendung von ausschließlich immortalisierten Zelllinien wurde die Eignung der in der Ophthalmologie eingesetzten Riboflavin/UVA-Methode untersucht, um über eine Collagen-Quervernetzung eine Verfestigung der Stromabiomatrix des Cornea-Modells zu induzieren. Nach der Behandlung konnte durch oszillationsrheologische Messungen eine geringe, aber statistisch signifikante Verbesserung der viskoelastischen Eigenschaften der Stromabioäquivalente festgestellt werden. Allerdings zeigte die humane corneale Keratozytenzelllinie eine deutliche und nachhaltige, von der Bestrahlungsdosis abhängige Verminderung der Zellviabilität, wobei je nach applizierter Bestrahlungsdosis, apoptotische oder nekrotische Prozesse überwogen. Insgesamt erwies sich die Riboflavin/UVA-Methode, im Unterschied zur klinischen Anwendung, als ungeeignet für die Verfestigung der Stromabiomatrix des beschriebenen Cornea-Modells für In-vitro-Arzneistoffabsorptionsuntersuchungen. Im zweiten Teil der Arbeit wurden vergleichende Untersuchungen an Langzeitkulturen nativer und immortalisierter humaner cornealer Stromazellen zur Stimulation der Synthese extrazellulärer Matrix durch Vitamin C-Supplementierung durchgeführt. Beide Zellarten reagierten auf Vitamin C-Supplementierung mit einer gesteigerten Sekretion von Collagen, wobei der Effekt in den nativen Zellen stärker ausgeprägt war. Die Sekretion von Glykosaminoglykanen wurde hingegen nicht angeregt. In den nativen Zellen steigerte Vitamin C außerdem die Zellviabilität und -proliferation. Durch den Vitamin C-Zusatz entstanden zusammenhängende Zellsheets, wobei die Zellsheets der nativen Zellen eine höhere Lichttransmission, einen höheren Ordnungszustand der Collagenfibrillen und bessere biomechanische Eigenschaften zeigten als die Zellsheets aus immortalisierten Zellen. Insgesamt erscheint die Stimulation der Sekretion extrazellulärer Matrix in nativen cornealen stromalen Zellen als ein vielversprechender Ansatz für die Entwicklung eines cornealen Gewebeersatzes als Alternative zu begrenzt verfügbarer humaner Spenderhornhaut.In recent years tissue engineered corneal models became more important in terms of bioavailability studies of ophthalmic drugs and regenerative ophthalmology. The first part of this thesis deals with the enhancements of an existing human corneal model for in vitro drug absorption studies. After the cultivation protocol was optimized successfully regarding the exclusive use of immortalized cell lines, the suitability of riboflavin/UVA-treatment, which is used in ophthalmology, was evaluated to strengthen the stroma biomatrix of the corneal model by inducing collagen crosslinking. After the treatment oscillation rheology experiments revealed a slight, but significant increase in viscoelastic properties of the stromal bioequivalents. However, the human corneal keratocyte cell line showed a considerable and enduring decline of cell viability, which was dependent on the applied dose of irradiation. Furthermore, it could be demonstrated that apoptotic and necrotic processes predominated depending on the applied dose of irradiation. Consequently, in contrast to clinical applications, riboflavin/UVA-treatment does not seem to be a suitable method to strengthen the stroma biomatrix of the corneal model for in vitro drug absorption studies. The topic of the second part of the thesis is the stimulation of extracellular matrix synthesis in long-term cultures via vitamin C supplementation comparing native and immortalized human corneal stromal cells. Collagen secretion was increased in both cell types as a result of vitamin C supplementation, whereas the effect was stronger in the native cells. However, vitamin C supplementation did not stimulate the secretion of glycosaminoglycans. Additionally, vitamin C supplementation had a positive effect on cell viability and proliferation in the native cells. Vitamin C supplementation induced the formation of coherent cell sheets. The cell sheets formed by the native cells had a higher percent of light transmission, a higher degree in regular arrangement of collagen fibrils and were superior in terms of biomechanical properties. Taken as a whole, stimulating secretion of the extracellular matrix in native corneal stromal cells is a promising approach for reconstructing the corneal stroma for tissue replacement as an alternative to limited human donor corneas

Der Einfluss von Antithymozytenglobulin auf humane Monozyten und dendritische Zellen

Die allogene Transplantation hämatopoetischer Stammzellen hat eine große Bedeutung in der Therapie maligner hämatologischer Erkrankungen. Allerdings wird der Erfolg dieser Therapieoption durch die Entwicklung einer Graft-versus-Host-Disease (GvHD) beschränkt. Prophylaktisch werden daher immunsuppressive Medikamente wie Antithymozytenglobulin (ATG) eingesetzt. Der am besten dokumentierte Effekt von ATG ist die Depletion von T-Zellen via Komplement-abhängiger Lyse oder alternativ via Apoptose und Phagozytose. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, welche Effekte ATG auf humane Monozyten und dendritische Zellen (DCs) hat. Zunächst konnte nachgewiesen werden, dass ATG im Gegensatz zu einer polyklonalen IgG-Kontrolle zu einer signifikant gesteigerten Expression des Enzyms Indolamin-2,3-Dioxygenase (IDO) in DCs führt. Die Expression von IDO in DCs hat immunregulatorische Effekte, wie z.B. die Induktion regulatorischer T-Zellen. Weiterhin konnte auf mRNA-Ebene eine verstärkte Expression der Kynureninase, einem weiteren Enzym des Tryptophan-Stoffwechsels, beobachtet werden. In Monozyten hatte ATG dagegen keine signifikanten Effekte auf die untersuchten Enzyme. Weiterhin konnte dargelegt werden, dass ATG die mRNA-Expression des Enzyms 25-Hydroxyvitamin D3 1α-Hydroxylase induziert. Dieses Enzym katalysiert die Umwandlung von 25-Hydroxy-Vitamin D3 zu physiologisch aktivem 1,25-Dihydroxy-Vitamin D3 [1,25(OH)2D3]. In einem nächsten Schritt konnte nachgewiesen werden, dass ATG zu einer signifikanten Zunahme von 1,25(OH)2D3 im Überstand der DCs führt. Von 1,25(OH)2D3 ist bekannt, dass es die Reifung und Differenzierung von DCs und somit ihre Fähigkeit T-Zellen zu stimulieren, inhibiert. Zudem konnte gezeigt werden, dass ATG in humanen DCs zu einer signifikant gesteigerten Sekretion von IL-10, ohne gleichzeitige Produktion von IL-12 führt. Diese Kombination ist ein typisches Charakteristikum für tolerogene DCs. In Monozyten hatte ATG keinen Effekt auf die Zytokin-Sekretion. Eine Inkubation der DCs mit allogenen T-Zellen zeigte, dass mit ATG stimulierte DCs nicht in der Lage sind allogene T-Zellen zur Proliferation anzuregen. Weiterhin lieferte diese Methode deutliche Hinweise darauf, dass die mit ATG stimulierten DCs in der Lage sind, die Proliferation von T-Zellen, welche durch reife DCs induziert wurde, zu inhibieren. In summa legen die Daten der vorliegenden Arbeit nahe, dass ATG im Gegensatz zu einer polyklonalen IgG-Kontrolle dazu in der Lage ist, einen tolerogenen DC-Phänotyp zu induzieren. Dieser Mechanismus könnte für die unter ATG beschriebene Induktion regulatorischer T-Zellen verantwortlich sein. Neben dem bekannten Effekt der T-Zell-Depletion könnte ATG seine immunsuppressive Wirkung auch durch die oben beschriebenen Mechanismen vermitteln. Ob diese Effekte in vivo allerdings tatsächlich von Bedeutung sind, muss erst durch weitere Untersuchungen bestätigt werde

Charakterisierung der Regulation und Funktion von PPARbeta

Im Zusammenhang mit Tumorerkrankungen kristallisierte sich in den letzten Jahren eine Gruppe von Kernrezeptoren heraus, die zunehmend mit Prozessen wie dem Zellzyklus, der Apoptose oder der Angiogenese in Verbindung gebracht wurden - die Familie der PPARs. Zusammengesetzt ist sie aus den drei Liganden-induzierbaren Transkriptionsfaktoren PPARalpha, PPARbeta und PPARgamma. Ihre transkriptionelle Aktivität wird durch Fettsäuren und ihre Derivate, sowie verschiedene onkogene Signalwege, wie die Ras-Raf-ERK-Kaskade, reguliert. Der Arachidonsäure-Metabolit Prostazyklin wurde in der Literatur häufig als Agonist von PPARbeta beschrieben. In der vorliegenden Arbeit konnte jedoch nachgewiesen werden, dass Prostazyklin zumindest in den verschiedenen eingesetzten Testsystemen keine signifikante Bedeutung bei der Regulation von PPARbeta besitzt. So führte beispielsweise die Aktivierung eines cRaf-Östrogen-Rezeptorfusionsproteins durch 4-OH-Tamoxifen zwar zu einer Induktion von Cox-2 und PPARbeta, sowie zu einem deutlichen Anstieg der Prostazyklinsynthese, die erwartete Zunahme der transkriptionellen Aktivität von PPARbeta blieb hingegen aus. Weiterhin beschäftigte sich die vorliegende Arbeit mit der Identifizierung von Zielgenen von PPARbeta.Anhand von siRNA-Experimenten, sowie Microarray-Studien und Real-Time PCR konnten in diesem Zusammenhang zwei interessante, potentielle Zielgene von PPARbeta charakterisiert werden: CXCR-4 und Angiopoietin-1, die durch Beeinflussung der Angiogenese eine wichtige Funktion von PPARbeta bei der Tumorigenese vermitteln könnten