The role of Pex11-beta in peroxisome biogenesis, intracellular relationship to reactive oxygen species levels and redox-sensitive cell signaling

Peroxisomes are organelles whose roles in fatty acid metabolism and reactive oxygen species (ROS) elimination have contributed much attention in understanding their origin and biogenesis. Many studies have shown that de novo peroxisome biogenesis is an important regulatory process, while yeast studies suggest that total peroxisome numbers are in part regulated by proteins such as Pex11, which can facilitate the division of existing peroxisomes. Although de novo biogenesis and divisions are likely important mechanisms to peroxisome functioning, the regulation of peroxisome numbers during embryonic development is poorly understood. Peroxisome number and function are particularly crucial in oviparous animals such as frogs where large embryonic yolk and fatty acid stores must be quickly metabolized, and ROS eliminated. The central role of peroxisomes with respect to ROS is in the generation and scavenging of hydrogen peroxide. Recent studies have revealed their involvement in metabolism of oxygen free radicals that have important functions in cell signaling. Using Xenopus laevis as a developmental model, this study demonstrates that overexpression and inhibition of Pex11β directly increases and decreases peroxisome number in vitro, and induces an early- or delayed-onset to peroxisome biogenesis in vivo, respectively. Knockdown of Pex11β, decreasing peroxisome numbers, induced a bent/double-axis phenotype compared to that of control uninjected embryos. This phenotype has previously been linked to increases in the redox sensitive-noncanonical Wnt/Planar Cell Polarity (PCP) cell signaling. As a result, this study investigated if changes in peroxisome number could affect intracellular ROS levels, thereby activating redox-sensitive cell signaling pathways such as canonical and noncanonical Wnt signaling. Following inhibition of Pex11β, there were significant increases in ROS levels in X. laevis A6 cells. I show for the very first time that changes in cellular ROS levels, as a result of decreases in peroxisome numbers, perturb noncanonical Wnt cell signaling

Xenopus

This book focuses on the amphibian, Xenopus, one of the most commonly used model animals in the biological sciences. Over the past 50 years, the use of Xenopus has made possible many fundamental contributions to our knowledge in cell biology, developmental biology, molecular biology, and neurobiology. In recent years, with the completion of the genome sequence of the main two species and the application of genome editing techniques, Xenopus has emerged as a powerful system to study fundamental disease mechanisms and test treatment possibilities. Xenopus has proven an essential vertebrate model system for understanding fundamental cell and developmental biological mechanisms, for applying fundamental knowledge to pathological processes, for deciphering the function of human disease genes, and for understanding genome evolution. Key Features Provides historical context of the contributions of the model system Includes contributions from an international team of leading scholars Presents topics spanning cell biology, developmental biology, genomics, and disease model Describes recent experimental advances Incorporates richly illustrated diagrams and color images Related Titles Green, S. L. The Laboratory Xenopus sp. (ISBN 978-1-4200-9109-0) Faber, J. & P. D. Nieuwkoop. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin): A Systematical & Chronological Survey of the Development from the Fertilized Egg till the End of Metamorphosis (ISBN 978-0-8153-1896-5) Jarret, R. L. & K. McCluskey. The Biological Resources of Model Organisms (ISBN 978-1-0320-9095-5

Establishment of the body axes in Xenopus laevis through goosecoid, myosin 1d and bicaudal c

The bilaterian body plan consists of three body axes: the anteroposterior (AP; head-trunk/tail), the dorsoventral (DV; back-belly) and the left-right (LR; placement of inner organs) axis. Axis formation occurs during early embryogenesis and is critical for further development and viability of the embryo. In this comprehensive study three highly conserved determinants were functionally analyzed in the context of axis development. The first chapter of this work covers the autoregulatory, homeodomain containing, repressor gene goosecoid (gsc), whose most prominent expression marks the Spemann-(Mangold) organizer (SO). The SO is the primary dorsal signaling center and is instructive for tissue patterning along the DV and AP axes. Transplanting the SO or misexpressing gsc on the opposite ventral side of an embryo is sufficient to establish a new/secondary AP axis. However, its function during normal development in the SO remained enigmatic as the gsc loss of function (LOF) lead to no severe early developmental defects. To elucidate the function of gsc, timed gain of function (GOF) experiments were performed. Gsc efficiently repressed the planar cell polarity (PCP)/Wnt signaling pathway leading to severe gastrulation and neurulation defects. This novel Gsc function was correlated with two vertebrate specific domains, suggesting an evolutionary new function of Gsc with the emergence of jaws/neural crests in vertebrates. The second chapter of this study addresses the functions of Myosin1d (Myo1d) and Bicaudal c1 (Bicc1) during the LR axis determination in vertebrates. In this group LR symmetry breakage takes place at a ciliated epithelium called LR organizer (LRO). The initial cue for the asymmetric LR axis development is a cilia-driven leftward fluid flow. These cilia have to be correctly polarized through PCP/Wnt signaling. Interestingly, the invertebrate Drosophila melanogaster also displays a distinct LR axis but uses a cilia independent, yet not fully understood, mechanism. It depends on a myo1d homologous gene, myo31DF, and PCP. To unravel a potential common evolutionary origin of the bilaterian LR axis myo1d was analyzed during Xenopus laevis lateralization. Myo1d LOF experiments disturbed LR axis formation by compromising PCP dependent outgrowth and polarization of LRO cilia. These experiments link the PCP/Myosin based mechanism of flies to the newly evolved cilia/flow dependent mode of vertebrate LR axis determination suggesting actomyosin as common ancestral LR determinant. Contrary to Myo1d, Bicc1 was already described for its function during polarization of flow producing LRO cilia. However bicc1s expression is most prominent in the sensory LRO cells (sLRO). These cells detect the fluid flow and translate it into left-sided signaling of the morphogen Nodal1 and consequently asymmetric LR axis formation. These cells downregulate the expression of the secreted Nodal1 antagonist DAN domain family member 5 (dand5) in response to flow. Bicc1s function was re-evaluated with respect to its function in sLRO cells. Ex vivo and in vivo experiments involving GOF as well as LOF experiments showed that Bicc1 regulates both dand5 and nodal1 via a direct and indirect post-transcriptional mechanism, respectively. In the process of dand5 regulation several other LR determinants and regulatory events were linked with the Bicc1 dependent mechanism: Dicer1 dependent microRNA repression of dand5 and a proposed cation channel Polycystin 2 mediated Bicc1 modification. These results highlight the importance of a tightly controlled Dand5 protein level as decisive for the overall outcome of the LR symmetry breakage in vertebrates.Der Körperbauplan von Bilateria setzt sich aus drei Körperachsen zusammen: Der anteroposterioren (AP; Längsachse), der dorsoventralen (DV; Rücken-Bauch) und der links-rechts (LR, Anordnung der inneren Organe) Achse. Die Körperachsenbildung findet während der frühen Embryonalentwicklung statt und ist entscheidend für die weitere Entwicklung und die Lebensfähigkeit des Embryos. In dieser umfassenden Arbeit wurden drei hoch konservierte Determinanten auf ihre Funktion während der Achsenentwicklung analysiert. Das erste Kapitel dieser Arbeit beschreibt die Funktion des autoregulatorischen Repressors und Homeoboxgens goosecoid (gsc), dessen bekannteste Expression den Spemann-(Mangold) Organisator (SO) markiert. Der SO ist das primäre dorsale Signalzentrum und bekannt für seine instruktive gewebespezifizierende Funktion entlang der AP- und der DV-Achse. Transplantation des SO oder Missexpression von gsc auf der gegenüberliegenden, ventralen, Seite des Embryos, ist ausreichend, um eine neue/zweite AP Körperachse zu erzeugen. Trotzdem blieb seine Funktion im SO während der normalen Entwicklung rätselhaft, da ein Funktionsverlust zu keinen massiven frühen Entwicklungsproblemen führte. Um die Funktion von gsc herauszufinden wurden zeitlich und räumlich terminierte Überexpressionen durchgeführt. Gsc reprimierte effizient den Planaren Zellpolaritäts (PCP)/Wnt Signalweg was zu ernsthaften Gastrulations- und Neurulationsdefekten führte. Die neu beschriebene Funktion von Gsc konnte mit zwei Wirbeltier-spezifischen Domänen korreliert werden. Dies suggerierte eine evolutionär neue Funktion von Gsc mit der Entstehung von Kiefern und Neuralleistenzellen in Wirbeltieren. Das zweite Kapitel dieser Arbeit behandelt die Funktion von Myosin1d (Myo1d) und Bicaudal c1 (Bicc1) während der LR Achsenentwicklung in Wirbeltieren. In dieser Tiergruppe wird die LR Symmetrie durch ein ciliertes Epithel, den sogenannten LR Organisator (LRO), gebrochen. Das erste Signal für die asymmetrische LR Entwicklung ist ein durch Cilien erzeugter linksgerichteter Flüssigkeitsstrom. Dafür müssen diese Cilien durch den PCP Signalweg korrekt polarisiert sein. Interessanterweise zeigt das wirbellose Tier Drosophila melanogaster auch eine eindeutige LR-Achse, für die sie allerdings einen Zilien-unabhängigen Mechanismus verwenden. Dieser ist bis heute noch nicht eindeutig geklärt, beruht aber auf dem myo1d orthologen Gen myo31DF und dem PCP Signalweg. Um einen potentiellen evolutionären Ursprung der LR Achsenentwicklung in Bilateria zu entschlüsseln, wurde myo1d während der Lateralisierung in Xenopus laevis analysiert. Funktionsverlust Experimente von Myo1d resultierten dabei in einer gestörten LR Achsenentwicklung, basierend auf einer Störung des PCP abhängigen Auswachsens und der Polarisierung der LRO-Cilien. Diese Experimente verbinden den PCP/Myosin abhängigen Mechanismus von Fliegen mit dem neu evolvierten Cilien/Flüssigkeitsstrom abhängigen Mechanismus der LR Achsenentwicklung in Wirbeltieren. Somit wird ein Actomyosin abhängiger Mechanismus als gemeinsamer ursprünglicher LR Achsendeterminant für Bilateria impliziert. Im Gegensatz zu Myo1d wurde für Bicc1 schon eine Funktion während der Polarisierung der LRO Cilien beschrieben. Dennoch ist die markanteste Expression von bicc1 in den sensorischen LRO Zellen (sLRO), welche den Flüssigkeitsstrom detektieren und in ein linksseitiges Signal des Morphogens Nodal1 umwandeln. Dieses Signal resultiert dann in der Entstehung der asymmetrischen LR Achse. Als Antwort auf den Flüssigkeitsstrom wird die Expression von dem sekretierten Nodal1-Antagonisten DAN domain family member 5 (dand5) in den sLRO Zellen runter reguliert. Die Funktion von Bicc1 sollte im Bezug auf die Funktion in den sLRO Zellen reevaluiert werden. Ex vivo und in vivo Funktionsverlust und Funktionsgewinn Experimente zeigten, dass Bicc1 sowohl dand5 direkt als auch nodal1 indirekt post-transkriptional reguliert. Desweiteren wurden auch andere LR Determinanten mit dem Mechanismus der Bicc1 abhängigen dand5 Regulation vernetzt: Die Dicer1 abhängige microRNA vermittelte Repression von dand5 und die mögliche Modifikation von Bicc1 in Abhängigkeit vom Kationen-Kanal Polycystin 2 (Pkd2). Diese Ergebnisse verdeutlichen maßgeblich die Bedeutung eines engmaschig kontrollierten Dand5 Proteinlevels für das Ergebnis des LR Symmetriebruchs in Wirbeltieren

The AP-2 family of transcription factors

The AP-2 family of transcription factors consists of five different proteins in humans and mice: AP-2α, AP-2β, AP-2γ, AP-2δ and AP-2ε. Frogs and fish have known orthologs of some but not all of these proteins, and homologs of the family are also found in protochordates, insects and nematodes. The proteins have a characteristic helix-span-helix motif at the carboxyl terminus, which, together with a central basic region, mediates dimerization and DNA binding. The amino terminus contains the transactivation domain. AP-2 proteins are first expressed in primitive ectoderm of invertebrates and vertebrates; in vertebrates, they are also expressed in the emerging neural-crest cells, and AP-2α(-/- )animals have impairments in neural-crest-derived facial structures. AP-2β is indispensable for kidney development and AP-2γ is necessary for the formation of trophectoderm cells shortly after implantation; AP-2α and AP-2γ levels are elevated in human mammary carcinoma and seminoma. The general functions of the family appear to be the cell-type-specific stimulation of proliferation and the suppression of terminal differentiation during embryonic development

Axes determination in the frog Xenopus laevis : the function of the goosecoid, myo1d and dmrt2

During early embryogenesis, pattern formation processes along the head-trunk (anteroposterior, AP), belly-back (dorsoventral, DV) and left-right (LR) body axis generate the fundamental body plan of the bilateria. The formation of the LR axis is exceptional because externally our body is bilateral symmetric whereas most inner organs are shaped and positioned asymmetrically. The three body axes are basically specified during gastrulation and neurulation by a set of developmental control genes. The aim of this work was to analyze the function of the highly conserved genes, goosecoid (gsc), myosin1d (myo1d) und dmrt2 during body axis determination in Xenopus. The first chapter of this work describes the activity of the homeobox transcription factor Goosecoid during AP- and DV-axis formation. Gsc acts as an autoregulatory transcriptional repressor and importantly is expressed in the Spemann Organizer (SO) of all vertebrate embryos. The SO represents the main dorsal signaling center for primary axis induction, regulates embryonic patterning and cell movements. It is further required for AP i.e. head and trunk development. Transferring of SO or gsc misexpression to ventral half of embryos resultes in secondary axis formation i.e. siamnese twins. However, SO function of Gsc was enigmatic, as gsc mutants showed no defects on early developmental processes what challenged Gsc function in the SO. In this chapter, gsc was characterized by conducting gain of function experiments in the embryonic midline of Xenopus embryos. Gsc was able to repress planar cell polarity (PCP) in a cell- and non-cell autonomous fashion leading to neural tube closure defects. In the early gastrulae, Gsc separates the head from the trunk mesoderm by repressing the mesodermal t-box gene transcription factor T (Tbxt). This inhibition allows the migration of the head mesodermal cells whereas the trunk notochord elongates by mediolateral intercalation. Gsc activity on PCP signaling seems to be specific for vertebrates only and correlates with the presence of two novel domains. The determination of the LR body axis is discussed in the second chapter of this work. At the so called left-right organizer (LRO) a cilia-mediated leftward-fluid flow initiates the symmetry breaking event in neurulae embryos. Lateral sensory cells (sLRO) of the LRO perceive flow on the left side and translate it into the left asymmetric induction of the highly conserved Nodal cascade. If and how the unconventional, actin-associated motor protein Myosin1d (Myo1d) as well as the transcription factor Doublesex and mab-3 related 2 (Dmrt2) intervene in LR specification was analyzed in this chapter. In evolutionary terms the study of myo1d was of high interest because in Drospohila, which lacks a ciliary flow mechanism, the homologous gene, myo31df, controls LR axis determination. Manipulations of myo1d in Xenopus demonstrated that in vertebrates Myo1d is involved in the cilia-based symmetry breakage event. By interacting with the PCP signaling pathway, Myo1d ensures leftward-fluid flow by regulating ciliary outgrowth and polarization. In Drosophila and Xenopus Myo1d interacts with PCP signaling and seems to link an ancestral symmetry breaking mechanism of the fly to the newly evolved leftward-fluid flow in vertebrates. Based on studies in zebrafish, which identified Dmrt2 as another factor involved in LR development and somitogenesis, we started the analysis of dmrt2 in Xenopus. Somitogenesis and laterality determination which on first sight are functionally distinct processes were analyzed in the context of dmrt2 function. In Xenopus, flow-sensing cells are affiliated to the somitic cell lineage and therefor paraxial mesoderm specification is crucial for setting up a functional LRO. Dmrt2 specifies the paraxial mesoderm and especially the sLRO by inducing the myogenic transcription factor myf5 in early gastrulae. This demonstrated for the first time experimentally how somitogenesis and laterality determination are intertwined and describes the genesis of the Xenopus sLRO cells in more detail.Während der frühen Embryogenese generieren embryonale Musterbildungsprozesse entlang der Kopf-Rumpf- (anteroposterior, AP), Rücken-Bauch- (dorsoventral, DV) und links-rechts (LR) Körperachse den grundlegenden Bauplan der Bilateria. Hierbei ist vor allem die Ausbildung der LR-Achse auffallend: sie besticht durch eine äußerlich sichtbare Symmetrie entlang der AP-Achse, wohingegen die asymmetrische Formgebung und Position der inneren Organe in der sekundären Leibeshöhle äußerlich nicht zu erkennen ist. Die Ausbildung der drei Körperachsen wird durch die Aktivität zahlreicher Gene während der Gastrulation und Neurulation reguliert. Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle der hoch konservierten Gene goosecoid (gsc), myosin1d (myo1d) und doublesex-and mab3 related transcription factor 2 (dmrt2) während der Ausbildung der Körperachsen in Xenopus laevis näher zu untersuchen. Das erste Kapitel dieser Arbeit befasst sich mit der frühen Funktion des Homöobox-Transkriptionsfaktors Goosecoid während der Ausbildung der AP- und DV-Achse. Gsc wirkt als autoregulatorischer transkriptioneller Repressor, wird im Spemann-Organisator, dem Signalzentrum der primären Achseninduktion exprimiert und steuert die embryonale Musterbildung. Es reprimiert ventrale Signalwege im dorsalen Gewebe, separiert das Kopf- vom Chordamesoderm und reguliert Zellbewegungen im Zuge der Gastrulation und Neurulation. Die frühe Funktion von gsc im Spemann-Organisator war bislang enigmatisch, da der Funktionsverlust von gsc die frühe embryonale Entwicklung nicht beeinträchtigte. Durch gezielte Überexpression von gsc in der dorsalen Mittellinie von Xenopus Embryonen wurde hier die frühe Funktion von gsc näher charakterisiert. Gsc agierte sowohl zell- als auch nicht-zell-autonom als Repressor planarer Zellpolarität (planar cell polarity, PCP). In der frühen Gastrula separierte Gsc durch die Repression des mesodermalen T-box Gen Transkriptionsfaktors T (Tbxt) das Kopf- vom Chordamesoderm. Dies ermöglichte das migrieren des Kopfmesoderms und beschränkte die durch Tbxt-induzierte PCP-vermittelte mediolaterale Interkalation auf das elongierende Notochord des Embryos. Diese Funktion von Gsc scheint sich im Zuge der Evolution durch die Etablierung zweier neuer, für Vertebraten spezifische Domänen etabliert zu haben. Das zweite Kapitel befasst sich mit der Determinierung der LR-Körperachse in Xenopus, die als letzte der drei Körperachsen festgelegt wird. Diese wird durch einen Cilien-basierten nach links-gerichteten Flüssigkeitsstrom innerhalb des sog. links-rechts Organisators (LRO) in der Neurula initiiert. Die lateralen, linken sensorischen Zellen des LROs (sLRO) perzipieren den Flüssigkeitsstrom und translatieren dieses Signal in die Induktion der hoch konservierten Nodal Kaskade auf der linken Seite. Welche Funktion das unkonventionelle, Aktin-assoziierte Motorprotein Myo1d und der Transkriptionsfaktor Dmrt2 bei diesem Prozess einnimmt, wurde im Rahmen dieser Arbeit untersucht. Die Analyse von myo1d war hierbei evolutionär von großer Bedeutung, da das homologe Gene myo31df in Drosophila die Entstehung der LR-Achse, unabhängig eines links-gerichteten Flüssigkeitsstrom und einer asymmetrischen Gen-Kaskade reguliert. Die Manipulation von myo1d in Xenopus demonstrierte, dass die Funktion von Myo1d konserviert ist und auch in Vertebraten für den Symmetriebruch benötigt wird. Durch Interaktion mit dem PCP Signalweg trägt Myo1d über die Polarisierung und Ausbildung der Cilien zum links-gerichteten Flüssigkeitsstrom und somit zur Lateralitätsdeterminierung in Xenopus bei. Durch den Einfluss von Myo1d auf die PCP in Drosophila und Xenopus stellt Myo1d eine direkte Verbindung zwischen dem ancestralen Mechanismus und des in Vertebraten neu-evolvierten Flüssigkeitsstrom zum Bruch der bilateralen Symmetrie dar. Studien aus dem Zebrabärbling identifizierten Dmrt2 als einen weiteren Faktor, der sowohl für die Somitogenese als auch für die Ausbildung der LR-Körperachse benötigt wird. Ein Zusammenhang zwischen diesen Prozessen ist ein lang bekanntes Phänomen, dessen Ursache bisher nicht geklärt wurde. Aufgrund der Integration der sLRO Zellen in das paraxiale presomitische Mesoderm, dem Vorläufergewebe der Somiten, stellte sich die Frage, ob dies eine Verbindung zwischen diesen zwei Prozessen erklären könnte. Die Untersuchung von Xenopus Embryonen nach Manipulation von dmrt2 zeigte, dass die Spezifizierung des paraxialen Mesoderms in der frühen Gastrula für die Ausbildung der sLRO Zellen ausschlaggebend ist. Über die Induktion des myogenen Transkriptionsfaktors myf5 reguliert Dmrt2 die Spezifizierung des paraxialen Mesoderms und ins Besondere der sLRO Zellen in Xenopus. Dies demonstrierte zum ersten Mal experimentell eine direkte Verbindung zwischen der frühen Somitogenese und der Lateralitätsdeterminierung und liefert eine erste Erklärung wie diese Prozesse zusammenhängen

Current perspectives of the signaling pathways directing neural crest induction.

The neural crest is a migratory population of embryonic cells with a tremendous potential to differentiate and contribute to nearly every organ system in the adult body. Over the past two decades, an incredible amount of research has given us a reasonable understanding of how these cells are generated. Neural crest induction involves the combinatorial input of multiple signaling pathways and transcription factors, and is thought to occur in two phases from gastrulation to neurulation. In the first phase, FGF and Wnt signaling induce NC progenitors at the border of the neural plate, activating the expression of members of the Msx, Pax, and Zic families, among others. In the second phase, BMP, Wnt, and Notch signaling maintain these progenitors and bring about the expression of definitive NC markers including Snail2, FoxD3, and Sox9/10. In recent years, additional signaling molecules and modulators of these pathways have been uncovered, creating an increasingly complex regulatory network. In this work, we provide a comprehensive review of the major signaling pathways that participate in neural crest induction, with a focus on recent developments and current perspectives. We provide a simplified model of early neural crest development and stress similarities and differences between four major model organisms: Xenopus, chick, zebrafish, and mouse

MELK-a conserved kinase: functions, signaling, cancer, and controversy.

Maternal embryonic leucine zipper kinase (MELK) is a highly conserved serine/threonine kinase initially found to be expressed in a wide range of early embryonic cellular stages, and as a result has been implicated in embryogenesis and cell cycle control. Recent evidence has identified a broader spectrum of tissue expression pattern for this kinase than previously appreciated. MELK is expressed in several human cancers and stem cell populations. Unique spatial and temporal patterns of expression within these tissues suggest that MELK plays a prominent role in cell cycle control, cell proliferation, apoptosis, cell migration, cell renewal, embryogenesis, oncogenesis, and cancer treatment resistance and recurrence. These findings have important implications for our understanding of development, disease, and cancer therapeutics. Furthermore understanding MELK signaling may elucidate an added dimension of stem cell control