Cyanobakterienkultivierung zur Extraktion toxischer Metabolite

Im Rahmen des Projektes »CyToTest« soll, in Kooperation mit der Firma BioTeZ Berlin-Buch GmbH, ein System entwickelt werden, mit dem direkt am Gewässer auf einfache Art und Weise die Cyanobakterientoxinkonzentration ermittelt werden kann. Dazu ist es nötig Cyanobakterien zu kultivieren und die Toxine zu isolieren. Beides wird gebraucht, um einerseits das Messsystem entwickeln zu können und andererseits an der TFH Wildau ein Verfahren zu entwickeln, mit dem die Cyanobakterien direkt am Gewässer aufgeschlossen und die Toxine extrahiert werden können. Im Rahmen dessen wurden sechs Gattungen Cyanobakterien kultiviert und ein Verfahren etabliert, um die Biomasse kalkulieren zu können. Weiterhin wurde mit der Kalibration der HPLC mit Toxinen begonnen, um die Extrakte später prüfen zu können.Within the project (in cooperation with BioTeZ Berlin- Buch GmbH) »CyToTest« a system shall be developed which allows to detect the concentration of cyanotoxins directly at the waterbody in a simple way. Therefore it is necessary to cultivate cyanobacteria and to isolate their toxins. This is essential for developing the measuring system and a procedure for digest the cyanobacteria and for extract the toxins directly at the waterbody. Therefore six species of cyanobacteria were cultivated and a method was developed for calculating the biomass. Furthermore the calibration of the HPLC with the toxins was begun for checking the extracts

Transformation of the filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna: Electroporation versus Natural Transformation

Der Großteil der aktuellen, auf Kohlenstoff basierenden Waren wird entweder aus pflanzlichen Rohstoffen oder aus Erdöl gewonnen. Die damit verbundene Nachfrage nach Ressourcen steigt auf Grund der wachsenden Erdbevölkerung und den allgemeinen Bestrebungen zur Verbesserung des Lebensstandards. Im Gegensatz dazu sind die Verfügbarkeit von Agrarflächen und fossilen Energiereserven begrenzt. Außerdem wird der Anstieg von CO2 in der Atmosphäre seit dem Beginn der industriellen Revolution im 19. Jahrhundert als Hauptbeitrag des Menschen zur globalen Erwärmung angesehen. Es gibt einige Strategien um die Abhängigkeit von fossilen Kohlenstoffquellen zu reduzieren, wie etwa die Entwicklung von regenerativen Energien oder erhöhte Energieeffizienz. Der Einsatz von Cyanobakterien in der Biotechnologie ist eine weitere Strategie, die das Potential besitzt Landwirtschaft und Erdölindustrie als Quelle für kohlenstoffbasierte Produkte zu ersetzen. Produkte, die sich von Cyanobakterien oder Pflanzen ableiten, führen nicht zur Erhöhung des CO2 Gehalts in der Atmosphäre. Im Vergleich zu Landpflanzen ist die Kultivierung von Cyanobakterien nicht abhängig von fruchtbarem Land und viele Arten der Cyanobakterien weisen höhere Wachstumsraten als Pflanzen auf. Außerdem sind einige Cyanobakterien genetisch manipulierbar, wodurch die Synthese natürlicher Produkte verstärkt werden kann oder die rekombinante Produktion von neuen Stoffen möglich ist. Die mögliche Produktpalette reicht von preiswerten Verbindungen, wie Biokraftstoffen, bis hin zu hochwertigen Produkten, wie pharmazeutischen Wirkstoffen. Auch wenn es im Bereich der rekombinanten Biotechnologie mit Cyanobakterien schon kommerzielle Anwendung gibt, befindet sich das gesamte Feld dennoch in seinen Kinderschuhen. Während im Bereich der metabolischen Optimierung, der molekularen Werkzeuge und der Bioreaktorentwicklung in den letzten Jahren und Jahrzehnten deutliche Fortschritte gemacht wurden, ist die Etablierung von neuen Organismen nach wie vor eine Herausforderung. Die Forschung konzentriert sich größtenteils auf wenige, leicht transformierbare Modelorganismen der Ordnungen Synechococcales und Nostocales, da die Etablierung von Transformationsprotokollen für neue Stämme und Arten oft eine Herausforderung darstellt. Allerdings wird die rekombinante Biotechnologie mit Cyanobakterien ohne ein breites Spektrum an nutzbaren Stämmen möglicherweise hinter ihrem Potential zurück bleiben, da vorteilhafte Eigenschaften von vielversprechenden Kandidaten nicht genutzt werden können. Diese Arbeit setzt sich mit der beschriebenen Limitierung auseinander, indem ein verlässliches und effizientes Transformationsprotokoll für Phormidium lacuna etabliert wurde. Diese Art wurde kürzlich von unserer Arbeitsgruppe als vielversprechend für die cyanobakterielle Biotechnologie charakterisiert. Da die Gattung Phormidium bislang noch nicht für genetische Manipulation zugänglich war, war es das Ziel dieser Arbeit ein Transformationsprotokoll zu entwickeln und das Potential für die Biotechnologie an Hand der rekombinanten Ethanolsynthese zu charakterisieren. Die rekombinante Produktion von Ethanol ist gut charakterisiert innerhalb der cyanobakteriellen Biotechnologie und ermöglicht den Vergleich mit anderen Cyanobakterien hinsichtlich Produktivität. VII Bei der Etablierung eines Protokolls zur Elektroporation wurde deutlich, dass Phormidium lacuna natürlich transformierbar ist. Natürliche Transformation ist bislang nur für wenige Stämme der Cyanobakterien beschrieben und dies ist der erste Bericht für die Ordnung Oscillatoriales. Natürliche Transformation erlaubt verlässlichen und effizienten Gentransfer mittels homologer Rekombination in Phormidium lacuna. Die Integration des Selektionsmarkers kanR ins Genom von Phormidium lacuna vermittelt eine deutliche Resistenz gegenüber Kanamycin (bis zu 14,3 mg/ml). Die kanR Sequenz verteilt sich sehr schnell in allen Genomkopien: Nach zwei Kulturzyklen nach der ersten Kultivierung der entsprechenden Transformanten war die kanR Sequenz in allen Genomkopien einer Zelle vorhanden. Phormidium lacuna Transformaten für die rekombinante Ethanolproduktion wurden generiert indem die codierenden Sequenzen für die Enzyme Pyruvatdecarboxylase und Alkoholdehydrogenase ins Genom integriert wurden. Die Ethanolproduktion wurde über die Ethanolkonzentration im Kulturüberstand mittels Gaschromatographie nachgewiesen. Allerdings konnte keine erhöhte Ethanolproduktion von Transformanten im Vergleich zum Wildtyp von Phormidium lacuna nachgewiesen werden. Mögliche Gründe hierfür und geeignete Schritte in Richtung einer biotechnologischen Anwendung von Phormidium lacuna wurden diskutiert. Der unerwartete Fund der natürlichen Transformation für Phormidium lacuna ist möglicherweise ein Hinweis darauf, dass die Fähigkeit zu natürlicher Transformation weiter unter den Cyanobakterien verbreitet ist, als bislang angenommen wurde. Um diese Fragestellung zu adressieren wurden der Fund der natürlichen Transformation in dieser Arbeit und die weiteren Beispiele, die in der Literatur beschrieben sind, mit den Cyanobakterien im Allgemeinen verglichen. Basierend auf der Homologie zu Proteinen, die an der natürlichen Transformation beteiligt sind, wurden cyanobakterielle Stämme vorgeschlagen, die potentiell transformierbar sind. Der Fund der natürlichen Transformation in dieser Arbeit hat viele Implikationen. Erstens: Phormidium lacuna ist nun effizient natürlich transformierbar, was eine essentielle Voraussetzung für die weiteren Arbeitsschritte mit diesem Organismus in Bereich der rekombinanten Biotechnologie darstellt. Zweitens: Da Phormidium lacuna leicht transformierbar ist und homozygote Transformanten in kurzer Zeit generiert werden können, bietet sich dieses Bakterium als vielversprechender Modellorganismus der filamentösen Cyanobakterien ohne Heterocysten an. Drittens: Der Fund von natürlicher Transformation in einer neuen Ordnung der Cyanobakterien weiß vermutlich daraufhin, dass natürliche Kompetenz eine weit verbreitete Eigenschaft innerhalb der Cyanobakterien ist und dass möglicherweise deutlich mehr Stämme zugängliche für rekombinante Biotechnologie sind

Etablierung von Hochdurchsatz-Kultivierungs- und -Screeningmethoden für phototrophe Einzeller

Mit Hochdurchsatz-Kultivierungs- und -Screeningmethoden können viele Proben parallel, miniaturisiert und kostengünstig bearbeitet werden. Für phototrophe Organismen wie Mikroalgen und Cyanobakterien sind Hochdurchsatz-Kultivierungsverfahren jedoch bis heute kaum etabliert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden diese Verfahren beispielhaft für das Cyanobakterium Synechocystis sp. PCC 6803 etabliert. Die benötigte technische Automatisierung wurde hierbei durch den Einsatz eines Tecan Genesis RSP 150 Pipettierroboters erreicht. Die Kultivierung erfolgte in Deepwell-Mikrotiterplatten innerhalb einer speziell angefertigten Kammer mit programmierbaren Schüttlern, einstellbarer Belichtung und CO2-Atmosphäre. Die in diesem System erreichten Wachstumsraten sind vergleichbar mit publizierten Kultivierungsmethoden. Das Hochdurchsatz-Screening wurde mit Hilfe eines in den Roboter integrierten Tecan Genios Plus Plattenreaders durchgeführt. Es wurden beispielhaft Methoden zur Bestimmung von optischer Dichte und Chlorophyllgehalt etabliert. Die hier vorgestellte Plattform kann vielseitig zur Analyse phototropher Organismen eingesetzt werden und ist durch entsprechende Assays leicht zur Messung anderer Parameter erweiterbar.High-throughput cultivation and screening methods allow a parallel, miniaturized and cost efficient processing of many samples. These methods however, have not been generally established for phototrophic organisms such as microalgae or cyanobacteria. In this work we describe and test high-throughput methods with the model organism Synechocystis sp. PC6803. The required technical automation for these processes was archived with a Tecan Genesis RSP 150 pipetting robot. The cultivation was performed in deepwell microtiter plates within a specially constructed cultivation chamber. The chamber is outfitted with programmable shaking conditions, variable illumination and an adjustable CO2 atmosphere. The growth rates archived within this system are comparable to those achieved with established methods such as bioreactors. The high-throughput screening was achieved with a Tecan Genios Plus plate reader integrated within the pipetting robot. Methods for determination of optical density and amount of chlorophyll were established within the scope of this work. The presented platform can be used for a variety of analyses of phototrophic organisms and is easily expandable with further assays to screen for additional targets

Selbstversorger und trotzdem Räuber : Marine amöboide Algen aus dem Lebensraum Biofilm

Als Biofilme bezeichnet man oft schleimige Auflagen auf Steinen im Wasser mit Bakterien und mikroskopisch kleinen Tieren und Pflanzen. Sie treten im Süßwasser und im Meer auf. Unter dem Mikroskop erweisen sie sich nicht selten als sehr artenreich. Biofilme können von größeren Tieren, wie Schnecken, manchen Fischen und Seeigeln, abgeweidet werden. In den Biofilmen können amöboide Algen leben, von denen einige neu entdeckte hier vorgestellt werden

Benthische Algen ohne Kieselalgen und Armleuchteralgen : Feldführer / [Autoren: Antje Gutowski ; Julia Foerster]. Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen. [Ministerium für Umwelt und Naturschutz, Landwirtschaft und Verbraucherschutz des Landes Nordrhein-Westfalen]

Benthische Algen sind ein wesentlicher Teil des Ökosystems der Fließgewässer. Verschiedene Verfahren nutzen sie zur Bioindikation. Eines davon ist das PHYLIB-Verfahren (SCHAUMBURG et al. 2004, 2005) zur Bewertung des ökologischen Zustandes. In diesem Verfahren wird die Qualitätskomponente Makrophyten und Phytobenthos in drei Teilkomponenten gegliedert. Neben Makrophyten incl. Charales und Diatomeen werden die anderen Algenklassen als "übriges" Phytobenthos einbezogen. Das "übrige" Phytobenthos zeichnet sich in mehrerlei Hinsicht durch eine besondere Vielfalt aus. Dieser Feldführer versucht, eine erste Orientierung zu vermitteln. Dazu gehört eine kurz gehaltene Darstellung der relevanten Algenklassen im systematischtaxonomischen Teil, in dem auch die jeweils wichtigen Bestimmungswerke aufgeführt werden. Dabei werden grundlegende Begriffe erläutert, die für die Verwendung der Bestimmungsliteratur nützlich sind. Der Schwerpunkt liegt jedoch in dem Bemühen, den Blick für das Erkennen der Algen im Gewässer zu schärfen. Die für eine Indikation wichtigen Algenbestände sind oft wenig auffällig und leicht zu übersehen. Erfahrung und Wissen sind erforderlich, um sie zu erkennen. Auch offensichtliche Massenentwicklungen bestehen in der Regel aus Mischbeständen mehrerer Arten, die differenziert betrachtet werden müssen. Der hier vorliegende Feldführer stellt das dafür notwendige "Handwerkszeug" zur Verfügung. Dafür werden zum einen die möglichen Habitate benthischer Algen charakterisiert und mit Bildern vorgestellt. Zum anderen wird die Vielfalt der Lager- bzw. Wuchsformen benthischer Algen mit ihren Charakteristika hinsichtlich Farbe, Konsistenz und mitunter auch Geruch beschrieben. Um diese Vielfalt für die praktische Arbeit zu gliedern, wurden neun Kategorien aufgestellt. Aufgrund der im Gelände sichtbaren Wuchs- bzw. Lagerformen wurden zahlreiche Taxa diesen Kategorien zugeordnet. Die Taxa werden mit zahlreichen Abbildungen dargestellt. Anschließend wird die Vorgehensweise bei der Probenahme entsprechend den Vorgaben des PHYLIB-Bewertungsverfahren erklärt und anhand von zwei Beispielen illustriert. Hinweise auf Verfahren in anderen Ländern und ein Ausblick auf die EN-Norm stellen das PHYLIB-Verfahren in einen größeren Zusammenhang. Damit bietet dieser Feldführer eine gute Orientierung hinsichtlich der Formen- und Farbenvielfalt, der systematischen Vielfalt sowie der entsprechenden Vielfalt der Bestimmungsliteratur der Vertreter des „übrigen“ Phytobenthos. Anwender des PHYLIB-Bewertungsverfahrens finden in diesem Buch hilfreiche Anleitungen für die praktische Arbeit

3. Wochenbericht M105

(17.03.2014 – 16.04.2014