In Silico Modeling of Geobacter Species.

This project employed a combination of in silico modeling and physiological studies to begin the construction of models that could predict the activity of Geobacter species under different environmental conditions. A major accomplishment of the project was the development of the first genome-based models of organisms known environmental relevance. This included the modeling of two Geobacter species and two species of Pelobacter. Construction of these models required increased sophistication in the annotation of the original draft genomes as well as collection of physiological data on growth yields, cell composition, and metabolic reactions. Biochemical studies were conducted to determine whether proposed enzymatic reactions were in fact expressed. During this process we developed an Automodel Pipeline process to accelerate future model development of other environmentally relevant organisms by using bioinformatics techniques to leverage predicted protein sequences and the Genomatica database containing a collection of well-curated metabolic models. The Automodel Pipeline was also used for iterative updating of the primary Geobacter model of G. sulfurreducens to expand metabolic functions or to add alternative pathways. Although each iteration of the model does not lead to another publication, it is an invaluable resource for hypothesis development and evaluation of experimental data. In order to develop a more accurate G. sulfurreducens model, a series of physiological studies that could be analyzed in the context of the model were carried out. For example, previous field trials of in situ uranium bioremediation demonstrated that Geobacter species face an excess of electron donor and a limitation of electron acceptor near the point of acetate injection into the groundwater. Therefore, a model-based analysis of electron acceptor limitation physiology was conducted and model predictions were compared with growth observed in chemostats. Iterative studies resulted in the model accurately predicting acetate oxidation and electron acceptor reduction. The model also predicted that G. sulfurreducens must release hydrogen under electron-accepting conditions in order to maintain charge and electron balance. This prediction was borne out by subsequent hydrogen measurements. Furthermore, changes in gene expression were consistent with model predictions of flux changes around central metabolism. The model revealed multiple redundant pathways in central metabolism suggesting an apparent versatility unusual in microbial metabolism. The computational analysis led to the identification of 32 reactions that participated in eight sets of redundant pathways. The computational results guided the design of strains with mutations in key reactions to elucidate the role of the alternate pathways and obtain information on their physiological function. A total of seven strains with mutations in genes encoding five metabolic reactions were constructed and their phenotypes analyzed in 12 different environments. This analysis revealed several interesting insights on the role of the apparent redundant pathways. 13C labeling approaches were developed for further elucidation of metabolic pathways with model-driven interpretation. For example, the model was used to calculate the optimal acetate 13C labeling ratio for distinguishing flux through various pathways based on amino acid isotopomer distributions. With this method it was possible to elucidate the pathways for amino acid biosynthesis. Surprisingly, the labeling pattern of isoleucine deviated significantly from what was predicted by the metabolic reconstruction. Detailed analysis of the labeling patterns with the model led to the discovery that there are two pathways for leucine biosynthesis, including a novel citramalate pathway that was subsequently confirmed with biochemical analysis. In summary, the combined computational and experimental studies have been instrumental in further characterizing the central metabolism of members of the Geobacteraceae. Furthermore, the methods developed in these studies provide a strategy for the genome-based study of the physiology of other understudied, but environmentally significant organisms

Genome-wide gene regulation of biosynthesis and energy generation by a novel transcriptional repressor in Geobacter species

Geobacter species play important roles in bioremediation of contaminated environments and in electricity production from waste organic matter in microbial fuel cells. To better understand physiology of Geobacter species, expression and function of citrate synthase, a key enzyme in the TCA cycle that is important for organic acid oxidation in Geobacter species, was investigated. Geobacter sulfurreducens did not require citrate synthase for growth with hydrogen as the electron donor and fumarate as the electron acceptor. Expression of the citrate synthase gene, gltA, was repressed by a transcription factor under this growth condition. Functional and comparative genomics approaches, coupled with genetic and biochemical assays, identified a novel transcription factor termed HgtR that acts as a repressor for gltA. Further analysis revealed that HgtR is a global regulator for genes involved in biosynthesis and energy generation in Geobacter species. The hgtR gene was essential for growth with hydrogen, during which hgtR expression was induced. These findings provide important new insights into the mechanisms by which Geobacter species regulate their central metabolism under different environmental conditions

Constraint-based modeling analysis of the metabolism of two Pelobacter species

BACKGROUND: Pelobacter species are commonly found in a number of subsurface environments, and are unique members of the Geobacteraceae family. They are phylogenetically intertwined with both Geobacter and Desulfuromonas species. Pelobacter species likely play important roles in the fermentative degradation of unusual organic matters and syntrophic metabolism in the natural environments, and are of interest for applications in bioremediation and microbial fuel cells. RESULTS: In order to better understand the physiology of Pelobacter species, genome-scale metabolic models for Pelobacter carbinolicus and Pelobacter propionicus were developed. Model development was greatly aided by the availability of models of the closely related Geobacter sulfurreducens and G. metallireducens. The reconstructed P. carbinolicus model contains 741 genes and 708 reactions, whereas the reconstructed P. propionicus model contains 661 genes and 650 reactions. A total of 470 reactions are shared among the two Pelobacter models and the two Geobacter models. The different reactions between the Pelobacter and Geobacter models reflect some unique metabolic capabilities such as fermentative growth for both Pelobacter species. The reconstructed Pelobacter models were validated by simulating published growth conditions including fermentations, hydrogen production in syntrophic co-culture conditions, hydrogen utilization, and Fe(III) reduction. Simulation results matched well with experimental data and indicated the accuracy of the models. CONCLUSIONS: We have developed genome-scale metabolic models of P. carbinolicus and P. propionicus. These models of Pelobacter metabolism can now be incorporated into the growing repertoire of genome scale models of the Geobacteraceae family to aid in describing the growth and activity of these organisms in anoxic environments and in the study of their roles and interactions in the subsurface microbial community

Metabolic response of Geobacter sulfurreducens towards electron donor/acceptor variation

Background Geobacter sulfurreducens is capable of coupling the complete oxidation of organic compounds to iron reduction. The metabolic response of G. sulfurreducens towards variations in electron donors (acetate, hydrogen) and acceptors (Fe(III), fumarate) was investigated via 13C-based metabolic flux analysis. We examined the 13C-labeling patterns of proteinogenic amino acids obtained from G. sulfurreducens cultured with 13C-acetate. Results Using 13C-based metabolic flux analysis, we observed that donor and acceptor variations gave rise to differences in gluconeogenetic initiation, tricarboxylic acid cycle activity, and amino acid biosynthesis pathways. Culturing G. sulfurreducens cells with Fe(III) as the electron acceptor and acetate as the electron donor resulted in pyruvate as the primary carbon source for gluconeogenesis. When fumarate was provided as the electron acceptor and acetate as the electron donor, the flux analysis suggested that fumarate served as both an electron acceptor and, in conjunction with acetate, a carbon source. Growth on fumarate and acetate resulted in the initiation of gluconeogenesis by phosphoenolpyruvate carboxykinase and a slightly elevated flux through the oxidative tricarboxylic acid cycle as compared to growth with Fe(III) as the electron acceptor. In addition, the direction of net flux between acetyl-CoA and pyruvate was reversed during growth on fumarate relative to Fe(III), while growth in the presence of Fe(III) and acetate which provided hydrogen as an electron donor, resulted in decreased flux through the tricarboxylic acid cycle. Conclusions We gained detailed insight into the metabolism of G. sulfurreducens cells under various electron donor/acceptor conditions using 13C-based metabolic flux analysis. Our results can be used for the development of G. sulfurreducens as a chassis for a variety of applications including bioremediation and renewable biofuel production

Novel bioelectrochemical approaches for exploring extracellular electron transfer in "Geobacter sulfurreducens"

Los sistemas electroquímicos microbianos son aquellos en los que los microorganismos actúan, en combinación con electrodos, como catalizadores de reacciones redox. Estos sistemas permiten transformar la energía química en energía eléctrica mediante la acción de ciertos microorganismos (e.g. Geobacter sulfurreducens) que tienen la capacidad de oxidar compuestos orgánicos, acoplando dicha reacción a la reducción de un aceptor de electrones extracelular (e.g. electrodos). La fusión de dos campos tan diferentes como la microbiología y la electroquímica ha dado lugar a una disciplina nueva y versátil que requiere la sinergia de ambos. Esta tesis doctoral se compone de 5 capítulos, 3 de ellos experimentales, que exploran diferentes aspectos de los sistemas electroquímicos microbianos, utilizando como modelo de bacteria electroactiva a G. sulfurreducens. El objetivo principal de la investigación fue desarrollar nuevas estrategias para profundizar en la comprensión del proceso de transferencia de electrones extracelular (TEE), así como para explorar nuevas plataformas ioelectroquímicas. En vista de lo anterior, el Capítulo 1 explora el estado del arte sobre el uso de G. sulfurreducens en sistemas electroquímicos microbianos. Dicha bacteria posee la capacidad de establecer contacto electroquímico con aceptores extracelulares mediante a la presencia de una extensa red de citocromos de tipo c que conecta el citoplasma con el exterior celular. Con el fin de confirmar el papel de los citocromos de tipo c en la TEE se han realizado estudios de deleción génica para intentar obtener células incapaces de producir determinados citocromos tipo c. Sin embargo, las construcciones genética resultantes no mostraron el comportamiento (fenotipo) esperado por lo que, en esta tesis, nos planteamos un enfoque alternativo basado en el metabolismo asimilatorio del hierro y su efecto en la síntesis de grupos hemo. Desde un punto de vista microbiológico los sistemas clásicos que se emplean en el desarrollo de la electroquímica microbiana implican complejos montajes experimentales, largos períodos de acondicionamiento y costes sustanciales. En este sentido, la miniaturización de los dispositivos bioelectroquímicos puede suponer ventajas considerables, tales como respuestas en producción de corriente o la reducción de costes. Estas características serían especialmente deseables en sistemas electroanalíticos. Otro requisito para los sistemas electroquímicos microbianos es la formación de un biofilm bacteriano maduro, lo cual suele implicar largos períodos de tiempo. Este proceso podría simplificarse mediante la construcción artificial de un sistema bacteria-electrodo. De acuerdo con los retos identificados, el Capítulo 1 concluye describiendo los tres objetivos específicos que conforman esta tesis doctoral: i) Investigar el papel de los citocromos de Geobacter en la TEE, ii) Explorar los electrodos serigrafiados como instrumentos miniaturizados para una rápida evaluación electroquímica de microorganismos electroactivos, iii) Construir bioelectrodos artificiales basados en Geobacter Con el objetivo de confirmar el papel de los citocromos de tipo c en la TEE, el Capítulo 2 describe un método para el cultivo de células de G. sulfurreducens carentes de citocromos. Los análisis bioquímicos basados en la tinción específica del grupo hemo, junto a otros basados en espectrometría de masas y en espectroscopía Raman, demostraron que es factible modificar el contenido de citocromos en G. sulfurreducens limitando la disponibilidad de hierro en el medio de cultivo. Las células carentes de citocromos eran viables ya que pudieron reducir fumarato a succinato, una reacción a nivel de la membrana interna que no requiere citocromos, pero no fueron capaces de reducir hierro citrato (III) o de intercambiar electrones con un electrodo. Estos resultados confirmaron que los citocromos de tipo c son esenciales para la TEE en G. sulfurreducens. Teniendo en cuenta la necesidad de simplificar los aspectos electroquímicos, el Capítulo 3 investiga el uso de electrodos serigrafiados (SPEs) como una nueva plataforma de bajo coste para evaluar la actividad electroquímica microbiana a un nivel de microescala. Los SPEs resultaron ser válidos para identificar respuestas bioelectroquímicas, evitando complejos montajes. El sistema se validó mediante el estudio de la respuesta de G. sulfurreducens bajo diversos estados fisiológicos. Además, el uso de SPE y G. sulfurreducens reveló su potencial como biosensor para la cuantificación de acetato y para explorar muestras de naturaleza tan compleja como las aguas residuales urbanas. La identificación de consorcios electroactivos resultó ser otra de las aplicaciones de esta tecnología. Como aporte científico final, el Capítulo 4 explora una nueva estrategia para utilizar G. sulfurreducens en la de construcción bioelectrodos artificiales, mediante la inmovilización de las células en gel de sílice sobre electrodos de fieltro de carbono. El análisis de viabilidad confirmó que la mayoría de las células sobrevivieron al proceso de encapsulación y que la densidad celular no evolucionó, al menos, durante un período de 96 h. Esta doble encapsulación impide la liberación de bacterias del electrodo, pero permite la difusión de solutos, haciendo posible la caracterización electroquímica del sistema. Los bioelectrodos artificiales se evaluaron en sistemas de 3 electrodos durante varios días utilizando diversos donadores de electrones. El análisis voltamétrico de los bioelectrodos alimentados con acetato mostró una onda de oxidación catalítica sigmoidal desde el inicio, característica de biofilms más maduros. Además, se confirmó la presencia de G. sulfurreducens dentro de las fibras y del gel de sílice por microscopía electrónica de barrido y también se realizó un análisis transcriptómico para estudiar el efecto de la encapsulación a nivel intracelular. A partir de los resultados obtenidos, el Capítulo 5 presenta una discusión general, conclusiones y perspectivas de futuro. Este capítulo fue concebido con una estructura de preguntas y respuestas que confío ayude al lector a entender las razones que sustentaron tanto nuestra experimentación como la interpretación que hicimos de la misma. El valor fundamental de este trabajo es la naturaleza sencilla, rápida y económica de las herramientas proporcionadas que pueden ayudar a otros investigadores en el campo de la electroquímica microbiana

Novel bioelectrochemical approaches for exploring extracellular electron transfer in "Geobacter sulfurreducens"

Los sistemas electroquímicos microbianos son aquellos en los que los microorganismos actúan, en combinación con electrodos, como catalizadores de reacciones redox. Estos sistemas permiten transformar la energía química en energía eléctrica mediante la acción de ciertos microorganismos (e.g. Geobacter sulfurreducens) que tienen la capacidad de oxidar compuestos orgánicos, acoplando dicha reacción a la reducción de un aceptor de electrones extracelular (e.g. electrodos). La fusión de dos campos tan diferentes como la microbiología y la electroquímica ha dado lugar a una disciplina nueva y versátil que requiere la sinergia de ambos. Esta tesis doctoral se compone de 5 capítulos, 3 de ellos experimentales, que exploran diferentes aspectos de los sistemas electroquímicos microbianos, utilizando como modelo de bacteria electroactiva a G. sulfurreducens. El objetivo principal de la investigación fue desarrollar nuevas estrategias para profundizar en la comprensión del proceso de transferencia de electrones extracelular (TEE), así como para explorar nuevas plataformas ioelectroquímicas. En vista de lo anterior, el Capítulo 1 explora el estado del arte sobre el uso de G. sulfurreducens en sistemas electroquímicos microbianos. Dicha bacteria posee la capacidad de establecer contacto electroquímico con aceptores extracelulares mediante a la presencia de una extensa red de citocromos de tipo c que conecta el citoplasma con el exterior celular. Con el fin de confirmar el papel de los citocromos de tipo c en la TEE se han realizado estudios de deleción génica para intentar obtener células incapaces de producir determinados citocromos tipo c. Sin embargo, las construcciones genética resultantes no mostraron el comportamiento (fenotipo) esperado por lo que, en esta tesis, nos planteamos un enfoque alternativo basado en el metabolismo asimilatorio del hierro y su efecto en la síntesis de grupos hemo. Desde un punto de vista microbiológico los sistemas clásicos que se emplean en el desarrollo de la electroquímica microbiana implican complejos montajes experimentales, largos períodos de acondicionamiento y costes sustanciales. En este sentido, la miniaturización de los dispositivos bioelectroquímicos puede suponer ventajas considerables, tales como respuestas en producción de corriente o la reducción de costes. Estas características serían especialmente deseables en sistemas electroanalíticos. Otro requisito para los sistemas electroquímicos microbianos es la formación de un biofilm bacteriano maduro, lo cual suele implicar largos períodos de tiempo. Este proceso podría simplificarse mediante la construcción artificial de un sistema bacteria-electrodo. De acuerdo con los retos identificados, el Capítulo 1 concluye describiendo los tres objetivos específicos que conforman esta tesis doctoral: i) Investigar el papel de los citocromos de Geobacter en la TEE, ii) Explorar los electrodos serigrafiados como instrumentos miniaturizados para una rápida evaluación electroquímica de microorganismos electroactivos, iii) Construir bioelectrodos artificiales basados en Geobacter Con el objetivo de confirmar el papel de los citocromos de tipo c en la TEE, el Capítulo 2 describe un método para el cultivo de células de G. sulfurreducens carentes de citocromos. Los análisis bioquímicos basados en la tinción específica del grupo hemo, junto a otros basados en espectrometría de masas y en espectroscopía Raman, demostraron que es factible modificar el contenido de citocromos en G. sulfurreducens limitando la disponibilidad de hierro en el medio de cultivo. Las células carentes de citocromos eran viables ya que pudieron reducir fumarato a succinato, una reacción a nivel de la membrana interna que no requiere citocromos, pero no fueron capaces de reducir hierro citrato (III) o de intercambiar electrones con un electrodo. Estos resultados confirmaron que los citocromos de tipo c son esenciales para la TEE en G. sulfurreducens. Teniendo en cuenta la necesidad de simplificar los aspectos electroquímicos, el Capítulo 3 investiga el uso de electrodos serigrafiados (SPEs) como una nueva plataforma de bajo coste para evaluar la actividad electroquímica microbiana a un nivel de microescala. Los SPEs resultaron ser válidos para identificar respuestas bioelectroquímicas, evitando complejos montajes. El sistema se validó mediante el estudio de la respuesta de G. sulfurreducens bajo diversos estados fisiológicos. Además, el uso de SPE y G. sulfurreducens reveló su potencial como biosensor para la cuantificación de acetato y para explorar muestras de naturaleza tan compleja como las aguas residuales urbanas. La identificación de consorcios electroactivos resultó ser otra de las aplicaciones de esta tecnología. Como aporte científico final, el Capítulo 4 explora una nueva estrategia para utilizar G. sulfurreducens en la de construcción bioelectrodos artificiales, mediante la inmovilización de las células en gel de sílice sobre electrodos de fieltro de carbono. El análisis de viabilidad confirmó que la mayoría de las células sobrevivieron al proceso de encapsulación y que la densidad celular no evolucionó, al menos, durante un período de 96 h. Esta doble encapsulación impide la liberación de bacterias del electrodo, pero permite la difusión de solutos, haciendo posible la caracterización electroquímica del sistema. Los bioelectrodos artificiales se evaluaron en sistemas de 3 electrodos durante varios días utilizando diversos donadores de electrones. El análisis voltamétrico de los bioelectrodos alimentados con acetato mostró una onda de oxidación catalítica sigmoidal desde el inicio, característica de biofilms más maduros. Además, se confirmó la presencia de G. sulfurreducens dentro de las fibras y del gel de sílice por microscopía electrónica de barrido y también se realizó un análisis transcriptómico para estudiar el efecto de la encapsulación a nivel intracelular. A partir de los resultados obtenidos, el Capítulo 5 presenta una discusión general, conclusiones y perspectivas de futuro. Este capítulo fue concebido con una estructura de preguntas y respuestas que confío ayude al lector a entender las razones que sustentaron tanto nuestra experimentación como la interpretación que hicimos de la misma. El valor fundamental de este trabajo es la naturaleza sencilla, rápida y económica de las herramientas proporcionadas que pueden ayudar a otros investigadores en el campo de la electroquímica microbiana

Comparative analysis and supragenome modeling of twelve Moraxella catarrhalis clinical isolates

Contains fulltext : 97744.pdf (publisher's version ) (Open Access)BACKGROUND: M. catarrhalis is a gram-negative, gamma-proteobacterium and an opportunistic human pathogen associated with otitis media (OM) and exacerbations of chronic obstructive pulmonary disease (COPD). With direct and indirect costs for treating these conditions annually exceeding $33 billion in the United States alone, and nearly ubiquitous resistance to beta-lactam antibiotics among M. catarrhalis clinical isolates, a greater understanding of this pathogen's genome and its variability among isolates is needed. RESULTS: The genomic sequences of ten geographically and phenotypically diverse clinical isolates of M. catarrhalis were determined and analyzed together with two publicly available genomes. These twelve genomes were subjected to detailed comparative and predictive analyses aimed at characterizing the supragenome and understanding the metabolic and pathogenic potential of this species. A total of 2383 gene clusters were identified, of which 1755 are core with the remaining 628 clusters unevenly distributed among the twelve isolates. These findings are consistent with the distributed genome hypothesis (DGH), which posits that the species genome possesses a far greater number of genes than any single isolate. Multiple and pair-wise whole genome alignments highlight limited chromosomal re-arrangement. CONCLUSIONS: M. catarrhalis gene content and chromosomal organization data, although supportive of the DGH, show modest overall genic diversity. These findings are in stark contrast with the reported heterogeneity of the species as a whole, as wells as to other bacterial pathogens mediating OM and COPD, providing important insight into M. catarrhalis pathogenesis that will aid in the development of novel therapeutic regimens

Long-Term Behavior of Defined Mixed Cultures of Geobacter sulfurreducens and Shewanella oneidensis in Bioelectrochemical Systems

This work aims to investigate the long-term behavior of interactions of electrochemically active bacteria in bioelectrochemical systems. The electrochemical performance and biofilm characteristics of pure cultures of Geobacter sulfurreducens and Shewanella oneidensis are being compared to a defined mixed culture of both organisms. While S. oneidensis pure cultures did not form cohesive and stable biofilms on graphite anodes and only yielded 0.034 ± 0.011 mA/cm2 as maximum current density by feeding of each 5 mM lactate and acetate, G. sulfurreducens pure cultures formed 69 μm thick, area-wide biofilms with 10 mM acetate as initial substrate concentration and yielded a current of 0.39 ± 0.09 mA/cm2. Compared to the latter, a defined mixed culture of both species was able to yield 38% higher maximum current densities of 0.54 ± 0.07 mA/cm2 with each 5 mM lactate and acetate. This increase in current density was associated with a likewise increased thickness of the anodic biofilm to approximately 93 μm. It was further investigated whether a sessile incorporation of S. oneidensis into the mixed culture biofilm, which has been reported previously for short-term experiments, is long-term stable. The results demonstrate that S. oneidensis was not stably incorporated into the biofilm; rather, the planktonic presence of S. oneidensis has a positive effect on the biofilm growth of G. sulfurreducens and thus on current production

Long-Term Behavior of Defined Mixed Cultures of Geobacter sulfurreducens and Shewanella oneidensis in Bioelectrochemical Systems

This work aims to investigate the long-term behavior of interactions of electrochemically active bacteria in bioelectrochemical systems. The electrochemical performance and biofilm characteristics of pure cultures of Geobacter sulfurreducens and Shewanella oneidensis are being compared to a defined mixed culture of both organisms. While S. oneidensis pure cultures did not form cohesive and stable biofilms on graphite anodes and only yielded 0.034 ± 0.011 mA/cm2 as maximum current density by feeding of each 5 mM lactate and acetate, G. sulfurreducens pure cultures formed 69 μm thick, area-wide biofilms with 10 mM acetate as initial substrate concentration and yielded a current of 0.39 ± 0.09 mA/cm2. Compared to the latter, a defined mixed culture of both species was able to yield 38% higher maximum current densities of 0.54 ± 0.07 mA/cm2 with each 5 mM lactate and acetate. This increase in current density was associated with a likewise increased thickness of the anodic biofilm to approximately 93 μm. It was further investigated whether a sessile incorporation of S. oneidensis into the mixed culture biofilm, which has been reported previously for short-term experiments, is long-term stable. The results demonstrate that S. oneidensis was not stably incorporated into the biofilm; rather, the planktonic presence of S. oneidensis has a positive effect on the biofilm growth of G. sulfurreducens and thus on current production