United in Diversity: Mechanosensitive Ion Channels in Plants

Mechanosensitive (MS) ion channels are a common mechanism for perceiving and responding to mechanical force. This class of mechanoreceptors is capable of transducing membrane tension directly into ion flux. In plant systems, MSion channels have been proposed to play a wide array of roles, from the perception of touch and gravity to the osmotic homeostasis of intracellular organelles. Three families of plant MS ion channels have been identified: the MscS-like (MSL), Mid1-complementing activity (MCA), and two-pore potassium (TPK) families. Channels from these families vary widely in structure and function, localize to multiple cellular compartments, and conduct chloride, calcium, and/or potassium ions. However, they are still likely to represent only a fraction of the MS ion channel diversity in plant systems

Piezo1: Proteins for mechanotransduction and integration of endothelial shear stress & intravascular pressure

Piezo proteins are transmembrane ion channels, specialized in detecting mechanosensitive stimuli and transduce mechanical forces into biochemical signals. Piezo proteins research has helped understand physiological mechanisms, but the integrative role that Piezo1 plays in the regulation of the microvasculature has remained unstudied. Our main objective was to characterize ex vivo microvascular responses to the blockade of Piezo1 mechanotransduction in male (n=29) and female (n=24) Sprague-Dawley (SD) rats. Gracilis arterioles (GA) and middle cerebral arterioles (MCA) were harvested for ex-vivo vessel preparations. After vessel viability confirmation, every vessel was submitted to myogenic and flow challenges under control conditions and after Grammostola Mechanotoxin 4 (GsMTx4) incubation to blocking Piezo1 channels, to quantify the homeostatic response of arterioles before and after Piezo1 antagonism. We are able to report Piezo1 as indispensable component in vascular smooth muscle cells (VSMC) and Endothelial cells (EC) to sense and change vessel diameter based on intravascular pressure and shear stress, correspondingly. Also, we report for the first time a heterogeneous response in males and females after Piezo1 antagonism in representative resistance arterioles from the skeletal muscle and cerebral circulation

To Be, or Not to Be: Cellular Homeostasis to Mechanical Perturbations

Mechanical homeostasis is an emerging mechanobiology concept that describes the critical biological process to maintain whole-cell/tissue physiology against forces and deformation arising both intra- and extracellularly. Dysregulation of mechanical homeostasis has important implications in pathophysiological conditions such as developmental defect, cardiovascular and pulmonary diseases, and cancer. Mechanical homeostasis has been commonly investigated at molecular, cellular, tissue levels and beyond. However, in mechanical homeostasis collective dynamics at smaller scales and its functional relationship with emergent system-level properties at larger scales remains elusive. The major contribution of this dissertation is to provide a detailed picture of the functional link between molecular and subcellular events and apparent cellular behaviors under mechanical perturbations. A novel suite of technologies, involving microfabrication, live-cell imaging, high-throughput and multidimensional image processing, and mechanical characterization, have been developed and implemented in this research for the live-cell study of both subcellular and cellular aspects of mechanical homeostasis. By utilizing these techniques, we performed cell stretch experiments and quantitative measurements of biomechanical and biochemical responses with a spatiotemporal resolution to examine cell behaviors upon mechanical perturbation. Our data have revealed that cellular mechanical homeostasis is an emergent phenomenon driven by collective and graduated, yet non-homeostatic, subcellular behaviors (“subcellular rheostasis”) that follow distinct mechanosensitive compensatory paths. We have for the first time shown that subcellular dynamics would observe patterns different from that at the single-cell level. Further investigations have revealed that impairment to the extracellular matrix (ECM) – focal adhesion (FA) – cytoskeleton (CSK) mechanical linkage can lead to an effective exit from cellular mechanical homeostasis by skewing the subcellular rheostasis pattern of FAs, which might be a sensitive gating mechanism of cellular homeostasis. Lastly, a mechano-biophysical model has been constructed in this work to quantitatively recapitulate experimental observations of subcellular rheostasis and its perturbation by different drug treatments. Cross-examination of experimental and theoretical modeling results has unveiled the regulatory roles of different mechanosensitive machineries including catch-slip bonds and myosin motor activity in governing the emergence of cellular mechanical homeostasis.PHDMechanical EngineeringUniversity of Michigan, Horace H. Rackham School of Graduate Studieshttp://deepblue.lib.umich.edu/bitstream/2027.42/135780/1/shinuow_1.pd

Extrinsic primary afferent signalling in the gut

Visceral sensory neurons activate reflex pathways that control gut function and also give rise to important sensations, such as fullness, bloating, nausea, discomfort, urgency and pain. Sensory neurons are organised into three distinct anatomical pathways to the central nervous system (vagal, thoracolumbar and lumbosacral). Although remarkable progress has been made in characterizing the roles of many ion channels, receptors and second messengers in visceral sensory neurons, the basic aim of understanding how many classes there are, and how they differ, has proven difficult to achieve. We suggest that just five structurally distinct types of sensory endings are present in the gut wall that account for essentially all of the primary afferent neurons in the three pathways. Each of these five major structural types of endings seems to show distinctive combinations of physiological responses. These types are: 'intraganglionic laminar' endings in myenteric ganglia; 'mucosal' endings located in the subepithelial layer; 'muscular–mucosal' afferents, with mechanosensitive endings close to the muscularis mucosae; 'intramuscular' endings, with endings within the smooth muscle layers; and 'vascular' afferents, with sensitive endings primarily on blood vessels. 'Silent' afferents might be a subset of inexcitable 'vascular' afferents, which can be switched on by inflammatory mediators. Extrinsic sensory neurons comprise an attractive focus for targeted therapeutic intervention in a range of gastrointestinal disorders.Australian National Health and Medical Research Counci

Mechanical synchronization of Xenopus tail regeneration

Tese de Mestrado, Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, 2021, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasEpimorphic regeneration is a complex and synchronous process that involves three major phenotypical phases: wound healing, regeneration bud formation and a consequent regenerative outgrowth. While regeneration occurs within a multifactorial microenvironment, where biochemical and mechanical cues are in place, most studies focus in the biochemical signalling underlying the transition across these phases. Thus, despite the wide biological functions that mechanical signals, their role in regeneration remains largely unclear. Therefore, to assess the role of relevant mechanical signals in regeneration, we use the tadpole tail of Xenopus laevis as a regeneration model. Using a specific toxin, we demonstrate that mechanosensitive stretch-activated channels are required for proper tail regeneration. In particular, we identify that these channels are essential for the wound healing and bud formation phases. Moreover, the expression of key molecular regulators of regeneration was downregulated by the same treatment. Interestingly, this downregulated expression profile is comparable to the observed in the non-regenerative refractory period. Collectively, our data unveils the role of mechanically activated channels in regeneration and opens the discussion on the potential mechanism by which mechano-signalling may mediate transcriptional responses that favour regeneration.A regeneração pode ser definida como a capacidade de recrescimento de um órgão ou membro após uma lesão ou amputação; este recrescimento devolve a forma, padrão e função da parte do corpo perdida. Esta área de estudo para além de poder ser investigada a diversos níveis de organização biológica varia também a nível taxonómico, suscitando ao longo de décadas o interesse de diversos investigadores. Nos vertebrados, podemos encontrar a regeneração epimórfica, um processo complexo e síncrono desencadeado por um dano de grande escala. Pode dizer-se que se desenvolve em três fases fenotípicas principais e distintas: a cicatrização do local da ferida, a formação do botão de regeneração, também designado por blastema, e o consequente crescimento regenerativo do membro perdido. As alterações morfológicas observadas no decorrer das três fases são o resultado de consecutivos rearranjos celulares tanto em posição, como em número e forma, entre outros. O comportamento das células é consequência dos sinais que esta recebe do seu microambiente, nomeadamente das interações com outras células circundantes e/ou com o ambiente onde se encontra. Ao longo de décadas, diversos estudos têm vindo a ser realizados com o objetivo de caracterizar os intervenientes moleculares nos mecanismos de comunicação e sinalização celular no desenrolar do processo regenerativo e particularmente nas transições morfologicas a ele inerentes. Destes estudos surgiram fatores como o Transforming growth factor beta (TGF-β), Sonic hedghog (Shh), Bone morphogenetic proteins (BMP), Fibroblast growth factor (FGF), entre outros, que se creem ser potenciais intervenientes no processo. Contudo, a verdade é que, a regeneração ocorre dentro de um microambiente multifatorial, isto é, sinais bioquímicos e mecânicos estão presentes, porém a investigação científica concentra-se maioritariamente no estudo da sinalização bioquímica subjacente às transições entre as fases do processo regenerativo. Apesar de amplas funções biológicas serem atribuídas aos sinais mecânicos, o seu papel na regeneração permanece ainda pouco evidente. Tendo isto em conta, o nosso estudo visa revelar um pouco do seu papel neste processo. Um excelente modelo animal para avaliar o papel da sinalização mecânica na regeneração é a cauda do girino de Xenopus laevis. De facto, neste modelo animal a regeneração total da cauda é observável num curto período de tempo - apenas sete dias após a amputação - e implica algum nível de complexidade biológica visto que tem de ocorrer a regeneração de todos os tecidos axiais do membro - como o tecido muscular, nervoso e da epiderme. Para além disso, o girino de Xenopus laevis é dotado de um período no seu desenvolvimento designado de refratário, durante o qual ocorre a cicatrização do local da lesão, mas não a regeneração do membro perdido. O processo regenerativo pode ser avaliado usando dois métodos: o índice de regeneração, que avalia a morfologia da cauda regenerada; e, como medida complementar, a área da cauda pós amputação. Com o presente estudo, corroborámos que a capacidade regenerativa depende do estádio de desenvolvimento do girino. Através da comparação entre o estádio 41 - regenerativo - e o estádio 47 - não regenerativo - contatámos que efetivamente, existe uma diminuição da capacidade regenerativa no período refratário. A necessidade temporal dos sinais mecânicos foi avaliada através da incubação dos girinos, nos períodos de tempo desejados - definidos pelos eventos morfológicos da regeneração - num meio com uma toxina específica - GsMTx4 - conhecida por causar a inibição dos canais sensíveis a sinais mecânicos, ativados pela extensão elástica da membrana celular - Stretch activated channels. Conseguimos demonstrar que estes são necessários para uma regeneração eficiente e bem-sucedida da cauda. Os alvos atualmente conhecidos deste péptido são os canais: Piezo1 e Transient receptor potential channel 1 e Transient receptor potential channel 6. Neste ensaio identificamos ainda que esses canais são fundamentais nas primeiras vinte e quatro horas da regeneração, mais precisamente, as fases de cicatrização da ferida e formação do blastema, conhecidas por serem cruciais para alcançar um processo bem-sucedido em forma e função. Um dos alvos de GsMTx4 reportado é o canal Piezo1. Para testar o seu eventual envolvimento no decorrer do processo de regeneração, diminuímos a sua expressão e avaliámos o fenótipo observado. Com a utilização de um morpholino específico para o canal em estudo verificamos que existe uma tendência em que os girinos submetidos ao tratamento apresentam um fenótipo caracterizado como “defeituoso”, ou seja, é prevalente o fenótipo de ausência de regeneração ou regeneração muito defeituosa. Levando em consideração estes resultados podemos especular que o canal Piezo1 é um potencial candidato a gene regulador da capacidade regenerativa. De modo a compreender melhor como o bloqueio por inibição dos canais mecânicos afeta o comportamento celular ao nível da expressão génica avaliámos por Polymerase chain reaction (PCR) a expressão dos principais contribuintes moleculares da regeneração. Com base em literatura da área foram selecionados marcadores para cada fase da regeneração - cicatrização do local da ferida, formação do botão de regeneração e crescimento do membro - respetivamente, TGF-β, Msh Homeobox 1 (Msx1) e Shh. Com a nossa análise da expressão temporal entre controlo e tratamento fomos capazes de corroborar a expressão destes marcadores como específicos para cada fase, e, para além disso, constatar que os seus níveis de transcrição foram reduzidos pelo tratamento com GsMTx4. Curiosamente, este perfil de expressão é comparável ao observado no período refratário, isto é, não regenerativo. Tendo em conta o conjunto dos dados adquirimos, podemos inferir que os marcadores avaliados neste estudo atuam a jusante dos canais mecânicos na sua cascata de sinalização. Assim sendo, no contexto do processo regenerativo, a mecanotransdução celular através destes canais, encontra-se a interferir em vias de sinalização bem estabelecidas e conhecidas nesta área de estudo. É ainda importante salientar que a análise de expressão génica serviu como pré-teste para futuramente conduzir as amostras para sequenciação do ácido ribonucleico (RNA-seq). Com certeza os resultados desta análise irão abrir o leque de potenciais intervenientes alvo no processo de regeneração. De uma maneira global, a verdade é que o impacto dos sinais mecânicos na regeneração é ainda escassamente estudado apesar de existirem evidências literárias de uma diversidade de funções biológicas desencadeadas pelos mesmos. Neste sentido, a nossa investigação tem como objetivo elucidar o seu papel e averiguar a sua necessidade ao longo do tempo. Posto isto, no presente estudo, fomos capazes, por meio da inibição dos canais previamente mencionados, de manipular como as células detetam e consequentemente respondem aos sinais mecânicos. Demonstrámos, de facto, a importância da mecanotransdução na área da regeneração e a sua necessidade ao longo do tempo. Mais concretamente, a ativação dos canais sensíveis a estímulos mecânicos ativados pela extensão elástica da membrana celular é essencial para a fase inicial do processo de regeneração, que engloba as fases de cicatrização de ferida e a formação do blastema. Em suma, a regeneração e o desenvolvimento embrionário, partilham as principais vias de sinalização celular e os principais mecanismos comuns, deste modo, os canais sensíveis a sinais mecânicos podem estar envolvidos em diferentes circunstâncias para além da regeneração de tal modo que as evidências demonstradas neste estudo podem ser transversais. Com a nossa investigação abrimos a discussão sobre o potencial mecanismo pelo qual a sinalização através de sinais mecânicos pode mediar as respostas transcricionais que favorecem a regeneração, e ainda despoleta a curiosidade e novas investigações na ampla área que é a biologia do desenvolvimento

Tensile Forces and Mechanotransduction at Cell-Cell Junctions

Cell-cell junctions are specializations of the plasma membrane responsible for physically integrating cells into tissues. We are now beginning to appreciate the diverse impacts that mechanical forces exert upon the integrity and function of these junctions. Currently, this is best understood for cadherin-based adherens junctions in epithelia and endothelia, where cell-cell adhesion couples the contractile cytoskeletons of cells together to generate tissue-scale tension. Junctional tension participates in morphogenesis and tissue homeostasis. Changes in tension can also be detected by mechanotransduction pathways that allow cells to communicate with each other. In this review, we discuss progress in characterising the forces present at junctions in physiological conditions; the cellular mechanisms that generate intrinsic tension and detect changes in tension; and, finally, we consider how tissue integrity is maintained in the face of junctional stresses

Mechanoregulation of angiopoietin-like 4 in epithelial-mesenchymal transition and cancer metastasis

The epithelial-mesenchymal transition (EMT) serves as a pivotal mechanism in the progression of metastatic cancer. However, current research, predominantly reliant on 2D monolayer cultures, inadequately replicates the intricate nature of a 3D tumor microenvironment. In the main project (Paper I), we investigated the transcriptomes of various cancer cell types undergoing EMT in both 2D and 3D cultures with different EMT inducers. We identified a 3D EMT gene signature that has broad implications across different types of human cancers. Angiopoietin-like 4 protein (ANGPTL4) was found to be a top ranked hub gene with clinical relevance and impact. Our study also revealed the mechanoregulation of ANGPTL4, which corroborated with its high expression in advanced tumors. Consistently, ANGPTL4 deficiency attenuated primary tumor growth and EMT of cancer cells. These findings suggest that targeting ANGPTL4 may be a promising approach to inhibit EMT and prevent cancer progression. In the collaborative project (Paper II), we studied the regulation of membrane microenvironment and signal transduction in natural killer (NK) cells, a group of innate immune cells involved in the tumor microenvironment (TME) and cancer immunotherapy. Here, we revealed the PIP2-regulated recruitment of DAP12 homodimer to lipid raft boundary of NK cells. In another collaborative project (Paper III), we introduce HTCA, a single-cell RNA-sequencing database with various user-friendly analysis tools. Collectively, our main findings reflect the intricate regulation of physical stiffness within the TME influencing EMT signaling in cancer cells, where ANGPTL4 emerges as a crucial player. Our comprehensive analyses strongly underscore the clinical significance of ANGPTL4, particularly in advanced stage cancer, aligning with our broader understanding of tumors in patients. In essence, our study vividly demonstrates how the TME's stiffness orchestrates the mechanoregulation of ANGPTL4, a hub gene within the 3D EMT gene signature