Merieliöperäiset yhdisteet uusien viruslääke-ehdokkaiden seulonnassa

Viruses are accountable for numerous diseases that form an immense threat to public health worldwide. The capability of viruses to continuously adapt to a changing environment makes the discovery of new treatments for viral diseases crucial. Natural products play an important role in the discovery of new drug candidates, essentially as a source of lead compounds that can be chemically optimized to achieve improved drug properties, such as safety and efficacy. In natural product drug discovery, the marine environment offers outstanding potential to discover new compounds with interesting bioactive properties. Marine species and their unique metabolites are still only partly discovered, and at the same time, vulnerable marine environments are threatened by human activities through pollution, overexploitation and climate change. The protection of marine biodiversity and sustainable use of marine resources is therefore a vital part of the study of marine organisms and their metabolites. This dissertation focuses on studying the antiviral properties of marine-derived compounds and their synthetic derivatives. The first part of this study covers screening of crude extracts from the Indian Ocean soft coral Sinularia kavarattiensis in a chikungunya virus replicon model followed by bioactivity-guided isolation and further study of the purified compounds. This study led to the isolation of six known norcembranoid compounds and the isolation and characterization of one novel compound, kavaranolide. Two of the isolated compounds were moderately active in the chikungunya replicon model, but also showed cytotoxic properties. The second part of the research focuses on studying the antiviral potential of synthetic compounds inspired by the marine sponge-derived alkaloids clathrodin and oroidin. In the screening of a compound library of 157 clathrodin and oroidin analogues in chikungunya virus and hepatitis C virus replicon models, four compounds were discovered to selectively inhibit the hepatitis C replicon with IC50-values ranging from 1.6 to 4.6 µM. Interaction with the cellular chaperone Hsp90 was proposed as the mechanism of action underlying the activity, and this hypothesis was supported by the results from molecular modelling and microscale thermophoresis interaction studies. Based on the study of clathrodin and oroidin analogues, 12 new compounds with a 4,5,6,7-tetrahydrobenzo[1,2-d]thiazole structure were synthesized, in order to obtain improved binding to Hsp90 and improved antiviral properties. Three of the synthesized compounds showed improved binding to Hsp90 and specific inhibition in hepatitis C genotype 1b and 2a replicon models and moreover, inhibited the replication of full-length hepatitis C genotype 2a virus in a reporter virus RNA assay (IC50-values 0.03–0.6 µM). As Hsp90 is a host protein utilized by the viral replication machinery, antiviral activity achieved through inhibition of Hsp90 could be an attractive strategy to combat resistant viral strains.Virukset ovat taudinaiheuttajia, jotka muodostavat merkittävän kansanterveysuhan maailmanlaajuisesti. Viruksilla on ilmiömäinen kyky mukautua jatkuvasti muuttuvaan ympäristöön ja siksi uusien virustautien hoitomenetelmien kehittäminen on elintärkeää. Luonnonaineilla on tärkeä rooli uusien lääkeaineiden etsinnässä. Luonnonainesta voidaan eristää niin sanottuja johtolankayhdisteitä, joiden ominaisuuksia on mahdollista muokata kemiallisesti ja näin saavuttaa turvallisempia ja tehokkaampia lääkeaine-ehdokkaita. Luonnonaineiden tutkimuksessa merenalaiseen ympäristöön kätkeytyy valtava potentiaali löytää uusia yhdisteitä, joita voidaan hyödyntää uusien lääkkeiden kehityksessä. Merien lajikirjosta ja merieliöiden tuottamista ainutlaatuisista kemiallisista yhdisteistä on tutkittu vasta murto-osa. Samaan aikaan ihmisen toiminta, kuten saastuttaminen, luonnonvarojen liikakulutus ja ilmastonmuutos, uhkaa ympäristöämme vakavammin kuin koskaan. Monimuotoisuuden suojeleminen ja luonnonvarojen kestävä käyttö on sen vuoksi keskeinen osa merieliöiden ja niiden tuottamien yhdisteiden tutkimusta. Tämän väitöskirjatyön tavoitteena oli merieliöistä lähtöisin olevien yhdisteiden ja niiden synteettisten johdannaisten ominaisuuksien tutkiminen uusien viruslääkekehitykseen soveltuvien yhdisteiden löytämiseksi. Tutkimuksen ensimmäinen osa kattaa Intian valtameressä esiintyvän Sinularia kavarattiensis -korallilajin ominaisuuksien tutkimuksen solumallissa, joka jäljittelee chikungunyaviruksen lisääntymistä. Alustavan seulonnan jälkeen tutkittiin koralliuutteesta eristettyjen yhdisteiden ominaisuuksia. Tämä johti kuuden ennestään tunnetun yhdisteen eristämiseen ja yhden uuden yhdisteen, kavaranolidin, löytymiseen, ja näiden yhdisteiden ominaisuuksien määrittämiseen. Kahdella yhdisteistä havaittiin aktiivisuutta chikungunyavirusmallissa, mutta niillä todettiin olevan myös solujen elinkykyä heikentäviä ominaisuuksia. Tutkimuksen toisessa osassa keskityttiin selvittämään kahden sienieläimistä peräisin olevan yhdisteen, klatrodiinin ja oroidiinin johdannaisten potentiaalia virusten monistumisen estäjinä. Yhteensä 157 klatrodiini- ja oroidiinijohdannaista sisältävä yhdistekirjasto seulottiin chikungunyaviruksen ja hepatiitti C -viruksen solumalleissa. Alustavassa seulonnassa neljän yhdisteen havaittiin estävän hepatiitti C:n monistumista solumallissa. Mahdollisena vaikutusmekanismina pidettiin solunsisäisen lämpöshokkiproteiini Hsp90:n toiminnan estoa, ja tätä hypoteesia tukivat sekä tietokoneavusteisen molekyylimallinnuksen että molekyylitason vuorovaikutustutkimuksen tulokset. Klatrodiinin ja oroidiinin johdannaisten tutkimuksen ensimmäisen vaiheen perusteella kehitettiin 12 uutta yhdistettä, tavoitteena parantaa virusten monistumista estäviä ominaisuuksia ja sitoutumista Hsp90-proteiiniin. Kolme yhdistettä osoitti voimakkaampaa sitoutumista Hsp90-proteiiniin, ja lisäksi ne olivat tehokkaita viruksen monistumista jäljittelevissä solumalleissa kahta hepatiitti C:n alatyyppiä vastaan. Nämä kolme yhdistettä olivat tehokkaita myös solukokeissa, jossa tutkittiin vaikutusta kokonaisen hepatiitti C-viruksen monistumiseen. Hsp90-proteiinit ovat isäntäsolun proteiineja, joita usea virus hyödyntää monistuakseen. Siksi vaikutusmekanismiltaan Hsp90:n estämiseen perustuvat viruslääkkeet voisivat olla tehokkaita, kenties mahdollistaen samalla myös lääkkeille vastustuskykyisten viruskantojen aiheuttamien infektioiden lääkinnän

Towards the development of inhibitors of the bacterial glyoxalase system using kinetic target guided synthesis

The rise of multi drug resistant (MDR) pathogens is one of the greatest challenges we currently face. The first antibiotic was discovered in the 19 th century and resistance to existing antibacterial drugs emerged rapidly . D rugs which act via new or underexploited mechanisms of action and resistance breakers are ur gently required. Bacteria in the human body are exposed to a variety of stresses and the ability to react to and neutralise such stresses is essential for bacterial survival. ɑ K etoaldehyde methylglyoxal (MG), which bacteria produce endogenously but to which they are also exposed to in the host reacts with the nucleophilic groups in DNA, protein, and lipid s to form adducts, leading to the formation of advance d glycation end produ cts (AGEs), the degradation and inactivation of protein s and lipids and modifications to DNA. T he rapid detoxification of MG is therefore essential for bacterial survival. MG is mainly neutralized in a glutathione ( dependent manner by the action of two enzymes, G lyoxalase I (Glx I) and G lyoxalase II (Glx II). Our hypothesis is that inhibitors of the bacterial glyoxalase enzyme system could ex hibit bactericidal activity, by acting either alone or synergistic ally with existing antibiotics. To efficiently assemble inhibitors to investigate our hypothesis kinetic target guided synthesis (KTGS was employed B iased and unbiased KTGS of inhibitors towards E. coli Glx II w as carried out in collaboration with Dr Carrie A nne Molyneaux. The unbiased synthesis towards E. coli Glx I was unsuccessful after numerous attempts . However, the crystal structure of E. coli Glx I was determined to 1. 2 Å resolution and c omplexes with natural substrate (GSH) and inhibitor (Gaz) were obtained at 2.5 and 2.6 Å resolutio

Establishment of a fully automatized microfluidic platform for the screening and characterization of novel Hepatitis B virus capsid assembly modulators

El procés de descobriment de fàrmacs s'enfronta a importants desafiaments a causa de la constant disminució dels guanys per medicament atesa la disminució en les noves aprovacions de la FDA combinada amb el constant augment dels costos i el temps de desenvolupament. Les plataformes integrades de detecció usant microfluídica van sorgir com a possibles solucions per accelerar el desenvolupament de molècules actives i reduir els requisits de temps i costos. El projecte VIRO-FLOW té com a objectiu identificar nous agents curatius per al virus de l'hepatitis B (VHB), integrant els avantatges de la química de flux continu amb tecnologies de bioassaigs in vitro en microfluídica. Durant aquesta tesi es va construir un sistema microfluídic aplicant dispositius modulars automatitzats. Es van redactar protocols d'avaluació per a les dades de fluorescència i reflexió, permetent el càlcul del factor Z, les desviacions estàndard, les corbes de dilució i els valors de concentracions efectives mitjanes màximes (EC50). La proteïna central del VHB (HBc) es va seleccionar com a objectiu principalEl proceso de descubrimiento de fármacos se enfrenta a importantes desafíos debido a la constante disminución de las ganancias por medicamento dada la disminución en las nuevas aprobaciones de la FDA combinada con el constante aumento de los costes y el tiempo de desarrollo. Las plataformas integradas de detección usando microfluídica surgieron como posibles soluciones para acelerar el desarrollo de moléculas activas y reducir los requisitos de tiempo y costes. El proyecto VIRO-FLOW tiene como objetivo la identificación de nuevos agentes curativos para el virus de la hepatitis B (VHB), integrando las ventajas de la química de flujo continuo con tecnologías de bioensayos in vitro en microfluídica. Durante la presente tesis se construyó un sistema microfluídico aplicando dispositivos modulares automatizados. Se redactaron protocolos de evaluación para los datos de fluorescencia y reflexión, permitiendo el cálculo del factor Z, desviaciones estándar, curvas de dilución y valores de concentraciones efectivas medias máximas (EC50). La proteína central del VHB (HBc) se seleccionó como objetivo principal.Drug Discovery as known today faces major challenges due to the constant decrease of earnings per drug given the decrease in new FDA approvements combined with the steadily rising development costs and time. Integrated microfluidic screening platforms emerged as possible solutions by accelerating the hit-to-lead development cycle and reducing time and cost requirements. The VIRO-FLOW project aims at the fast and efficient identification of novel curative agents for the Hepatitis B Virus (HBV), integrating the advantages of continuous flow chemistry with in vitro microfluidic bioassay technologies. During the present thesis a microfluidic system was built, applying automatized modular devices. Evaluation protocols were written for the fluorescence and reflection data, allowing the Z´-factor calculation, standard deviations, dilution curves, and half‐maximal effective concentrations (EC50) values. HBV core protein (HBc) was selected as primary target due to the ongoing demand for a functional cure to reduce the economic and social challenges imposed by the chronic diseas

An in vivo platform for identifying inhibitors of protein aggregation

Protein aggregation underlies an array of human diseases, yet only one small molecule therapeutic has been successfully developed to date. Here, we introduce an in vivo system, based on a β-lactamase tripartite fusion construct, capable of identifying aggregation-prone sequences in the periplasm of Escherichia coli and inhibitors that prevent their aberrant self-assembly. We demonstrate the power of the system using a range of proteins, from small unstructured peptides (islet amyloid polypeptide and amyloid β) to larger, folded immunoglobulin domains. Configured in a 48-well format, the split β-lactamase sensor readily differentiates between aggregation-prone and soluble sequences. Performing the assay in the presence of 109 compounds enabled a rank ordering of inhibition and revealed a new inhibitor of IAPP aggregation. This platform can be applied to both amyloidogenic and other aggregation-prone systems, independent of sequence or size, and can identify small molecules or other factors able to ameliorate or inhibit protein aggregation

Application of fragment-based methods for the development of Pseudomonas aeruginosa anti-virulence compounds

Pseudomonas aeruginosa is the cause of nosocomial infections and recurrent pneumonia in cystic fibrosis patients. Antibiotic treatment becomes increasingly difficult due to the spreading of multi-drug resistant strains and its ability to grow in a biofilm. The virulence of this pathogen is mainly controlled by quorum sensing (QS) systems. This process enables bacteria to coordinate the expression of virulence factors and biofilm formation as a function of cell density. For this purpose, P. aeruginosa utilize among others the pqs (Pseudomonas Quinolone Signal) system. In this study anti-virulence agents were developed interfering with the pqs system. During a fragment-based drug discovery campaign antagonists of the Pseudomonas Quinolone Signal Receptor (PqsR) were synthesized. Based on hits identified in a surface plasmon resonance (SPR) screening, novel lead structures were generated. This development process involved selective synthetic modifications of the hit structures and structure-based design methods. Fragments were successfully merged with moieties of an alternative compound class. The optimized structures displayed potent reduction of virulence factors and signaling molecules in P. aeruginosa. During another fragment screening the first synthetic PqsE ligands were identified. The binding mode of these fragments was elucidated. Furthermore, it was shown that the inhibition of the enzymatic activity did not translate into an effect on its virulence regulatory role.Pseudomonas aeruginsa ist ein Erreger nosokomialer Infektionen sowie von Pneumonien bei Patienten mit zystischer Fibrose. Die Antibiotikatherapie wird durch das vermehrte Auftreten von multiresistenten Stämmen und die Ausbildung von Biofilmen erschwert. Die Virulenz des Erregers wird hauptsächlich durch Quorum Sensing reguliert. Dies ermöglicht es dem Bakterium die Bildung von Virulenzfaktoren und Biofilmen in Abhängigkeit von der Zelldichte zu koordinieren. P. aeruginosa nutzt hierfür unter anderem das pqs (Pseudomonas Quinolone Signal) System. In dieser Arbeit wurden Substanzen entwickelt, die in dieses System eingreifen. Zunächst wurden in einem Fragment-basiertem Ansatz PqsR Antagonisten synthetisiert. Ausgehend von Fragmenten, die einem Surface Plasmon Resonance (SPR) Screening gefunden wurden, konnten neue Leitstrukturen generiert werden. Dies gelang durch gezielte synthetische Modifikation der Ausgangsverbindungen und dem Einsatz Struktur-basierter Methoden. Weiterhin konnten Fragmente mit Motiven aus einer anderen Strukturklasse erfolgreich kombiniert werden. Die optimierten Strukturen zeigten eine potente Absenkung der Virulenz und der Produktion von Signalmolekülen in P. aeruginosa. In einem weiteren Fragment Screening wurden die ersten synthetischen PqsE Liganden identifiziert und ihr Bindungsmodus aufgeklärt. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass eine Inhibition der enzymatischen Funktion keinen Einfluss auf die Virulenz Regulation durch PqsE hat