Organisations et territoires

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Adaptation de l'Archaea halophile halobacterium salinarum aux stress environnementaux : mécanismes de survie et rôle de la protéolyse intracellulaire

Molecular systems described for Archaea show primitive and simple characteristics, compared to their homologous eukaryotes. In addition, extremophilic characteristic results in an hyper-robust which makes in vitro manipulation and structural studies much easier. Thus, Archaea represent good models for understanding complex cellular functions, particularly those that involve large molecular machines, such as those involved in proteolysis. My thesis consisted in understanding the resistance mechanisms and the importance of proteolytic systems in the adaptation of halophilic Archaea to environmental stresses. Halophilic Archaea accumulate multi-molar concentrations of KCl / NaCl in their cytosol (3.4M KCl / NaCl 1.1M for Halobacterium Salinarum). This requires a very special biochemistry that allows operation in solvents where free water is scarce. Thus, the proteins of these organisms are themselves halophilic and are soluble and folded only in extreme salinity conditions (2 to 5 M). This particular biochemistry partly explain the extraordinary ability of halophilic Archaea to resist physical and chemical stress (temperature, radiation, dehydration). We study the response of the halophilic Archaea strict H. salinarum at low-salinity stress. Indeed, beyond the osmotic shock, the fall of the environment salt concentration causes a decrease in the intracellular KCl concentration, which should have a direct effect on the folding state of intracellular protein, as in case of heat stress. In the first part of this thesis, a study was conduct to determine viability limits and cytosolic modifications, associated with a salinity decrease. These studies involve intracellular salt dosages, viability studies (microscopic counts, color live / dead), induction of chaperone proteins linked to stress response and biophysical neutron experiments, to evaluate the effect of stress on proteins folding. In this work, a phenomenon of survival at low salinity linked to morphological changes was revealed. To describe this phenomenon, this second study involves confocal microscopy experiences, fluorescence microscopy, viability tests, counting on box, scanning electron microscopy, electron microscopy by negative staining, salt intracellular dosages and proteins separation experiments, to study the overall proteome composition during low salinity stress. In this study, a fall of the intracellular K⁺ concentration and the proteome clarification during stress was revealed. Low salt concentrations causes halophiles proteins denaturation, the accumulation of misfolded proteins in the cytoplasm involves chaperones systems and intracellular proteolysis machinery. In this context, another objective of my thesis was to contribute to the understanding of the intracellular proteolysis role in the PAN-proteasome system and in the aminopeptidase TET complex, in stress conditions established in previous studies. This part of the thesis involves experiments of endopeptidase activity assay, aminopeptidase activity assay, quantification of mRNA genic expression by Northern blot, immunoprecipitation, proteins separation by sucrose gradient and proteasome chemical inhibition (drug). We show the role of the PAN-proteasome system in stress response and we deepen our understanding of the aminopeptidase TET role in vivo. This protease appears to have an independent role of the proteasome complex. The protease TET seems to participate at the amino acids treatment in cells to maintain the metabolic activities in nutritional deficiencies.Les systèmes moléculaires décrits chez les Archaea mettent en évidence un caractère primitif et une simplicité, comparativement à leurs homologues eucaryotes. Par ailleurs, leur caractère extrêmophile a pour conséquence une hyper-robustesse qui rend leur manipulation in vitro et les études structurales beaucoup plus aisées. Ainsi les Archaea représentent de bons modèles pour comprendre les fonctions cellulaires complexes, particulièrement celles qui mettent en jeu de grandes machineries moléculaires, comme celles impliquées dans la protéolyse. Mon travail de thèse a consisté à comprendre les mécanismes de résistance et l'importance des systèmes de protéolyse dans l'adaptation des Archaea halophiles aux stress environnementaux. Les Archaea halophiles accumulent des concentrations multi-molaires de KCl/NaCl dans leur cytosol (3.4M KCl / 1.1M NaCl chez Halobacterium salinarum). Ainsi, les protéines de ces organismes sont elles-mêmes halophiles et ne sont solubles et repliées que dans des conditions de salinité extrêmes (de 2 à 5M).Nous avons étudié la réponse de l'Archaea halophile stricte H. salinarum à des stress, dont les stress à basse salinité, en se focalisant en particulier sur les modifications de la dynamique moléculaire du protéome in vivo (diffusion neutronique). Au cours de ce travail, il a été mis en évidence un phénomène de survie à la basse salinité associé à des modifications morphologiques.Un autre objectif de ma thèse a été de contribuer à la compréhension du rôle dans la protéolyse intracellulaire du complexe aminopeptidasique TET, dans les conditions de stress mises en place dans les études précédentes

Adaptation de l'Archaea halophile halobacterium salinarum aux stress environnementaux : mécanismes de survie et rôle de la protéolyse intracellulaire

Molecular systems described for Archaea show primitive and simple characteristics, compared to their homologous eukaryotes. In addition, extremophilic characteristic results in an hyper-robust which makes in vitro manipulation and structural studies much easier. Thus, Archaea represent good models for understanding complex cellular functions, particularly those that involve large molecular machines, such as those involved in proteolysis. My thesis consisted in understanding the resistance mechanisms and the importance of proteolytic systems in the adaptation of halophilic Archaea to environmental stresses. Halophilic Archaea accumulate multi-molar concentrations of KCl / NaCl in their cytosol (3.4M KCl / NaCl 1.1M for Halobacterium Salinarum). This requires a very special biochemistry that allows operation in solvents where free water is scarce. Thus, the proteins of these organisms are themselves halophilic and are soluble and folded only in extreme salinity conditions (2 to 5 M). This particular biochemistry partly explain the extraordinary ability of halophilic Archaea to resist physical and chemical stress (temperature, radiation, dehydration). We study the response of the halophilic Archaea strict H. salinarum at low-salinity stress. Indeed, beyond the osmotic shock, the fall of the environment salt concentration causes a decrease in the intracellular KCl concentration, which should have a direct effect on the folding state of intracellular protein, as in case of heat stress. In the first part of this thesis, a study was conduct to determine viability limits and cytosolic modifications, associated with a salinity decrease. These studies involve intracellular salt dosages, viability studies (microscopic counts, color live / dead), induction of chaperone proteins linked to stress response and biophysical neutron experiments, to evaluate the effect of stress on proteins folding. In this work, a phenomenon of survival at low salinity linked to morphological changes was revealed. To describe this phenomenon, this second study involves confocal microscopy experiences, fluorescence microscopy, viability tests, counting on box, scanning electron microscopy, electron microscopy by negative staining, salt intracellular dosages and proteins separation experiments, to study the overall proteome composition during low salinity stress. In this study, a fall of the intracellular K⁺ concentration and the proteome clarification during stress was revealed. Low salt concentrations causes halophiles proteins denaturation, the accumulation of misfolded proteins in the cytoplasm involves chaperones systems and intracellular proteolysis machinery. In this context, another objective of my thesis was to contribute to the understanding of the intracellular proteolysis role in the PAN-proteasome system and in the aminopeptidase TET complex, in stress conditions established in previous studies. This part of the thesis involves experiments of endopeptidase activity assay, aminopeptidase activity assay, quantification of mRNA genic expression by Northern blot, immunoprecipitation, proteins separation by sucrose gradient and proteasome chemical inhibition (drug). We show the role of the PAN-proteasome system in stress response and we deepen our understanding of the aminopeptidase TET role in vivo. This protease appears to have an independent role of the proteasome complex. The protease TET seems to participate at the amino acids treatment in cells to maintain the metabolic activities in nutritional deficiencies.Les systèmes moléculaires décrits chez les Archaea mettent en évidence un caractère primitif et une simplicité, comparativement à leurs homologues eucaryotes. Par ailleurs, leur caractère extrêmophile a pour conséquence une hyper-robustesse qui rend leur manipulation in vitro et les études structurales beaucoup plus aisées. Ainsi les Archaea représentent de bons modèles pour comprendre les fonctions cellulaires complexes, particulièrement celles qui mettent en jeu de grandes machineries moléculaires, comme celles impliquées dans la protéolyse. Mon travail de thèse a consisté à comprendre les mécanismes de résistance et l'importance des systèmes de protéolyse dans l'adaptation des Archaea halophiles aux stress environnementaux. Les Archaea halophiles accumulent des concentrations multi-molaires de KCl/NaCl dans leur cytosol (3.4M KCl / 1.1M NaCl chez Halobacterium salinarum). Ainsi, les protéines de ces organismes sont elles-mêmes halophiles et ne sont solubles et repliées que dans des conditions de salinité extrêmes (de 2 à 5M).Nous avons étudié la réponse de l'Archaea halophile stricte H. salinarum à des stress, dont les stress à basse salinité, en se focalisant en particulier sur les modifications de la dynamique moléculaire du protéome in vivo (diffusion neutronique). Au cours de ce travail, il a été mis en évidence un phénomène de survie à la basse salinité associé à des modifications morphologiques.Un autre objectif de ma thèse a été de contribuer à la compréhension du rôle dans la protéolyse intracellulaire du complexe aminopeptidasique TET, dans les conditions de stress mises en place dans les études précédentes

Rôle du métabolisme énergétique dans un contexte de vieillissement chez C. elegans

L’incidence constante des maladies liées à l’âge reflète un réel enjeu dans nos sociétés actuelles, principalement lorsqu’il est question des cas de cancers, d’accidents cérébraux et de maladies neurodégénératives. Ces désordres sont liés à l’augmentation de l’espérance de vie et à un vieillissement de la population. Les coûts, estimés en milliards de dollars, représentent des sommes de plus en plus importantes. Bien que les efforts déployés soient importants, aucun traitement n’a encore été trouvé. Les maladies neurodégénératives, telles que la maladie d’Alzheimer, de Parkinson, d’Huntington ou la sclérose latérale amyotrophique (SLA), caractérisées par la dégénérescence d’un type neuronal spécifique à chaque pathologie, représentent un défi important. Les mécanismes de déclenchement de la pathologie sont encore nébuleux, de plus il est maintenant clair que certains de ces désordres impliquent de nombreux gènes impliqués dans diverses voies de signalisation induisant le dysfonctionnement de processus biologiques importants, tel que le métabolisme. Dans nos sociétés occidentales, une problématique, directement lié à notre style de vie s’ajoute. L’augmentation des quantités de sucre et de gras dans nos diètes a amené à un accroissement des cas de diabètes de type II, d’obésité et de maladies coronariennes. Néanmoins, le métabolisme du glucose, principale source énergétique du cerveau, est primordial à la survie de n’importe quel organisme. Lors de ces travaux, deux études effectuées à l’aide de l’organisme Caenorhabditis elegans ont porté sur un rôle protecteur du glucose dans un contexte de vieillissement pathologique et dans des conditions de stress cellulaire. Le vieillissement semble accéléré dans un environnement enrichi en glucose. Cependant, les sujets traités ont démontré une résistance importante à différents stress et aussi à la présence de protéines toxiques impliquées dans la SLA et la maladie de Huntington. Dans un deuxième temps, nous avons démontré que ces effets peuvent aussi être transmis à la génération suivante. Un environnement enrichi en glucose a pour bénéfice de permettre une meilleure résistance de la progéniture, sans pour autant transmettre les effets néfastes dû au vieillissement accéléré.The constant increase of the cases of age-related diseases, including cancers, cerebral accidents and neurodegenerative diseases raises a real problem in our current societies. These disorders are very strongly linked to the increase of life expectancy and to the ageing population. The costs, estimated in billion dollars, requiring vast medical resources and very few treatments exist today. Neuronal diseases, such as the Alzheimer's, Parkinson’s, Huntington’s disease and amyotrophic lateral sclerosis (ALS) are characterized by the degeneration of various types of neurons. This represents an important challenge because besides the lack of understanding the underlying mechanisms related to their pathology, it is now clear that some of these disorders involve several genes and lead to the dysfunction of fundmental biological processes such as metabolism. In western societies lifestyle and dietary practices may contribute to disease. The increased quantities of sugar and fat in western diets are thought to contribute to the rise of metabolic disorders, including Type II diabetes, obesity and coronary diseases. Nevertheless, it is important to understand that the metabolism of glucose, the brain’s main energy source, is essential for survival. In this thesis, two studies using the model organism Caenorhabditis elegans investigated a potential protective role of the glucose in a context of pathological ageing and in conditions of cellular stress. Although ageing seems accelerated in a glucose enriched environment, the test subjects demonstrated an improved resistance to numerous stresses including against toxic proteins involved in the ALS and Huntington's disease. Secondly, it appeared that these effects can be heritably transmitted to successive generations of animals. Thus, a glucose enriched environment allows for increased stress resistance in the offspring, without transmitting the negative effects of accelerated ageing

Évaluation de l'innocuité et de l'efficacité d'un dérivé synthétique marqué de l'adrénomédulline dans l'imagerie moléculaire pulmonaire chez l'humain

L’HTP est une maladie caractérisée par une élévation de la pression artérielle pulmonaire moyenne au-delà de 25 mmHg au repos. Dans le but de trouver un meilleur outil diagnostique pour cette affection, notre laboratoire a synthétisé puis expérimenté un radiotraceur nommé PulmoBind. Celui-ci s’avère être un dérivé synthétique de l’AM : un peptide vasodilatateur endogène de 52 acides aminés sécrété par de nombreux organes. Une fois couplé au 99mTechnétium, le PulmoBind permet par méthode scintigraphique la visualisation de la circulation pulmonaire métaboliquement active. Suite à notre étude de phase I, le PulmoBind s’est avéré sécuritaire et efficace. De plus, des analyses plus approfondies de la distribution spatiale ont démontré la capacité du PulmoBind à imager les divers gradients de la perfusion pulmonaire. À ce jour, aucun produit sur le marché n’emploie des données de captation et de distribution spatiale pour effectuer l’évaluation de la circulation respiratoire. Par conséquent, cette nouvelle méthodologie constitue une approche inédite et prometteuse pour le diagnostic de l’HTP et de son suivi.Background. The pulmonary circulation is submitted to large physiologic hemodynamic variations and possesses numerous important metabolic functions mediated through its vast endothelial surface. Unfortunately, no test is currently available that can directly evaluate endothelial integrity and pulmonary perfusion gradients at the same time. We developed PulmoBind, a chelated derivative of human adrenomedullin labeled with 99m-Tc for nuclear medicine SPECT imaging. By specifically binding to its endothelial receptors, abundantly expressed in human alveolar capillaries, PulmoBind can provide a non-invasive evaluation of pulmonary function that can help in the diagnosis of disorders affecting the pulmonary circulation. This thesis represents my doctoral work to determine the safety of PulmoBind in humans and its capacity to generate good quality imaging for diagnosis purposes. Methods. Twenty healthy participants were included into escalating doses groups of 5 mCi (n=5), 10 mCi (n=5) or 15 mCi (n=10) 99mTc-PulmoBind. Vital signs were closely monitored and safety biochemistry and hematology parameters obtained. SPECT imaging was serially performed and 99mTc-PulmoBind dosimetric and spatial distribution analysis accomplished. Imaging quality of the lungs was assessed serially. Results. Radiochemical purity of 99mTc-PulmoBind was greater than 95%. There were no safety concerns at the 3 dosages studied. Imaging revealed a predominant and prolonged lung uptake with mean peak pulmonary extraction of 58% ± 7% (mean ± SD) of the injected dose. PulmoBind was well tolerated and resulted in no clinically significant adverse events. The highest dose of 15 mCi provided a favorable dosimetric profile and excellent quality tomographic imaging of the lungs. The postural lung perfusion gradient was detectable. Indeed, dorsal activity was 18.1 ± 2.1% greater than ventral activity, and caudal activity was 25.7 ± 1.6% greater than cranial activity. The intensity of PB activity followed a normal distribution while macro aggregated albumin (MAA) activity was importantly skewed and bimodal. Conclusion. 99mTc-PulmoBind up to a dose of 15 mCi is safe and provides good quality lung perfusion imaging that can reveal the heterogeneity of the pulmonary perfusion. Therefore, the safety and efficacy of this agent could be tested in disorders of the pulmonary circulation such as pulmonary arterial hypertension

Etude des effets de deux types de nanoparticules métalliques sur des macrophages murins par une approche protéomique

Metallic nanoparticles (NPs) are more and more widely used, from industrial processes to biomedical research.However, data on their potential toxicity towards organisms are still lacking, especially regarding molecularmechanisms. It has been proven that some inorganic particles can lead to diseases when tissues are chronicallyexposed. In the case of pulmonary silicosis and asbestosis, induced by silica particles and asbestos fibers, chronicinflammation through alveolar macrophages is responsible for the disease. Indeed, macrophages are the firstdefense against exogenous attacks, like pathogens or inorganic compounds, which are eliminated throughphagocytosis and inflammatory processes that are part of the innate immune response. Thus, this study aimedat analyzing the molecular effects of both copper- and zinc-based NPs (Cu/CuO and ZnO) on murinemacrophages cell lines. To this end, a reproducible proteomic-based approach using 2D electrophoresis andmass spectrometry was used. The proteomic data were validated using targeted approaches on both cell linesand primary macrophages. Our results show that both NPs exert similar high cytotoxicity, but the molecularresponses are markedly different. Copper-based NPs strongly induce oxidative stress as well as alterations inmitochondrial metabolism, phagocytosis, and inflammatory mediators’ production. These effects seem to bemostly related to the redox properties of copper, and are specific to the NP form. Conversely, zinc inducedlimited effects on the same processes, thus leading to no significant alterations in macrophages’ immunefunctions. These effects are not NP-specific, since Zn2+ ions seem to exert most of them, probably due to theirability to interact with numbers of proteins, slightly altering their normal functions, and eventually leading onlyto cell death without prior functional alterations. This study allowed us to highlight some molecular mechanismsof both NP’s toxicity.Les nanoparticules (NP) métalliques occupent une place de plus en plus importante, tant dans les procédésindustriels que dans la recherche biomédicale. Néanmoins, les données sur leur toxicité potentielle pour lesorganismes vivants restent insuffisantes, notamment à l’échelle moléculaire. Des exemples historiques montrentque certaines pathologies, comme la silicose et l’asbestose, peuvent être engendrées par l’exposition chroniqueà des particules inorganiques (silice et fibres d’amiante). Dans les deux cas, la réponse des macrophagesalvéolaires est en grande partie responsable de la maladie. Les macrophages sont en effet la première ligne dedéfense (immunité innée) contre toute attaque exogène, pathogène ou non, du fait de leurs fortes capacitésphagocytaires et de leurs propriétés inflammatoires. Ainsi, les objectifs de ces travaux étaient d’étudier les effetsde deux types de NP métalliques (Cu/CuO et ZnO) sur deux lignées cellulaires de macrophages murins. Cetteétude a été réalisée par une approche protéomique basée sur l’électrophorèse 2D et la spectrométrie de masse,permettant d’accéder de façon reproductible à des données mécanistiques. Les données obtenues ont étévalidées par plusieurs approches ciblées de biologie cellulaire, sur les lignées ainsi que sur des macrophagesprimaires. Nos résultats montrent que les deux types de NP engendrent des réponses différentes, bien que leurdegré élevé de cytotoxicité soit similaire. Les NP de cuivre induisent un stress oxydant et une réponsemitochondriale intenses, associées à de fortes perturbations de la phagocytose et de la production de certainsmédiateurs de l’inflammation. Cette toxicité semble être essentiellement liée aux propriétés redox du cuivre, etest spécifique de la forme nanoparticulaire. A l’inverse, le zinc induit des réponses modérées sur les mêmesprocessus, n’affectant pas a priori le rôle immunitaire des macrophages. Cette toxicité n’est pas non plusspécifique des NP, les ions ayant des effets très étendus, liés à leurs interactions avec de nombreuses protéines,perturbant leur fonctionnement normal jusqu’à induire la mort cellulaire. L’ensemble de ces résultatspermettent une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires expliquant la toxicité de ces NP

Les emprunts à l'anglais médical dans la langue française contemporaine

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal