Proteomic analysis of the heat shock and acclimation responses of Cyanobacteria

The cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 is a model experimental organism for proteomic research because its entire genomic sequence is available and cyanobacteria have high adaptive potential towards a variety of environmental stresses. Heat shock characteristically induces expression of the heat shock proteins (Hsps) and photosynthetic organisms have demonstrated the ability to acclimatise their photosynthetic apparatus to milder elevated temperatures. In this study the proteomic methodology of two dimension gel electrophoresis and peptide mass fingerprinting mass spectrometry (PMF MS) was developed for the analysis of Synechocystis proteins. High resolution was attained with the application of narrow acidic pH range 'zoom' gels and of 192 individual soluble protein spots analysed via MALDI ToF, 105 were identified. A 2-D difference gel electrophoresis (2D DIGE) based proteomic approach has been applied to characterise the heat shock response in the soluble protein fraction and determine protein factors involved in the thermal acclimation of the thylakoid membrane and its associated photosynthetic machinery in Synechocystis. These analyses together with PMF MS for protein identification characterised 176 and 108 heat shock and heat acclimation responsive protein spots, respectively. In both analyses, molecular chaperones displayed the highest heat elevated level, demonstrating a dual role in stabilisation and refolding of both soluble and membrane-bound proteins. Other proteins identified in the heat shock response included those involved in photosynthesis, carbon fixation, translation, amino acid biosynthesis and several hypothetical proteins. Proteins involved in heat acclimation of the thylakoid membrane included constituents of photosynthesis, respiration, hopene biosynthesis and several hypothetical proteins. Furthermore, a candidate heat sensor involved in the regulation of heat shock gene expression has been characterised through analysis of the heat shock response in a histidine kinase knock out mutant strain of Synechocystis, namely Мік34, which displays increased thermal tolerance. The gene product of hik34 has a possible dual role in both the suppression of hsp gene expression under normal growth temperature and enhancement under heat shock

Gel electrophoresis for elemental speciation purposes

This work has shown that gel electrophoresis is a relevant fractionation method for trace elements bound to or complexed by macromolecules. Furthermore, detection methods of the trace elements that do not rely on the use of radiotracers were applied, making this combination relevant for materials of human origin, where the use of radioactive material is restricted for reasons of safety

Sequencing as a way of work : a history of its emergence and mechanisation - from proteins to DNA, 1945-2000

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Biochemische und funktionelle Charakterisierung zellfrei exprimierter G-Protein-gekoppelter Rezeptoren des humanen Endothelin-Systems

G-protein coupled receptors (GPCRs) are the key players in signal perception and transduction and one of the currently most important class of drug targets. An example of high pharmacological relevance is the human endothelin (ET) system comprising two rhodopsin-like GPCRs, the endothelin A (ETA) and the endothelin B (ETB) receptor. Both receptors are major modulators in cardiovascular regulation and show striking diversities in biological responses affecting vasoconstriction and blood pressure regulation as well as many other physiological processes. Numerous disorders are associated with ET dysfunction and ET antagonism is considered an efficient treatment of diseases like heart failure, hypertension, diabetes, artherosclerosis and even cancer. This study exemplifies strategies and approaches for the preparative scale synthesis of GPCRs in individual cell-free (CF) systems based on E. coli, a newly emerging and promising technique for the production of even very difficult membrane proteins. The preparation of high quality samples in sufficient amounts is still a major bottleneck for the structural determination of the ET receptors. Heterologous overexpression has been a challenge now for decades but extensive studies with conventional cell-based systems had only limited success. A central milestone of this study was the development of efficient preparative scale expression protocols of the ETA receptor in qualities sufficient for structural analysis by using individual CF systems. Newly designed optimization strategies, the implementation of a variety of CF expression modes and the development of specific quality control assays finally resulted in the production of several milligrams of ETA receptor per one millilitre of reaction mixture. The versatility of CF expression was extensively used to modulate GPCR sample quality by modification of the solubilization environment with detergents and lipids in a variety of combinations at different stages of the production process. Downstream processing procedures of CF synthesized GPCRs were systematically optimized and sample properties were analysed with respect to homogeneity, protein stability and receptor ligand binding competence. Evaluation was accomplished by an array of complementary and specifically modified techniques. Depending on its hydrophobic environment, CF production of the ETA receptor resulted in non-aggregated, monodisperse forms with sufficient long-term stability and high degrees of secondary structure thermostability. The obtained results document the CF production of the ETA receptor in two different modes as an example of a class A GPCR in ligand-binding competent and non-aggregated form in quantities sufficient for structural approaches. The presented strategy could serve as basic guideline for the production of related receptors in similar systems.G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCRs), bilden mit etwa 3 % die größte Klasse an Zelloberflächenrezeptoren im menschlichen Proteom. Aufgrund ihrer bedeutenden Funktion bei der Verarbeitung vielfältiger Umweltsignale und bei der Steuerung physiologischer Abläufe im menschlichen Organismus gehören GPCRs mit rund 50 % zu den wichtigsten Angriffspunkten heutiger Arzneimittel. Ein Beispiel mit hoher pharmakologischer Relevanz ist das humane Endothelin- (ET) System, das aus zwei Rhodopsin-ähnlichen GPCRs, dem Endothelin A (ETA) und dem Endothelin B Rezeptor (ETB) besteht. Beide Rezeptoren gehören zu den wichtigsten Modulatoren des kardiovaskulären Systems. Es beeinflusst Gefäßverengung und Blutdruckregulation und spielt zudem eine essentielle Rolle bei Zellproliferation und Mitogenese. Viele bekannte Zivilisationskrankheiten sind mit endothelialer Fehlfunktion assoziiert. ET-Rezeptor-Antagonismus wird daher als potente Methode zur Behandlung von Herzinsuffizienz, Bluthochdruck, Diabetes, Atherosklerose und sogar von Krebs aufgefasst. Die Produktion von Proteinproben hoher Qualität in ausreichenden Mengen ist eine unabdingbare Voraussetzung zur strukturellen Aufklärung von GPCRs. Die heterologe Überexpression zur Herstellung der ET-Rezeptoren in konventionellen zell basierenden Systemen hatte allerdings bisher nur eingeschränkten Erfolg. Diese Arbeit konzentrierte sich daher auf die Anwendung alternativer Technologien, die auf selbst hergestellten zellfreien Expressionssystemen als hochkompetitive Option zur Produktion selbst schwieriger Membranproteine basieren. Das Hauptziel der vorliegenden Dissertation bestand in der Prozessentwicklung zur Etablierung individueller und effizienter zellfreier Syntheseprotokolle zur präparativen Produktion von GPCRs am Beispiel des humanen ET-Rezeptoms. Der Schwerpunkt wurde auf die zellfreie Produktion und Qualitätskontrolle des ETA Rezeptors gelegt, da hierzu noch keinerlei primäre Erkenntnisse vorlagen. Die erstellten Produktionsprozesse sowie die weitere Aufarbeitung des Rezeptors wurden systematisch im Detail optimiert. Ein wichtiger und neuartiger Ansatz war in diesem Hinblick die gezielte Modifikation der direkten Translationsumgebung des ETA Rezeptors, eine Möglichkeit die durch den charakteristischen Aufbau der zellfreien Reaktion geboten wird und bisher einzigartig für diese Technologie ist. Die Qualität der produzierten Proteine wurde nach schrittweisen Reaktionsmodifikationen und in Abhängigkeit der eingesetzten Expressionsmodi sowie von zugesetzten hydrophoben Additiven im Hinblick auf eine Reihe komplementärer Kriterien wie Homogenität, Stabilität und Ligandenbindungs-Kompetenz analysiert. Die spezifisch erarbeiteten Optimierungs¬strategien im Verbund mit den individuell auf das Protein abgestimmten und neu etablierten Methoden zur Qualitätskontrolle ermöglichten die Produktion des ETA Rezeptors in routinemäßigen Mengen von etwa 2 Milligramm pro Millilitern Reaktionsansatz. Grundlegende Prozessparameter ergaben sich durch Qualitätsanalysen von ETA Proben nach deren Synthese in verschiedenen zellfreien Expressionsmodi. Die Qualität des Rezeptors war nach Produktion im Präzipitat erzeugenden P CF Modus mit anschließender post-translationeller Solubilisierung deutlich besser im Vergleich zur Synthese mit direkter ko-translationeller Solubilisierung im D CF Modus nach Zugabe von Detergenzien in den Reaktionsansatz. Dieses zunächst überraschende Ergebnis wurde durch Gelfiltrations¬experimente bestätigt. In Übereinstimmung offenbarten Festkörper-Kernmagnetische Resonanz Analysen zudem alpha-helikale Sekundärstrukturelemente in den P-CF generierten ETA Präzipitaten. Als weiteres effektives Mittel zur Modulation der mizellaren Umgebung von P CF synthetisiertem ETA wurde der Detergenzaustausch nach Immobilisierung durch Metallchelat-Affinitätschromatographie verwendet. Als äußerst geeignet wurde Brij 35 identifiziert. ETA zeigte hier in analytischer Größenausschlusschromatographie schlanke Elutionsprofile, in deren Fraktionen das Protein einen hohen Grad an Homogenität im Verbund mit Stabilität aufwies. Negativfärbung belegte die Monodispersität der Proben, die sich außerdem durch eine hohe thermische Sekundärstrukturstabilität auszeichneten. Analysen durch native und denaturierende Gelelektrophorese deuteten auf die potentielle Bildung SDS-resistenter Dimere/Oligomere des ETA Rezeptors hin. Diese Annahme wurde durch Massenspektrometrie unterstützt. Vielwinkel-Lichtstreuung zeigte außerdem, dass Gleichgewichte zwischen monomerem und dimerem ETA Rezeptor offenbar durch das umgebende Mizellenmillieu gesteuert werden können. Zudem wurden erste Hinweise auf das Oligomerisierungs-Potential von zellfrei exprimiertem ETA und ETB durch Ko-Expression und anschließenden Komplexanalysen unter Einbezug hergestellter, fragmentierter Derivate erlangt. Die Ligandenbindungs-Kompetenz des solubilisierten Rezeptors wurde durch Affinitätschromatographie und Fluoreszenz-Anisotropie untersucht. Dieser Ansatz führte zu einem effizienten Protokoll für die Reinigung Liganden-gebundener Rezeptorfraktionen für z.B. Kristallisationsanalysen. Nach Synthese in den identifizierten optimalen Bedingungen im P-CF Modus und Detergenzaustausch in Brij 35 wurden Bindungseffizienzen von bis zu 50 % erzielt, die unter optimalen Bedingungen eine Ausbeute an funktionellem Rezeptor von 0.5 mg/mL zellfreiem Reaktionsansatz ergeben. Übereinstimmende Nachweise der funktionellen Faltung des synthetisierten ETA Rezeptors in Abhängigkeit der Expressionsbedingungen wurden erhalten durch Fluoreszenz-Anisotropie, elektronenmikroskopische Gefrierbruchanalysen von rekonstituierten Proben sowie durch Radioliganden-Experimente zur Bestimmung der Gleichgewichtsdissoziations-konstanten (KD) und der inhibitorischen Konzentrationen (IC50) des natürlichen Liganden Endothelin 1. Die Arbeit bietet eine grundlegende Richtlinie zur Qualitätsoptimierung zellfrei synthetisierter Membranproteine und sie stellt zudem ein Orientierungshilfe zur Prozessentwicklung individueller Expressionsprotokolle dar. Die präparative Produktion hochwertiger Proben an ETA Rezeptor resultierte in der Durchführung umfassender Kristallisationsanalysen als Basis für nachfolgende Arbeiten zur Strukturbestimmung