Adaptation and convergence in circadian‐related genes in Iberian freshwater fish

The circadian clock is a biological timing system that improves the ability of organisms to deal with environmental fluctuations. At the molecular level it consists of a network of transcription-translation feedback loops, involving genes that activate (bmal and clock - positive loop) and repress expression (cryptochrome (cry) and period (per) - negative loop). This is regulated by daily alternations of light but can also be affected by temperature. Fish, as ectothermic, depend on the environmental temperature and thus are good models to study its integration within the circadian system. Here, we studied the molecular evolution of circadian genes in four Squalius freshwater fish species, distributed across Western Iberian rivers affected by two climatic types with different environmental conditions (e.g., light and temperature). S. carolitertii and S. pyrenaicus inhabit the colder northern region under Atlantic climate type, while S. torgalensis, S. aradensis and some populations of S. pyrenaicus inhabit the warmer southern region affected by summer droughts, under Mediterranean climate type.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

An evolutionary perspective on the circadian system in western iberian Squalius freshwater species

Tese de mestrado em Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, em 2018O ritmo circadiano constitui um importante sistema biológico que permite a sincronização de diversas funções biológicas dos organismos de acordo com as flutuações diárias de luz. Sendo assim, atua como um relógio endógeno por um período de ~24h, sendo regulado a nível molecular por redes de retroação compostas por elementos positivos e negativos que, respetivamente, ativam ou reprimem a expressão de genes alvo. Estas redes são mantidas por quatro famílias de genes (CRY, PER, CLOCK e BMAL). As proteínas CLOCK e BMAL atuam como um heterodímero (CLOCK:BMAL), ligando-se às E-boxes no ADN de forma a ativar a expressão dos genes alvo, incluindo os elementos negativos do ciclo, os genes cry e per. Após a tradução dos genes referidos, as proteínas CRY e PER formam também um heterodímero (CRY:PER), que interage com o heterodímero CLOCK:BMAL, levando à repressão da expressão génica, incluindo os próprios cry e per. O ciclo repete-se quando os níveis de CRY:PER são baixos o suficiente para o CLOCK:BMAL poder novamente ligar-se ao ADN e estimular a expressão génica. Adicionalmente, o gene timeless, que codifica para a proteína TIMELESS, mostrou ser uma parte central do ritmo circadiano em Drosophila, mas as suas funções nos vertebrados permanecem ainda pouco estudadas, tendo sido proposto que a proteína TIMELESS possa desempenhar um papel secundário no ritmo circadiano, ao servir de alternativa às proteínas PER. As consequências das interações moleculares que ocorrem no ritmo circadiano manifestam-se, entre outras, na otimização do metabolismo, regulação da expressão génica, e resposta a alterações ecológicas e ambientais. Todo o sistema do ritmo circadiano encontra-se, ele próprio, sincronizado pelas flutuações diárias de luz. Contudo, foi também proposto que a temperatura ambiental apresenta um papel fulcral na sincronização e manutenção do ritmo circadiano. As famílias de genes envolvidas no ritmo circadiano têm vindo a ser extensivamente caracterizadas, em particular nos peixes, organismos que possuem um acrescido número de parálogos face a outros vertebrados. Para além disto, os peixes possuem diversas adaptações a nível do ritmo circadiano e temperatura, pois sendo ectotérmicos, apresentam uma maior dependência face à temperatura ambiental para desempenhar as suas funções fisiológicas. O género Squalius encontra-se representado nos rios Portugueses por quatro espécies (S. carolitertii, S. pyrenaicus, S. torgalensis e S. aradensis), distribuídas ao longo de um gradiente latitudinal de luz e temperatura. S. carolitertii é a espécie que habita os rios da região a norte do Tejo (ex: Mondego), S. pyrenaicus apresenta uma distribuição mais alargada, habitando as bacias do centro e sul (ex: Tejo e Almargem), enquanto as espécies S. torgalensis e S. aradensis, se encontram confinadas a pequenas bacias no sudoeste de Portugal (ex. Mira e Arade). A esta distribuição encontra-se subjacente uma variação ambiental latitudinal, uma vez que as bacias das regiões norte e centro estão sob influência Atlântica, apresentando temperaturas mais baixas, enquanto as bacias da região sul se encontram sob influência Mediterrânea, apresentando, de um modo geral, temperaturas mais altas e onde ocorrem períodos de seca durante o Verão. Existe também uma variação na duração e intensidade da luminosidade ao longo deste gradiente latitudinal. Atendendo ao mencionado, estas espécies apresentam-se como um modelo de particular interesse no estudo da evolução adaptativa, nomeadamente ao nível do ritmo circadiano e sua relação com a temperatura. No presente estudo, foram identificados os genes envolvidos no ritmo circadiano dos peixes dulciaquícolas do género Squalius com base numa análise dos transcriptomas de S. carolitertii e S. torgalensis recentemente publicados, e sua comparação com resultados de outros transcriptomas de Danio rerio (aqui usado como organismo de referência), obtidos após a exposição a estímulos luminosos. Identificaram-se quinze genes pertencentes às quatro grandes famílias já descritas: seis genes da família CRY (cry1aa, cry1ab, cry1ba, cry1bb, cry2 e cry3); quatro genes da família PER (per1a, per1b, per2 e per3); dois genes da família CLOCK (clocka e clockb); e três genes da família BMAL (bmal1a, bmal1b e bmal2). Adicionalmente, foi identificado o gene timeless. Com exceção da família CLOCK, na qual não foi possível identificar o gene clock2, a constituição de todas as famílias encontra-se de acordo com o descrito para outros peixes, nomeadamente D. rerio. Os genes referidos foram sequenciados para todas as espécies em estudo, através de ADN complementar, tendo sido as sequências destes posteriormente utilizadas para prever as sequências das proteínas para as quais codificam. Através das sequências das proteínas foi possível caracterizar os padrões de interação proteína-proteína, que revelaram que estas proteínas retêm as suas funções ancestrais como reguladores circadianos, exibindo no entanto, sinais de diversificação pós-duplicação que se observam através de interação das proteínas CRY e PER com outras proteínas cuja função se encontra mais relacionada com a resposta à temperatura. Isto, não só mostra a sua diversificação como também reforça a relação entre o ritmo circadiano e a temperatura na otimização das oscilações circadianas. Para a proteína TIMELESS, esta análise permitiu clarificar a sua função nas espécies estudadas, já que, apesar da proteína manter a capacidade de interagir com as proteínas CRY e, assim, manter uma potencial função como regulador circadiano, a maior parte das suas interações dão-se com proteínas relacionadas com a regulação do ciclo celular. A análise filogenética de cada família de genes, conseguida a partir das sequências das proteínas previstas, permitiu mostrar as relações evolutivas das duplicações nestas espécies do género Squalius, confirmando que a história evolutiva dos genes destas famílias é idêntica ao já descrito para outras espécies de peixes. Adicionalmente, integrando testes estatísticos para determinar as assinaturas de seleção a nível molecular (dN/dS) com a caracterização estrutural e funcional das proteínas, foi possível também estudar a adaptação destas espécies às diferentes condições de luz e temperatura a que estão sujeitas. Para as proteínas CRY1BA, PER1A, PER2, BMAL2 e TIMELESS, o padrão encontrado parece refletir a história evolutiva das espécies do género Squalius encontrada nas filogenias de outros genes nucleares. Foi também encontrada, para outras proteínas, uma diferenciação Norte-Sul consistente a variação de luz e temperatura a que espécies estão sujeitas nos seus habitats. Para além disso, verificou-se que em S. torgalensis, para as proteínas CRY1AA e PER1A, os sinais desta adaptação local são notórios nos resultados dos testes de seleção, que mostram que, para estas proteínas, S. torgalensis apresenta um forte sinal de seleção positiva. Além disso, a caracterização das proteínas, nomeadamente através dos parâmetros físico-químicos e padrões de modificações pós-tradução, mostra que esta espécie se encontra particularmente diferenciada face às restantes. As evidências de adaptação local podem ser explicadas pelas condições particulares de luz e temperatura no rio Mira, nomeadamente, o maior ensombramento causado pela vegetação ripária e a temperatura média da água elevada, mas mais estável do que nos restantes rios do sul. Encontrou-se, também, uma convergência entre as populações de S. aradensis e S. pyrenaicus de Almargem, nas proteínas CRY1BB, CRY3, PER3, CLOCKA, CLOCKB, BMAL1A e BMAL1B. As assinaturas de seleção permitiram suportar esta convergência no gene clocka, mas, nos restantes genes, esta convergência tornou-se evidente apenas após a caracterização das proteínas, uma vez que, nas referidas espécies, estas proteínas apresentam características semelhantes, nomeadamente a nível dos parâmetros físico-químicos e modificações pós-tradução. Estas características das referidas proteínas, refletem-se em valores de maior termoestabilidade nestas espécies, muito provavelmente relacionadas com o facto destas espécies habitarem rios com valores muito próximos de luz e temperatura. No geral, os resultados obtidos para a termoestabilidade da maior parte das proteínas estudadas, sugerem que a temperatura é um fator seletivo que se relaciona com a evolução destas proteínas nas espécies do género Squalius estudadas. Deste modo, também poderemos dizer que estas espécies constituem um bom modelo para a continuação destes estudos, nomeadamente ao explorar a relação entre o ritmo circadiano e a temperatura de forma mais detalhada. Por fim, foi possível mostrar que a abordagem inovadora de integração dos resultados dos testes de seleção baseados no rácio dN/dS com a caracterização de proteínas agora apresentada, permite detetar sinais de seleção, cuja estatística associada a estes testes não permite, só por si, detetar.The circadian system is a biological timing system that improves the inherent ability of organisms to deal with environmental instabilities, creating oscillations that are highly synchronised with daily fluctuations of light in several biochemical processes. Temperature has been pointed as an integrant agent in several aspects of the circadian system. Fish, as ectothermic organisms, have an increased dependence on the environmental temperature to maintain and optimize the circadian system. Here we study the freshwater fish Squalius genus, which is represented in Portugal by four species distributed across a latitudinal gradient with variable environmental conditions of light and temperature. Squalius carolitertii inhabits the Atlantic-type northern basins, while the sister species S. torgalensis and S. aradensis inhabit the Mediterranean-type southern basins. Additionally, S. pyrenaicus has a broader distribution, inhabiting both Atlantic-type northern basins (e.g. Tagus) and Mediterranean-type southern basins (e.g. Almargem). This distribution gives the opportunity to study species adaptation to different environmental backgrounds. Analysis of S. torgalensis and S. carolitertii transcriptomes and comparison with light-induced zebrafish transcriptomes revealed four main gene families involved (Cryptochromes, Period, CLOCK and BMAL) in the circadian system, and one single-copy gene (timeless) whose function was possibly related to the circadian system. The cDNA of these identified genes was re-sequenced in S. torgalensis and S. carolitertii and sequenced de novo for S. pyrenaicus and S. aradensis. Characterisation of protein-protein interactions revealed that the studied proteins retain functions in the circadian system common to other vertebrates, but also display signals of diversification. Protein-protein interactions for TIMELESS revealed this protein presents a differentiation in its function towards the cell cycle regulation but retains the ability to act as a circadian regulator. Results of phylogenetic analysis of each family, based on predicted protein sequences for Squalius species, were, for some proteins (CRY1BA, PER1A, PER2, BMAL2 and TIMELESS), congruent with the phylogenies of other nuclear genes from these species. Moreover, by using an integrative approach involving tests to detect signatures of selection and a structural and functional protein analysis, it was possible to infer N-S patterns consistent with adaptation in these species, probably related with the different environmental conditions they experience. Additionally, S. torgalensis seems to present a pattern of local adaptation in two proteins (CRY1AA and PER1A) that could be explained by the specific environmental conditions experienced in Mira basin. Lastly, a well-supported convergence for some proteins (CRY1BB, CRY3, PER3, CLOCKA, CLOCKB, BMAL1A and BMAL1B) was found in southern populations of S. aradensis and S. pyrenaicus from Almargem. Signatures of selection supported this convergence in clocka, but for other genes, convergence was only exposed after protein characterisation. Convergence was evident because these proteins display similar features, specifically in physicochemical parameters and post-translational modifications patterns, congruent with the more similar environmental conditions they experience. Also, our results support that the evolution of circadian-related proteins in these species has been strongly driven by temperature, as thermostability was found to be the protein feature presenting most modifications in all protein