Morphometric Analysis to Characterize the Differentiation of Mesenchymal Stem Cells into Smooth Muscle Cells in Response to Biochemical and Mechanical Stimulation

The morphology and biochemical phenotype of cells are closely linked. This relationship is important in progenitor cell bioengineering, which generates functional, tissue-specific cells from uncommitted precursors. Advances in biofabrication have demonstrated that cell shape can regulate cell behavior and alter phenotype-specific functions. Establishing accessible and rigorous techniques for quantifying cell shape will therefore facilitate assessment of cellular responses to environmental stimuli, and will enable more comprehensive understanding of developmental, pathological, and regenerative processes. For progenitor cells being induced into specific lineages, this ability becomes a pertinent means for validating their degree of differentiation and may lead to novel strategies for controlling cell phenotype. In our approach, we used the differentiation of adult human mesenchymal stem cells (MSCs) into smooth muscle cells (SMCs) as a model system to investigate the relationship between cell shape and phenotype. These cell types are responsive to mechanical and biochemical stimuli and the shape of SMCs is a recognized marker of differentiated state, providing a system in which morphological and biochemical phenotype are both understood and inducible. By applying exogenous stimuli, we changed cell shape and examined the corresponding cellular phenotype. In the first Aim, we applied stretch to MSCs on 2D collagen sheets to promote differentiation. Using mathematical shape factors, we quantified the morphological changes in response to defined stretch parameters. In the second Aim, we investigated the use of input energy as a means of controlling cell shape and corresponding differentiation. We examined how combinations of stretch parameters that produce equal energy input impacted morphology, and postulated that cell shape is a function of energy input. In the third Aim, we translated our method of quantifying shape factors into 3D culture, and validated the method by investigating the differentiation of MSCs into SMCs by mechanical and growth factor stimulation. We used the shape factors to quantify morphological differences and compared these changes to biochemical markers. Our results demonstrate that mechanical stretch influences multiple aspects of MSC phenotype, including cell morphology. Shape factors described these changes objectively and quantitatively, and enabled the identification of relationships between SMC shape and differentiated state. Similar morphological responses could be induced using different combinations of stretch parameters that resulted in equal energy input. Cell shape followed a linear relationship with energy input despite the variance introduced by using MSCs from different patients. Only one SMC gene marker directly exhibited this relationship; however, partial least squares regression analysis revealed that other genes were also associated with shape factors. Translation of the shape quantification method into 3D systems revealed that while the additional dimensionality hindered comparison of morphology between 2D and 3D samples, these shape factors were still applicable within 3D systems. Differences in cell morphology caused by growth factors and mechanical stretch in 3D constructs were elucidated by shape analysis, and these phenotypic changes were corroborated through biochemical assays. Taken together, these results validate the use of cell shape as means of characterizing phenotype and the process of progenitor cell differentiation. The automated method we developed generates a robust set of morphological parameters that provide a way to characterize the differentiation of MSCs into SMCs. This work has implications in our understanding of the relationship between cell morphology and phenotype, and may lead to new ways to control and improve differentiation efficiency in a variety of cell and tissue systems.PHDBiomedical EngineeringUniversity of Michigan, Horace H. Rackham School of Graduate Studieshttps://deepblue.lib.umich.edu/bitstream/2027.42/145833/1/brandanw_1.pd

Advances in the Development of Shape Similarity Methods and Their Application in Drug Discovery

Molecular similarity is a key concept in drug discovery. It is based on the assumption that structurally similar molecules frequently have similar properties. Assessment of similarity between small molecules has been highly effective in the discovery and development of various drugs. Especially, two-dimensional (2D) similarity approaches have been quite popular due to their simplicity, accuracy and efficiency. Recently, the focus has been shifted toward the development of methods involving the representation and comparison of three-dimensional (3D) conformation of small molecules. Among the 3D similarity methods, evaluation of shape similarity is now gaining attention for its application not only in virtual screening but also in molecular target prediction, drug repurposing and scaffold hopping. A wide range of methods have been developed to describe molecular shape and to determine the shape similarity between small molecules. The most widely used methods include atom distance-based methods, surface-based approaches such as spherical harmonics and 3D Zernike descriptors, atom-centered Gaussian overlay based representations. Several of these methods demonstrated excellent virtual screening performance not only retrospectively but also prospectively. In addition to methods assessing the similarity between small molecules, shape similarity approaches have been developed to compare shapes of protein structures and binding pockets. Additionally, shape comparisons between atomic models and 3D density maps allowed the fitting of atomic models into cryo-electron microscopy maps. This review aims to summarize the methodological advances in shape similarity assessment highlighting advantages, disadvantages and their application in drug discovery

Knowledge discovery of cell-cell and cell-surface interactions

High-throughput cell culture is an emerging technology that shows promise as a tool for research in tissue engineering, drug discovery, and medical diagnostics. An important, but overlooked, challenge is the integration of experimental methods with information processing suitable for handling large databases of cell-cell and cell-substrate interactions. In this work the traditional global descriptions of cell behaviors and surface characteristics was shown insufficient for investigating short-distance cell-to-cell and cell-to-surface interactions. This problem was addressed by introducing individual-cell based local metrics that emphasize cell local environment. An individual-cell based local data analysis method was established. Contact inhibition of cell proliferation was used as a benchmark for the effectiveness of the local metrics and the method. Where global, summary metrics were unsuccessful, the local metrics successfully and quantitatively distinguished the contact inhibition effects of MC3T3-E1 cells on PLGA, PCL, and TCPS surfaces. In order to test the new metrics and analysis method, a model of cell contact inhibition was proposed. Monte Carlo simulation was performed for validating the individual-cell based local data analysis method as well as the cell model itself. The simulation results well matched with the experimental observations. The parameters used in the cell model provided new descriptions of both cell behaviors and surface characteristics. Based on the viewpoint of individual cells, the local metrics and local data analysis method were extended to the investigation of cell-surface interactions, and a new high-throughput screening and knowledge discovery method on combinatorial libraries, local cell-feature analysis, was developed. PLGA/PCL combinatorial libraries were used as a prototype and a shaper and holder phenomenon involving MC3T3-E1 cells interacting with PCL islands was discovered. In summary, the viewpoint of individual cells casts new light on the study of cell-cell and cell-surface interactions and represents a novel methodology for developing new data analysis and knowledge discovery methods. The results of contact inhibition study and the shaper and holder model provide new knowledge, while the local data analysis method as well as the cell model of contact inhibition suggested novel approaches to study cell-cell and cell-surface interactions.Ph.D.Committee Chair: Meredith, Carson; Committee Co-Chair: Galis, Zorina; Committee Co-Chair: McIntire, Larry; Committee Member: García, Andrés; Committee Member: Prausnitz, Mar

Studying the folding of peptide dendrimers using molecular simulation methods

Tese de mestrado, Bioquímica, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2009Dendrimers are a family of branched compounds that share a common layout where wedges emerge radially from a core by means of a regular branching pattern. Peptide dendrimers are a specific kind of dendrimers formed by alternating functional amino acids with branching diamino acids. There has been increasing interest in the synthesis of peptide-based dendritic architectures modelling specific aspects of biological function. Some results are already available, demonstrating these molecules ability to act as enzyme models and to mimic natural ligands. Unfortunately, most studies concerning peptide dendrimers lack structural information at the molecular level. The theoretical study published so far, reported peptide dendrimers presenting shapes close to spheres, though experimental studies on the same systems suggest the existence of more disordered states. Herein, we characterize five third-generation peptide dendrimers (B1, B1H, B1HH, B1HHH and C1) through multiple long molecular dynamics simulations (MD), and analyse their conformational details and folding preferences in solution. Special emphasis is placed on the analysis of conformational trends representative of the examined models. The conformational sampling results, obtained through MM/MD simulations, were scrutinized using several approaches. Namely, histogram analysis, phi-psi dihedral distributions, inter-residue distance matrices, shape analysis and principal coordinate analysis. The adequacy of each approach to discern the conformation space of peptide dendrimers is discussed. Using these analysis procedures we were able to observe two distinct types of behaviour (sphere-like and bowl-like structures), both asserting the enormous structural flexibility characterizing these molecules; and the myriad of conformational states available to them. Our conclusions can be interpreted together with the available experimental results, contributing to a synergistic understanding of the structure-function relation in peptide dendrimers, and casting the bases for novel knowledge-based applications.Os dendrímeros são uma família de compostos ramificados que partilham uma arquitectura comum, onde diferentes cadeias emergem radialmente de um mesmo núcleo (ou centro) através de um padrão de ramificação regular. Os dendrímeros peptídicos, são uma classe particular de dendrímeros, constituída por estruturas que incorporam de forma alternada e iterativa resíduos de amino-ácidos funcionais (resíduos de espaçamento) com resíduos de diamino-ácidos ramificados (resíduos de ramificação). Os resíduos de diamino-ácidos ramificados promovem a bifurcação das cadeias peptídicas e a aquisição da estrutura dendrítica. A possibilidade de sintetizar dendrímeros com composições que mimetizem as funções de moléculas biológicas, constitui o aliciante para a investigação neste campo cientifico. Em particular, a síntese planeada e controlada de estruturas dendríticas baseadas nos componentes apresentados pelas moléculas biológicas, como peptidos ou glícidos, constitui um desafio atractivo pelas potenciais aplicações que dai podem emergir. De facto, já foram reportados dendrímeros peptídicos que modelam aspectos específicos de funções biológicas, tais como: modelos enzimáticos para catálise dirigida (“enzimas artificiais”); mimetização de co-factores naturais (de que e exemplo a vitamina B12); transportadores de fármacos, pois quando acopladas aos ligandos adequados estas moléculas tem a capacidade de aderir à membrana celular. É também importante referir que várias destas moléculas têm sido estudadas enquanto modelos de folding das proteínas naturais, pois investigações experimentais indiciam que alguns dendrímeros peptídicos podem apresentar, em solução, uma estrutura compacta semelhante à das proteínas globulares. Contudo, a maioria dos estudos experimentais realizados até à data são omissos no que concerne a informação estrutural, e carecem do enquadramento adequado a nível molecular e atómico. O único estudo teórico publicado sobre dendrímeros peptídicos parece confirmar a ideia de que, em solução estas moléculas apresentam, de facto, formas semelhantes a esferas, isto apesar de existirem evidências experimentais que sugerem a existência de estados conformacionais mais desordenados, nesses mesmos sistemas. Considerando o grande interesse que estas moléculas tem vindo a despertar, a verdade é que pouco se sabe sobre o seu arranjo estrutural tridimensional, e sobre os processos que a ele conduzem (folding). Nesta tese tentamos preencher algumas destas lacunas. Para tal, procedemos à caracterização de cinco dendrímeros peptídicos de terceira geração (que designamos por B1, B1H, B1HH, B1HHH e C1) com diferentes constituintes peptídicos. Os sistemas que escolhemos como objecto de estudo, estão directamente relacionados com a coordenação da aquocobalamina (análogo da vitamina B12) a dendrímeros peptídicos, ainda que apenas três deles tenham sido sintetizados e caracterizados experimentalmente (B1, B1H e C1). Deste modo, pretendemos não só investigar as suas preferências conformacionais, mas também inferir possíveis relações entre a sua estrutura e a capacidade para desempenhar uma função análoga à das moléculas biológicas (transcobalamina). É importante salientar que de entre os dendrímeros que foram sintetizados experimentalmente, e que são também aqui estudados, os que apresentam maior capacidade de coordenação com a aquacobalamina, são os que possuem um menor número de resíduos com potencial de coordenação. Este aparente paradoxo é por si só interessante e pode estar interligada com aspectos mais estruturais. Como temos por objectivo compreender as alterações e a variabilidade subjacentes às estruturas tridimensionais dos diferentes dendrímeros, empregamos metodologias adequadas ao detalhe da escala que pretendemos investigar. Nomeadamente, métodos computacionais de simulação molecular (MM/MD). Optámos portanto por simular cada um destes cinco sistemas através de múltiplas e longas simulações de dinâmica molecular, utilizando a água enquanto solvente explícito. Com efeito, no trabalho que conduziu a esta tese, realizamos simulações que contabilizam aproximadamente 1 μs-1 para cada um dos dendrímeros em estudo. No que respeita a estes sistemas, isto é muito superior ao tempo simulado em estudos anteriores. Nas últimas décadas a investigacao científica tem beneficiado imenso do avanço das técnicas de simulação computacional, que providenciam resultados e formas de escrutinar sistemas, que são de outra forma normalmente inacessíveis. A dinâmica molecular, especificamente, permite “seguir” a evolução temporal dos átomos que constituem um sistema, através da integração das equações de Newton para o movimento de corpos. É inclusive um dos métodos computacionais de eleição para estudar fenómenos biomoleculares. Os resultados obtidos com esta técnica de amostragem conformacional permitiram-nos analisar e identificar de forma adequada, os detalhes estruturais de cada um dos dendrímeros peptídicos. Colocamos especial ênfase nos arranjos estruturais mais estáveis. As conformações tridimensionais obtidas a partir das trajectórias resultantes das simulações, foram agrupadas de forma a obtermos os ensembles conformacionais característicos de cada dendrímero. Sobre estes conjuntos de conformações realizamos várias análises. Começamos por investigar algumas das propriedades que caracterizam estes sistemas, como o raio de giração, o número total de ligações de hidrogénio, a distância máxima entre os dois átomos mais afastados de cada estrutura, a superfície acessível ao solvente, entre outros. O raio de giração revelou ser a propriedade que individualmente, melhor espelha as variações intrínsecas a estes sistemas. Adicionalmente, procedemos também a caracterização da distribuição dos valores de phi-psi característicos dos diedros de cada um dos dendrímeros. Complementamos esta análise com o estudo das matrizes que reflectem as distãncias mínimas entre os resíduos de todas as conformações. Posteriormente aplicamos metodologias de análise conformacional que envolvem a determinação da energia livre, associada a diferentes coordenadas reaccionais (ou de folding) para cada estrutura nos diferentes ensembles, obtendo assim as correspondentes superfícies energéticas (folding landscapes). Utilizamos esta abordagem por forma a obter folding landscapes bi- e tridimensionais. Em especifíco, utilizamos como coordenadas de folding os valores do raio de giração, do root mean square deviation (RMSD), dos componentes principais do tensor do raio de giração diagonalizado, e os valores para a posição relativa das diferentes conformações, num espaço concordante com a matriz de RMSD, utilizando para tal o método de análise das coordenadas principais (PCoorA). Utilizando o tensor do raio de giração, foi possível investigar a forma dos arranjos estruturais de cada dendrímero peptídico, tendo inclusive sido definido um espaço tridimensional baseado nos componentes principais do tensor diagonalizado (espaço de giração). A capacidade de cada uma destas abordagens para discriminar de forma adequada o espaço das conformações dos dendrímeros peptídicos é discutida ao longo da tese. Dos diversos procedimentos de análise conformacional empregues, resulta uma clara indicação de que, em solução, os dendrímeros peptídicos podem apresentar dois comportamentos preferenciais distintos: estruturas compactas que privilegiam as interacções entre os diferentes resíduos, semelhantes a esferas (sphere-like); e estruturas “abertas” com as diferentes ramificações espaçadas, em que as interacções entre resíduos não adjacentes são minimizadas, semelhantes a taças (bowl-like). Ambas estas configurações atómicas consubstanciam a enorme flexibilidade estrutural que parece caracterizar estas moléculas, dando provas da miríade de estados conformacionais que lhes estão acessíveis. Foi ainda possível verificar a existência de evidências que suportam a ideia de que estas moléculas possuem uma grande robustez estrutural. Isto é, pequenas alterações na composição dos resíduos de amino-ácidos que as constituem não parecem desencadear alterações conformacionais significativas nos arranjos estruturais preferenciais. Através da comparação entre o coeficiente de difusao experimental disponível para um dos dendrímeros, e o coeficiente de difusão calculado com base nas trajectórias obtidas por simulação, foi possível verificar que os modelos utilizados, reflectem de forma adequada os sistemas experimentais. Concluiu-se também que o campo de força (force field) GROMOS 53A6 possui a capacidade de transferabilidade apropriada para lidar com estas moléculas. Os pontos fortes e fracos dos nossos modelos são discutidos ao longo da tese. Durante este trabalho foi ainda desenvolvida e implementada uma metodologia que permite o cálculo eficiente do RMSD entre estruturas dendríticas. As conclusões apresentadas nesta tese podem ser interpretadas juntamente com os resultados experimentais disponíveis, de forma a contribuir para uma compreensão sinérgica da relação entre a estrutura e a função dos dendrímeros peptídicos, lançando as fundações para aplicações inovadoras

Protein Structure

Since the dawn of recorded history, and probably even before, men and women have been grasping at the mechanisms by which they themselves exist. Only relatively recently, did this grasp yield anything of substance, and only within the last several decades did the proteins play a pivotal role in this existence. In this expose on the topic of protein structure some of the current issues in this scientific field are discussed. The aim is that a non-expert can gain some appreciation for the intricacies involved, and in the current state of affairs. The expert meanwhile, we hope, can gain a deeper understanding of the topic